Định danh và phân loại một số loài cá rạn san hô ở khánh hòa, việt nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Sử dụng trình tự gen 16S rRNA của DNA ty thể để kiểm chứng phân loại dựa vào hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá rạn san hô nghiên cứu.. Vùng biển Khán

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ Ở KHÁNH HÒA, VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

Giảng viên hướng dẫn : ThS Vũ Đặng Hạ Quyên

TS Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Lê Phan Khánh Hưng

Mã số sinh viên : 53130565

Khánh Hòa: 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH VÀ PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ RẠN SAN HÔ Ở KHÁNH HÒA, VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN

GVHD: ThS Vũ Đặng Hạ Quyên

TS Đặng Thúy Bình SVTH: Lê Phan Khánh Hưng

MSSV: 53130565

Khánh Hòa, tháng 06/2015

LỜI CẢM ƠN



Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ Đặng Hạ Quyên và TS Đặng Thúy Bình đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đồ án

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên ngành rất bổ ích cho em trong suốt quá trình học tập 4 năm qua

Em xin gửi lời cảm ơn đến Trung tâm Thí nghiệm Thực hành, trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cho em trong thời gian thực hiện đồ án

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, người thân và các anh chị, bạn bè đã quan tâm, động viên và hỗ trợ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này

Do thời gian và kiến thức còn hạn chế nên đồ án tốt nghiệp của em không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của quý thầy

cô giáo để đồ án được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 06 năm 2015

Sinh viên thực hiện

Lê Phan Khánh Hưng

TÓM TẮT

Trong số các hệ sinh thái biển thì hệ sinh thái rạn san hô được xem là hệ có tính

đa dạng và năng suất sinh học cao Rạn san hô là nơi cư trú cho các loài sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau, trong đó cá rạn là nhóm động vật xương sống có tính đa dạng loài cao nhất Ngoài giá trị kinh tế, cá rạn còn có vai trò quan trọng trong việc cân bằng

hệ sinh thái rạn san hô, một số loài cá rạn được xem như nhóm sinh vật chỉ thị cho hệ sinh thái rạn san hô Vùng biển Khánh Hòa được đánh giá có tầm quan trọng đặc biệt về đa dạng sinh học biển, là khu vực có sự đa dạng và phong phú nhất về thành phần loài các

họ cá rạn san hô trong vùng biển ven bờ Nam Trung Bộ Nghiên cứu hiện tại tập trung vào phân loại một số loài cá rạn san hô ở khu vực này Dựa vào đặc điểm hình thái, nghiên cứu phát hiện được 25 loài cá thuộc 22 giống, 15 họ, 5 bộ Sử dụng trình tự gen 16S rRNA của DNA ty thể để kiểm chứng phân loại dựa vào hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá rạn san hô nghiên cứu Cây phát sinh loài cho thấy sự đồng dạng của các loài cá nghiên cứu ở mức giống (Genus) và họ (Family), tuy nhiên chưa thể hiện được sự phân tách di truyền ở mức bộ (Order) Dữ liệu này có thể được sử dụng như nguồn dữ liệu đầu vào cho các nghiên cứu đa dạng sinh học và quản lý nguồn lợi hải sản tỉnh Khánh Hòa

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH HÌNH VẼ vi

DANH SÁCH BẢNG BIỂU viii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu 4

1.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá rạn san hô trong và ngoài nước 5

1.3 Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong nghiên cứu đa dạng sinh học cá 9

1.3.1 Hệ gen ty thể (mitochondrial DNA – mtDNA) 9

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch trong nghiên cứu đa dạng sinh học cá 12

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu 15

2.2 Sơ đồ nghiên cứu 16

2.3 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái 16

2.4 Nghiên cứu di truyền cá rạn san hô 19

2.4.1 Tách chiết DNA, nhân gen bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự 19

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại 21

CHƯƠNG 3 –KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Phân loại hình thái 24

3.1.1 Thành phần loài các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 24 3.1.2 Đặc điểm hình thái các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 28 3.2 Nghiên cứu di truyền các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 69 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số 69

3.2.2 Khuếch đại, giải trình tự DNA cá rạn san hô thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 70

3.2.3 So sánh sự khác biệt trình tự giữa các loài cá nghiên cứu 71

3.2.4 So sánh sự tương đồng trình tự với Genbank 73

3.2.5 Xây dựng cây phát sinh loài cá rạn san hô thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 74

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80

4.1 Kết luận 80

4.2 Kiến nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

PHỤ LỤC 93

DANH SÁCH HÌNH VẼ

Hình 1.1 – DNA ty thể người, bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 13 mRNA, 2 rRNA và 22 tRNA Mũi tên chỉ vùng gen (16S mtDNA) được sử dụng trong nghiên

cứu hiện tại 10

Hình 2.1 – Các địa điểm thu mẫu cá trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa 15

Hình 2.2 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16

Hình 2.3 – Một số bộ phận của bộ cá xương 17

Hình 2.4 – Các chỉ số đo trong phân loại cá 18

Hình 2.5 – Các chỉ số đếm trong phân loại cá 19

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 16S mtDNA 20

Hình 3.1a – Hình thái Synodus variegatus 28

Hình 3.1b – Đặc điểm hình thái Synodus variegatus 29

Hình 3.2a – Hình thái Fistularia commersonii 30

Hình 3.2b – Đặc điểm hình thái Fistularia commersonii 30

Hình 3.3a – Hình thái Myripristis berndti 31

Hình 3.3b – Đặc điểm hình thái Myripristis berndti 32

Hình 3.4a – Hình thái Rhinecanthus aculeatus 33

Hình 3.4b – Đặc điểm hình thái Rhinecanthus aculeatus 34

Hình 3.5a – Hình thái Labracinus cyclophthalmus 35

Hình 3.5b – Đặc điểm hình thái Labracinus cyclophthalmus 35

Hình 3.6a – Hình thái Parupeneus multifasciatus 36

Hình 3.6b – Đặc điểm hình thái Parupeneus multifasciatus 37

Hình 3.7a – Hình thái Upeneus tragula 38

Hình 3.7b – Đặc điểm hình thái Upeneus tragula 39

Hình 3.8a – Hình thái Parapercis clathrata 40

Hình 3.8b – Đặc điểm hình thái Parapercis clathrata 40

Hình 3.9a – Hình thái Ctenochaetus striatus 41

Hình 3.9b – Đặc điểm hình thái Ctenochaetus striatus 42

Hình 3.10a – Hình thái Lutjanus russellii 43

Hình 3.10b – Đặc điểm hình thái Lutjanus russellii 44

Hình 3.11a – Hình thái Lethrinus nebulosus 45

Hình 3.11b – Đặc điểm hình thái Lethrinus nebulosus 46

Hình 3.12a – Hình thái Scarus ghobban 47

Hình 3.12b – Đặc điểm hình thái Scarus ghobban 47

Hình 3.13a – Hình thái Scolopsis ciliatus 48

Hình 3.13b – Đặc điểm hình thái Scolopsis ciliatus 49

Hình 3.14a – Hình thái Iniistius pavo 50

Hình 3.14b – Đặc điểm hình thái Iniistius pavo 51

Hình 3.15a – Hình thái Cheilinus oxycephalus 52

Hình 3.15b – Đặc điểm hình thái Cheilinus oxycephalus 52

Hình 3.16a – Hình thái Cheilinus fasciatus 53

Hình 3.16b – Đặc điểm hình thái Cheilinus fasciatus 54

Hình 3.17a – Hình thái Oxycheilinus digramma 55

Hình 3.17b – Đặc điểm hình thái Oxycheilinus digramma 55

Hình 3.18a – Hình thái Thalassoma lunare 56

Hình 3.18b – Đặc điểm hình thái Thalassoma lunare 57

Hình 3.19a – Hình thái Halichoeres melanochir 58

Hình 3.19b – Đặc điểm hình thái Halichoeres melanochir 58

Hình 3.20a – Hình thái Halichoeres hortulanus 59

Hình 3.20b – Đặc điểm hình thái Halichoeres hortulanus 60

Hình 3.21a – Hình thái Epinephelus merra 61

Hình 3.21b – Đặc điểm hình thái Epinephelus merra 62

Hình 3.22a – Hình thái Epinephelus fasciatus 63

Hình 3.22b – Đặc điểm hình thái Epinephelus fasciatus 63

Hình 3.23a – Hình thái Cephalopholis boenak 64

Hình 3.23b – Đặc điểm hình thái Cephalopholis boenak 65

Hình 3.24a – Hình thái Diploprion bifasciatum 66

Hình 3.24b – Đặc điểm hình thái Diploprion bifasciatum 67

Hình 3.25a – Hình thái Plectropomus leopardus 68

Hình 3.25b – Đặc điểm hình thái Plectropomus leopardus 69

Hình 3.26 – Kết quả điện di DNA tổng số một số mẫu cá rạn san hô 70

Hình 3.27 – Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA của một số mẫu cá rạn san hô 70

Hình 3.28 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor – Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen 16S mtDNA của các loài cá rạn san hô thu tại tỉnh Khánh Hòa,Việt Nam 75

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá rạn san hô 21Bảng 3.1 – Danh sách các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam 24Bảng 3.2 – Chỉ tiêu hình thái của các loài cá rạn san hô tiến hành phân loại được ở Khánh Hòa 26Bảng 3.3 – Sự khác biệt về trình tự 16S mt DNA của 25 loài cá rạn san hô thu được ở Khánh Hòa, Việt Nam 72Bảng 3.4 – Kết quả độ tương đồng của các trình tự 16S mtDNA từ 25 loài cá rạn san

hô thu tại Khánh Hòa, Việt Nam với dữ liệu từ Genbank 73

MỞ ĐẦU

Vùng biển Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có diện tích khoảng 1.000.000 km2, bao bọc bờ phía đông phần đất liền từ Móng Cái (tỉnh Quảng Ninh) đến Hà Tiên (tỉnh Kiên Giang) với chiều dài trên 3.260 km Trong vùng biển có khoảng 3.000 đảo lớn nhỏ nằm rải rác dọc ven bờ và hình thành các quần đảo lớn như

Hạ Long – Cát Bà ở phía tây bắc vịnh Bắc Bộ, quần đảo Trường Sa và Hoàng Sa ở ngoài khơi Biển Đông Cùng với sự tồn tại của đảo là các rạn san hô bao quanh đảo với thành phần loài phong phú và cấu trúc đa dạng, đã hình thành nên hệ sinh thái rạn san hô (Nguyễn Nhật Thi và ctv, 2005)

Trong số các hệ sinh thái biển thì hệ sinh thái rạn san hô được xem là hệ có tính

đa dạng và năng suất sinh học cao (Connell, 1978) Rạn san hô là nơi cư trú cho các loài sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau, trong đó cá rạn là nhóm động vật xương sống có tính đa dạng loài cao nhất với 4.000 loài (Spalding và ctv, 2001) Cá rạn san

hô được hiểu là nhóm cá có đời sống gắn liền với các sinh cảnh của rạn hoặc một phần trong vòng đời có đời sống liên quan tới rạn san hô (Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân, 2005)

Mặc dù hệ sinh thái rạn san hô chỉ chiếm diện tích nhỏ so với đại dương (khoảng 600.000 km2), nhưng hàng năm chúng đã cung cấp khoảng 10% sản lượng cá được khai thác trên toàn thế giới (Spalding và ctv, 2001) Ở Việt Nam, nguồn lợi cá khai thác từ các rạn san hô ven bờ và quanh các đảo có san hô phân bố đã cung cấp nguồn thực phẩm đáng kể cho nhu cầu sử dụng trong nước và xuất khẩu Một số trung tâm khai thác cá rạn ở nước ta tập trung ở các vùng rạn san hô thuộc Cô Tô, Cát Bà, Bạch Long Vĩ, Sơn Trà, vịnh Nha Trang, Phú Quốc, Côn Đảo…

Ngoài giá trị kinh tế, cá rạn còn có vai trò quan trọng trong việc cân bằng hệ sinh thái rạn san hô thông qua việc tham gia vào chuỗi thức ăn Chức năng quan trọng của chúng là hấp thụ và phân hủy các chất hữu cơ, kiểm soát sự phát triển của rong, tảo (Sale, 1997) Một số loài cá rạn rất nhạy cảm với sự thay đổi của các yếu tố môi trường, chúng được xem như nhóm sinh vật chỉ thị cho hệ sinh thái rạn san hô (Hourigan và ctv, 1988) Hiện nay, cùng với sự gia tăng tốc độ dân số ngày càng nhanh, nhu cầu phát triển kinh tế – xã hội và đời sống ngày càng cao, các hoạt động khai thác hải sản ngày càng

được đẩy mạnh, đặc biệt là khai thác nguồn lợi hải sản trong các rạn san hô Việc sử dụng các hình thức đánh bắt mang tính hủy diệt (dùng chất nổ, chất độc, xung điện…) được sử dụng khá phổ biến đã làm cho nguồn lợi hải sản nói chung và cá rạn nói riêng

bị giảm sút nghiêm trọng (Lại Duy Phương, 2008) Theo nhiều kết quả nghiên cứu, sự suy giảm của các vùng rạn san hô đã kéo theo sự suy giảm đáng kể về mức độ phong phú của quần xã cá rạn, thậm chí dẫn đến nguy cơ biến mất của một số nhóm loài trú

ẩn ở rạn san hô (Booth và Beretta, 2002) Điều này có liên quan một phần tới sự thiếu các thông tin cần thiết về hiện trạng và khả năng khai thác nguồn lợi cá rạn của người dân cũng như những người làm công tác quản lý nguồn lợi

Nhiều nghiên cứu về đa dạng sinh học các loài cá rạn san hô ở Việt Nam đã được tiến hành với phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái (Orsi, 1974; Nguyễn Hữu Phụng và Nguyễn Văn Long, 1994; Nguyễn Hữu Phụng, 1998; Đỗ Văn Khương

và ctv, 2005; Lại Duy Phương, 2008…) Vùng biển Khánh Hòa với đặc trưng các hệ sinh thái rạn san hô ven bờ cũng là nơi được tiến hành nhiều cuộc khảo sát về đa dạng thành phần loài cá rạn san hô, có thể kể đến các nghiên cứu của Nguyễn Hữu Phụng và Bùi Thế Phiệt (1986), Nguyễn Hữu Phụng (1989), Nguyễn Nhật Thi (1997), Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân (2004)… Tuy nhiên, sự thay đổi về đặc điểm hình thái của các loài cá tùy theo môi trường rạn san hô nơi chúng sinh sống và các biến dị cá thể có thể gây nhầm lẫn cho công tác phân loại theo phương pháp này Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến quần xã cá rạn san hô, nhưng cho đến nay chưa có nghiên cứu nào được công bố về dữ liệu di truyền của cá rạn san hô ở vùng biển Việt Nam nói chung và vùng biển Khánh Hòa nói riêng

Trước những thực trạng nêu trên, nhận thấy việc định danh, phân loại, thu thập

bổ sung tư liệu về đối tượng cá rạn san hô là cần thiết, đề tài “Định danh và phân loại một số loài cá rạn san hô ở Khánh Hòa, Việt Nam dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được thực hiện nhằm cung cấp dẫn liệu về hình thái và di truyền của một số

loài cá rạn san hô ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa Đây là những dẫn liệu đầu vào về đa dạng loài, hệ thống phân loại và đặc điểm hình thái, di truyền của khu hệ cá rạn san hô tỉnh Khánh Hòa, làm cơ sở cho công tác bảo tồn và quản lý nguồn lợi hải sản

Mục tiêu của đề tài

Định danh và phân loại một số loài cá rạn san hô phổ biến ở vùng biển Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các loài cá rạn san hô được thu tại các các thành phố Nha Trang và Cam Ranh, tỉnh Khánh Hòa từ tháng 10/2014 đến tháng 4/2015

Nội dung nghiên cứu

- Thu mẫu cá rạn san hô ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa

- Định danh các loài cá rạn san hô dựa vào đặc điểm hình thái

- Xây dựng cây phát sinh loài của những loài cá rạn san hô phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa dựa trên chỉ thị phân tử 16S của DNA ty thể

Ý nghĩa của đề tài

Nghiên cứu cung cấp dữ liệu về đa dạng sinh học của một số loài cá rạn san hô phân

bố ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa Các dữ liệu có thể được sử dụng cho những nghiên cứu đa dạng sinh học và góp phần ứng dụng cho việc quản lý, bảo tồn, phát triển nguồn lợi nhóm

cá rạn san hô

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu

Tỉnh Khánh Hòa nằm ở khu vực duyên hải Nam Trung Bộ Phía Bắc giáp tỉnh Phú Yên, phía Nam giáp tỉnh Ninh Thuận, phía Tây giáp hai tỉnh Đắk Lắk và Lâm Đồng, phía Đông giáp biển Đông Trên bản đồ Việt Nam, Khánh Hòa nằm ở tọa độ địa

lý từ 11o42’50’’ đến 12o52’15’’ vĩ độ Bắc và từ 108o40’33’’ đến 109o27’55’’ kinh độ Đông Diện tích tự nhiên của tỉnh Khánh Hòa cả trên đất liền cùng với hơn 200 đảo và quần đảo là 5197 km2 (Sở Kế hoạch và Đầu tư tỉnh Khánh Hòa, 2014)

Bờ biển tỉnh Khánh Hòa kéo dài từ mũi Đại Lãnh tới cuối vịnh Cam Ranh, có độ dài khoảng 385 km với nhiều cửa lạch, đầm, vịnh, cùng khoảng 200 đảo lớn, nhỏ ven

bờ Trong đó, quần đảo Trường Sa là nơi có vị trí quan trọng về an ninh quốc phòng và kinh tế của cả nước (Sở Kế Hoạch và Đầu tư tỉnh Khánh Hòa, 2014)

Sông ngòi ở Khánh Hòa nhìn chung ngắn và dốc, cả tỉnh có khoảng 40 con sông dài từ 10 km trở lên, tạo thành mạng lưới phân bố khá dày Trong đó, hai dòng sông chính là sông Cái (Nha Trang) và sông Dinh (Ninh Hòa) Các vịnh và đầm phá phân

bố liên tục và dọc theo đường bờ biển: Vũng Rô – Đại Lãnh, Vũng Bến Gỏi – Vịnh Vân Phong, Vịnh Bình Cang, Đầm Nha Phu và Đầm Thủy Triều – Vịnh Cam Ranh

Hệ thống vịnh góp phần vào đặc trưng về địa mạo, trầm tích cũng như các yếu tố thủy động lực làm cho Khánh Hòa đa dạng và phong phú về nguồn lợi sinh vật Với 7 bán đảo lớn và trên 200 đảo nhỏ tạo thành nhiều đầm, vịnh kín gió tạo điều kiện cho các đàn cá di cư đến sinh sản Ven bờ có nhiều rạn san hô là nơi có đa dạng hải sản sinh sống với giá trị kinh tế cao (Nguyễn Tuấn, 2007) Các rạn san hô là các hệ sinh thái tự nhiên có năng suất sinh học sơ cấp cao, tạo cơ sở dinh dưỡng hữu cơ phong phú, cung cấp thức ăn không chỉ cho chính bản thân sinh vật sống trong rạn mà còn có ý nghĩa đối với toàn vùng biển xung quanh (Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân, 2005), đồng thời là nơi trú ẩn của các loài cá nhỏ và các loài cá khác trong mùa sinh sản Khánh Hòa nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa Nhiệt độ trung bình năm của khu vực là 26,5oC; cao nhất vào tháng 6 đến tháng 8 (Nguyễn Hữu Hồ và ctv, 2003) Độ ẩm trung bình khoảng 80,5% Khí hậu chia thành hai mùa rõ rệt: mùa mưa ngắn, từ khoảng tháng 9 – 12, lượng mưa chiếm khoảng 80% tổng lượng mưa cả năm;

mùa khô từ tháng 1 đến tháng 8 (Nguyễn Hữu Hồ và ctv, 2003) Có thể nói, các yếu tố khí hậu đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và đa dạng của sinh vật nơi đây, đặc biệt là các loài hải sản

Vùng biển Khánh Hòa được đánh giá là một vùng biển có tầm quan trọng đặc biệt

về đa dạng sinh học biển, nơi tập trung của các bãi cá ven bờ, các bãi ương nuôi ấu trùng hải sản cung cấp nguồn giống cho các rạn san hô ven bờ Việt Nam (Wilkinson và Clive, 2000) Tuy vậy đây cũng là khu vực đang chịu tác động mạnh từ các hoạt động của con người dẫn tới sự suy giảm các hệ sinh thái đặc trưng và nguồn lợi tự nhiên Năm 2002, khu bảo tồn biển vịnh Nha Trang chính thức được đưa vào hoạt động và được xây dựng

là mô hình điểm trình diễn khu bảo tồn Quốc gia nhằm nhân rộng ra các khu bảo tồn khác trong hệ thống các khu bảo tồn biển của Việt Nam

1.2 Tổng quan về tình hình nghiên cứu đa dạng sinh học cá rạn san hô trong và ngoài nước

 Ngoài nước:

Trên thế giới, nghiên cứu về phân loại học nhóm cá rạn san hô được bắt đầu từ khá lâu, khởi đầu là công trình nghiên cứu của Darwin năm 1842 (Sale, 1991) Ông đã mô tả khá chi tiết về đặc điểm hình thái của các loài cá sống trong vùng rạn san hô ở biển Ấn

Độ Dương và Thái Bình Dương

Trên cơ sở kế thừa nguyên lý và phương pháp phân loại học của Darwin, nhiều tác giả đã phát triển phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái so sánh, kết hợp với đặc điểm giải phẫu bên trong và bên ngoài để xây dựng các khóa phân loại cá rạn ngày càng hoàn thiện hơn, phục vụ phát triển nghiên cứu cá rạn san hô trên thế giới Một số công trình nghiên cứu và tài liệu tiêu biểu về phân loại nhóm cá rạn như công trình nghiên cứu của Humann và ctv (1993) về đa dạng sinh học cá rạn san hô ở quần đảo Galapagos, Lieske và Myers (2001) đã mô tả 2.118 loài cá rạn san hô ở vùng biển Caribbean, Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương, Nakabo (2002) báo cáo 3.863 loài cá thuộc 352 họ ở vùng biển Nhật Bản, đồng thời cung cấp đặc điểm phân bố, tập tính dinh dưỡng, kích thước và chu kỳ sống của chúng

Những nghiên cứu về sự phân bố quần xã cá rạn san hô ở từng khu vực cho thấy

sự đa dạng thành phần loài Trong đó, sự phân bố tập trung chủ yếu ở vùng Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương với khoảng trên 92% tổng số loài (tương đương khoảng 3.700 loài),

vùng Micronesia xác định được 1.407 loài thuộc 451 giống và 120 họ (Myers, 1991), khu vực rạn san hô thuộc vùng biển Great Barrier Reef và vùng biển Coral Sea của Australia xác định được 1.111 loài thuộc 367 giống và 113 họ (Randall và ctv, 1997) Đối với vùng biển thuộc khu vực Đông Nam Á, các kết quả nghiên cứu cho thấy: vùng biển Indonesia và vùng nước lân cận phát hiện 1.029 loài thuộc 268 giống và 63 họ (Kuiter, 1992), vịnh Thái Lan có 357 loài thuộc 61 họ (Satapoomin, 2000)

Dựa trên cơ sở khoa học phân loại theo đặc điểm hình thái, Spalding và ctv (2001) tổng hợp và thống kê được tổng số hơn 4.000 loài thuộc 179 họ cá rạn san hô

đã được phân loại trên thế giới Trong đó, các họ có số lượng loài cao là họ cá bàng chài (Labridae) có khoảng 500 loài thuộc 60 giống, họ cá kẽm (Haemulidae) có 150 loài, 19 giống, họ cá thia (Pomacentridae) và họ cá bướm (Chaetodontidae) mỗi họ có

127 loài thuộc 11 giống, họ cá hồng (Lutjanidae) có 100 loài thuộc 16 giống, họ cá mó (Scaridae) có 90 loài thuộc 10 giống…

Allen và ctv (2005) mô tả 2000 loài thuộc 108 họ trong sách ảnh về các loài cá rạn san hô ở khu vực Thái Bình Dương Nghiên cứu cung cấp hình ảnh giai đoạn cá con và cá trưởng thành, thông tin về kích thước, đặc điểm sinh học và địa điểm phân

bố của chúng

Parenti và Randall (2010) thành lập danh mục gồm 504 loài cá bàng chài (Labridae) thuộc 70 giống và 99 loài cá mó (Scaridae) thuộc 10 giống đã được phân loại trên thế giới

Trung tâm Nghề cá thế giới (ICLARM) cùng với Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp thế giới (FAO) đã lập ra trang web FishBase (http://fishbase.us/) cập nhật thông tin của 33.074 loài cá trên thế giới và phân bố của chúng Tính đến tháng 2/2015, FishBase đã cập nhật 15.060 loài cá biển, cung cấp các thông tin về phân loại, đặc điểm phân bố, tập tính dinh dưỡng, kích thước, chu kỳ sống và nguy cơ bị đe dọa của chúng

(Scorpaenidae), Chevey (1931 – 1939) nghiên cứu về hình thái và đặc điểm sinh học của một số loài cá chình thuộc bộ Anguilliformes Các kết quả nghiên cứu này đã cung cấp thông tin cho công tác nghiên cứu ngư loại ở Việt Nam Tuy nhiên, hoạt động điều tra, nghiên cứu biển một cách có hệ thống về sinh vật biển nói chung và cá biển nói riêng chỉ có từ khi thành lập Viện Hải dương học ở Nha Trang vào năm 1992 (Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân, 2005)

Khi tổng hợp các kết quả từ những công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật biển

từ năm 1929 – 1930, Krempf (1930) đã thống kê danh mục gồm 961 loài cá biển thuộc

457 giống, 162 họ, 28 bộ, trong đó có khoảng 400 loài cá rạn san hô Năm 1974, Orsi

đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu từ chương trình khảo sát miền Duyên hải nam Việt Nam (1968 – 1971) và thành lập Danh mục cá biển và cá nước ngọt Việt Nam bao gồm 1458 loài thuộc 173 họ

Từ những năm 1975 trở lại đây, công tác nghiên cứu về nhóm cá rạn được quan tâm nhiều hơn Các nghiên cứu trong giai đoạn này được triển khai trên quy mô rộng

và không chỉ dừng lại ở việc xác định cấu trúc thành phần loài, phân bố mà còn tiến xa hơn trong các lĩnh vực đánh giá nguồn lợi, trữ lượng và khả năng khai thác cho phép ở những vùng biển có rạn san hô phân bố Trong giai đoạn này, một số tổ chức và các nhà khoa học cũng đã quan tâm đến việc xây dựng các khóa phân loại, danh mục thành phần loài cho riêng nhóm cá rạn Tiêu biểu như công trình của Nguyễn Hữu Phụng và Bùi Thế Phiệt (1987) khi nghiên cứu về khu hệ cá rạn san hô vùng biển Nam Yết, Sơn

Ca (Trường Sa) đã xác định được danh mục gồm 43 loài thuộc 21 giống, 15 họ, 9 bộ Đến năm 1989, từ kết quả của các chuyến khảo sát thuộc chương trình biển 48 ở các đảo Song Tử Tây, Phan Vinh, Trường Sa và các rạn đá ngầm Đá Nam, Tốc Tan, Vũng Mây… Nguyễn Hữu Phụng (1991) đã phân tích xác định được 147 loài thuộc 67 giống, 37 họ cá biển

Sau khi chương trình Biển Đông – Hải đảo được triển khai, Nguyễn Nhật Thi (1997) đã tổng hợp danh mục của 414 loài thuộc 138 giống, 46 họ cá rạn phân bố ở các rạn san hô ven quần đảo Trường Sa, đây có thể được coi là danh sách đầy đủ nhất

về cá rạn san hô vùng biển quần đảo Trường Sa

Năm 1998, tổng hợp kết quả các đợt khảo sát vùng biển ven bờ Quảng Ninh – Hải Phòng (1994 – 1997) của Phân viện Hải dương học tại Hải Phòng, Nguyễn Nhật

Thi đã xác định thành phần cá rạn san hô trong vùng biển này bao gồm 364 loài thuộc

211 giống, 90 họ, 21 bộ

Năm 2000, Viện Nghiên cứu Hải sản hợp tác với Bảo tàng tự nhiên Tokyo (Nhật Bản) khảo sát vùng vịnh Nha Trang Phân tích các kết quả thu được, Nguyễn Văn Quân và các chuyên gia Nhật Bản đã xác định 385 loài cá rạn san hô thuộc 182 giống,

60 họ Năm 2001, dựa trên kết quả khảo sát xung quanh các đảo Hòn Mun, Hòn Đụn, Hòn Hố, Hòn Miếu và Bích Đầm (tỉnh Khánh Hòa); Nguyễn Hữu Phụng và ctv đã xác định được 348 loài thuộc 146 giống, 58 họ ,15 bộ cá rạn san hô ở vịnh Nha Trang Tổng hợp, phân tích toàn bộ các kết quả nghiên cứu liên quan đến nhóm cá rạn san hô phân bố ở vùng biển Việt Nam từ năm 1987 – 2001, Nguyễn Hữu Phụng (2002)

đã thống kê được danh mục gồm 672 loài thuộc 204 giống, 65 họ

Trong 2 năm 2003 – 2004, Viện Nghiên cứu Hải sản phối hợp với Phân viện Hải dương học tại Hải Phòng tiến hành khảo sát vùng biển Vườn quốc gia Cát Bà và Cô

Tô thu thập dữ liệu về cá rạn san hô, kết quả phân tích đã xác định được 188 loài thuộc

101 giống, 51 họ

Năm 2004, tổng hợp tư liệu từ các công trình nghiên cứu về cá rạn san hô, Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân (2004) đã thống kê danh mục cá rạn san hô vùng biển Trường Sa bao gồm 524 loài thuộc 192 giống, 59 họ Năm 2005, dựa trên kết quả phân tích và tổng hợp tất cả các điều tra khảo sát và nghiên cứu đã có, Nguyễn Nhật Thi và Nguyễn Văn Quân (2005) đã xuất bản cuốn sách “Đa dạng sinh học và giá trị nguồn lợi cá rạn san hô biển Việt Nam”, tài liệu này công bố danh mục 1.206 loài cá rạn san hô biển Việt Nam, thuộc 451 giống, 118 họ Trong tổng số 1.206 loài được phát hiện, có 779 loài thuộc các họ cá rạn san hô tiêu biểu

Trên cơ sở các tư liệu thu được từ các chuyến khảo sát thực địa trong các năm

2002 – 2006, Nguyễn Văn Quân (2009) đã xác định được khu hệ cá rạn san hô vùng biển khu bảo tồn vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa có 420 loài, 198 giống thuộc 77 họ

23 loài đã được ghi nhận là loài mới bổ sung cho Danh mục cá biển Việt Nam, 128 loài

bổ sung cho danh mục cá rạn san hô biển vịnh Nha Trang của các tác giả đã nghiên cứu trước đây Khu hệ cá vùng biển nghiên cứu có tính chất đặc trưng của khu hệ cá rạn san

hô biển nhiệt đới điển hình với sự đa dạng cao trong thành phần loài của các họ cá rạn san hô tiêu biểu Các họ có số lượng loài cao nhất là họ cá thia (Pomacentridae) với 44

loài, tiếp đó là họ cá bàng chài (Labridae) với 38 loài, họ cá bướm (Chaetodontidae) với

30 loài, cá mó (Scaridae) và cá sơn (Apogonidae) mỗi họ có 23 loài

Nguyễn Văn Long (2009) tiến hành nghiên cứu cá rạn san hô vùng biển ven bờ Nam Trung Bộ tại 42 điểm rạn đại diện thuộc 4 khu vực trọng yếu gồm vịnh Vân Phong, vịnh Nha Trang, ven bờ Ninh Hải – Ninh Thuận và vịnh Cà Ná từ năm 2005 –

2007, đồng thời kết hợp với việc thống kê các tư liệu về thành phần loài của một số nghiên cứu trước đây Kết quả phân tích đã xác định được 578 loài thuộc 180 giống và

40 họ cá rạn san hô phân bố trong vùng biển ven bờ Nam Trung Bộ Các phân tích và so sánh cho phép nhận định rằng khu hệ cá rạn san hô vùng biển Nam Trung Bộ thuộc loại

đa dạng nhất so với các vùng biển ven bờ Việt Nam (Vịnh Bắc Bộ, biển Đông Nam và biển Tây Nam) Trong vùng biển ven bờ Nam Trung Bộ, khu vực vịnh Nha Trang có sự

đa dạng và phong phú nhất về thành phần loài của phần lớn các họ cá rạn san hô

Điểm qua các hoạt động điều tra nghiên cứu cá rạn san hô ở biển Việt Nam cho thấy hầu hết các cụm đảo và quần đảo quan trọng đều đã được khảo sát Tuy nhiên, các

số liệu điều tra này chủ yếu được thống kê dựa trên phân loại theo đặc điểm hình thái nên có thể dẫn đến sự nhầm lẫn trong định danh chính xác đến loài Mặt khác, các nghiên cứu này phần lớn tập trung vào việc thống kê thành phần loài, chưa có nghiên cứu nào xây dựng cơ sở dữ liệu về hình thái và di truyền của các loài cá rạn san hô

1.3 Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong nghiên cứu đa dạng sinh học cá

1.3.1 Hệ gen ty thể (mitochondrial DNA – mtDNA)

Hệ gen của một sinh vật chứa toàn bộ thông tin di truyền và các chương trình cần thiết cho cơ thể hoạt động Ở các sinh vật nhân chuẩn (eukaryote), 99% hệ gen nằm trong nhân tế bào (hệ gen nhân – nuclear DNA), phần còn lại nằm trong một số cơ quan như ty thể và lạp thể (hệ gen ty thể - mitochondrial DNA và hệ gen lạp thể -

chloroplast DNA)

Ty thể là những cấu trúc bên trong tế bào có nhiệm vụ chuyển đổi năng lượng từ các vật chất hữu cơ thành dạng mà các tế bào có thể sử dụng được (Genetics Home Reference, 2014) Mặc dù hầu hết DNA của cơ thể đều nằm trên các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, ty thể cũng có một lượng DNA của riêng mình DNA ty thể (mtDNA) là một hệ gen độc lập có kích thước nhỏ (15 – 20 kb), cấu trúc mạch vòng nằm trong ty thể, bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 13 mRNA, 2 rRNA và 22

tRNA (Wolstenholme, 1992) Các mRNA chủ yếu mã hóa cho các protein tham gia vào việc vận chuyển điện tử và phosphoryl oxy hóa của ty thể

Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Human_mitochondrial_genetictv Hình 1.1 – DNA ty thể người, bao gồm 37 gen mã hóa đặc trưng cho 13 mRNA, 2 rRNA

và 22 tRNA Mũi tên chỉ vùng gen (16S mtDNA) được sử dụng trong nghiên cứu hiện tại

DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau: số lượng bản sao lớn (Taylor và Turnbull, 2005), vùng mã hóa lớn, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ (Saccone

và ctv, 1999) DNA nhân được di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nhân nào đó trở nên rất khó khăn Trong khi đó, DNA ty thể di truyền theo dòng mẹ, có nghĩa là mỗi phân

tử cũng như toàn bộ DNA ty thể thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ

(Hebert và ctv, 2003a ; Neigel và ctv, 2007 ; Swartz và ctv, 2008) Sự tái tổ hợp trên

DNA ty thể thường không xảy ra, nên sẽ không hình thành các đoạn DNA tái tổ hợp (Krishnamurthy và Francis, 2012) DNA ty thể tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào, một tế bào chứa vài trăm ty thể, mỗi ty thể chứa hàng chục bản sao bộ gen của nó, vì vậy trong một tế bào có thể chứa được hàng nghìn bản sao của bộ gen ty thể Điều này khiến cho việc tách chiết DNA ti thể rất dễ dàng ngay cả với một lượng mẫu nhỏ Ở DNA nhân, vùng không mã hóa chiếm tới 93%; trong khi ở DNA ty thể, vùng không mã hóa chỉ chiếm 3% (Taylor và Turnbull, 2005) Các vùng không mã hóa này sẽ

làm cho quá trình giải trình tự thêm phức tạp vì đôi khi cần phải tạo dòng để thu được

đoạn gen mong muốn (Tauz và ctv, 2003; Schander và Willassen, 2005) Với những đặc

điểm trên cùng với việc DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân trong quá trình tách chiết

do có cấu trúc dạng vòng (Ingman và Gyllensten, 2003), DNA ty thể được ưu tiên sử dụng làm chỉ thị phân tử trong kỹ thuật di truyền mã vạch để xác định sự đa dạng sinh học, phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến động di truyền trong loài và giữa các loài sinh vật

DNA ty thể cung cấp một công cụ đắc lực trong việc định danh loài, đánh giá mối quan hệ giữa các loài với nhau và cung cấp dữ liệu di truyền phục vụ cho công tác bảo tồn các loài đang bị đe dọa và có nguy cơ tuyệt chủng (Rubinoff, 2006) Trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen cytochrome c oxidase subunit 1 (COI) của DNA ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột khoang Cnidaria (Herbert và ctv, 2004) Đoạn gen này đã được đề nghị sử dụng như một mã vạch DNA (DNA barcoding) để nghiên cứu

sự đa dạng sinh học của giới sinh vật (Hebert và ctv, 2003a) Việc sử dụng DNA ty thể

để xác định loài được đánh giá là có tỷ lệ thất bại tương đối nhỏ, dưới 5% (Waugh, 2007) Hebert và ctv (2003) công bố tỷ lệ thành công 100% khi ứng dụng DNA ty thể trong nghiên cứu xác định các loài bướm Hubert và ctv (2008) báo cáo tỷ lệ thành công 93% trong nghiên cứu xác định các loài cá nước ngọt ở Canada Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và ctv, 2008) Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể trong nghiên cứu di truyền cũng có một số giới hạn Kích thước của DNA ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền Tỷ lệ đột biến ở DNA ty thể cao hơn DNA nhân (Brown và ctv, 1979), trong khi đó kích thước DNA ty thể lại nhỏ, nên đột biến có thể dễ dàng xảy ra mà không phản ánh được mối quan hệ phát sinh loài hay lịch sử tiến hóa Hơn nữa, việc không tuân theo quy luật di truyền của Mendel không phù hợp với nhiều nghiên cứu di truyền (Wong, 2011) Vì vậy người ta đề nghị nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử để có kết quả với độ chính xác cao (Hebert và ctv, 2004) Trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, DNA nhân với tỉ lệ đột biến thấp thường được sử dụng như marker để kết hợp với

marker DNA ti thể, việc kết hợp này trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và ctv, 2005)

1.3.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền mã vạch trong nghiên cứu đa dạng sinh học cá

Phương pháp phân loại các loài dựa trên đặc điểm hình thái là phương pháp quan sát trực tiếp những đặc điểm bên ngoài của loài cần xác định như cấu tạo, hình dáng, màu sắc cơ thể; sau đó tiến hành đo và đếm các chỉ tiêu phân loại; so sánh với các dữ liệu phân loại liên quan để rút ra kết luận phân loại (Vũ Trung Tạng và Nguyễn Đình Mão, 2005) Phương pháp này có nhiều thuận lợi vì các dấu hiệu dễ dàng nhìn thấy, thao tác đơn giản, nhanh chóng và dễ thực hiện Tuy nhiên phân loại dựa trên hình thái đôi khi có thể gây nhầm lẫn và dẫn đến kết quả không chính xác, đặc biệt là đối với các loài có quan hệ gần gũi do chúng có nhiều đặc điểm hình thái tương tự nhau Vì vậy, việc sử dụng kỹ thuật di truyền để định danh loài và xác định chính xác mối quan

hệ phát sinh chủng loại là điều rất cần thiết để tăng độ tin cậy của quá trình phân loại

Kỹ thuật di truyền mã vạch (DNA barcoding) là kỹ thuật phân tích một đoạn ngắn của hệ gen, sử dụng một cặp mồi chung để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, sau

đó dựa trên dữ liệu di truyền thu được để định danh các loài một cách nhanh chóng và chính xác Kỹ thuật này được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, mối quan hệ phát sinh loài và kiểm chứng phân loại các loài có đặc điểm hình thái dễ gây nhầm lẫn (Herbert và ctv, 2003) Hiện nay, việc phân tích di truyền mã vạch là một lựa chọn hiệu quả vì chi phí thấp và có thể sử dụng cho nhiều đối tượng sinh vật, đồng thời rất hữu hiệu trong việc xây dựng dữ liệu di truyền ứng dụng trong quản lý nguồn lợi (Hajibabaei và ctv, 2005)

Trong kỹ thuật di truyền mã vạch, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong xác định các loài và đánh giá mối quan hệ của các loài với nhau (Grande và ctv, 2008) Các chỉ thị phân tử (marker) chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cho vùng gen điều khiển (control region – CR) mtDNA, cytochrome b (cyt b) mtDNA, 16S mtDNA và cytochrome oxidase c subunit

1 (COI) mtDNA (Grande và ctv, 2008)

Kỹ thuật di truyền mã vạch DNA hiện đã được áp dụng ở nhiều loài động vật như chim (Hebert và ctv, 2004), động vật lưỡng cư (Vences và ctv, 2005), kiến (Smith

và ctv, 2005) và động vật giáp xác (Lefebure và ctv, 2006)

Bartlett và Davidson (1991) là nhóm tác giả đầu tiên sử dụng trình tự mtDNA để định danh cá và đã chỉ ra rằng trình tự cytochrome b có thể sử dụng để phân loại 4 loài cá

ngừ thuộc giống Thunnus là T thynnus, T obesus, T albacares và T alalunga

Ward và ctv (2005) đã sử dụng mã vạch COI mtDNA và thu được trình tự của

270 loài cá thuộc vùng biển Australia, khoảng cách di truyền trung bình là 9,93% giữa các loài trong chi và chỉ có 0,39% giữa các cá thể trong cùng một loài Đồng thời nhóm nghiên cứu đưa ra kết luận trình tự COI mtDNA có thể được sử dụng để xác định hầu hết các loài cá

Mark và ctv (2005) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài của 84 loài thuộc họ

cá bàng chài (Labridae) tại vùng biển Chicago dựa trên chỉ thị phân tử 12S rRNA, 16S rRNA của hệ gen ty thể và vùng gen mã hóa protein RAG2, Tmo4C4 của hệ gen nhân

Kết quả cho thấy mối quan hệ di truyền gần gũi giữa giống Cheilinus và Scarus

Steinke và ctv (2009) kiểm tra hiệu quả của phương pháp di truyền mã vạch DNA bằng cách sử dụng gen COI mtDNA để xác định sự đa dạng các khu hệ cá biển ở khu vực Canada Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự biến đổi trình tự trong vùng mã vạch DNA cho phép phân biệt được 98% trong tổng số 201 loài cá tiến hành khảo sát Giá trị khác biệt di truyền trung bình cùng loài và khác loài lần lượt là 0,25% và 3,75% Zhang (2011) kiểm tra hiệu quả của kỹ thuật mã vạch DNA trong phân loại các loài cá biển của Trung Quốc Nhóm nghiên cứu thu được 321 trình tự thuộc 121 loài, bao gồm phần lớn các loài cá sống ở biển Đông Khoảng cách di truyền trung bình 15,742% giữa các loài và chỉ có 0,319% cho các cá thể trong cùng 1 loài

Zhang và Hanner (2011) sử dụng 229 trình tự DNA của gen COI thuộc 158 loài

cá biển ở Nhật Bản để kiểm tra hiệu quả của việc định danh loài bằng kỹ thuật di truyền mã vạch Khoảng cách di truyền trung bình là 17,6% giữa các loài và chỉ có 0,3% cho các cá thể trong cùng 1 loài Nhóm nghiên cứu đồng thời khẳng định kỹ thuật di truyền mã vạch đã cung cấp một công cụ nhanh chóng và chính xác trong công tác định danh các loài cá

Hubert và ctv (2012) kiểm tra hiệu quả của phương pháp di truyền mã vạch dựa trên chỉ thị phân tử COI mtDNA để xác định sự đa dạng các khu hệ cá rạn san hô ở vùng biển Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương Nhóm nghiên cứu đã thu được trình tự của 2276 mẫu cá rạn san hô thuộc 668 loài, 265 giống và 79 họ

Sachithanandam và ctv (2014) áp dụng gen COI mtDNA để phân loại hai loài cá

rạn san hô thuộc giống Plectropomus là P leopardus và P maculatus tại vùng biển

phía nam quần đảo Andaman, Ấn Độ Hai loài này có hình thái tương tự nhau nên dễ gây nhầm lẫn nếu chỉ phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, kết quả khoảng cách di truyền được tìm thấy giữa chúng là 0, 028%

Ở Việt Nam, kỹ thuật di truyền mã vạch chỉ mới được ứng dụng trong định danh

và phân loại một số loài cá nước ngọt Vũ Đặng Hạ Quyên và ctv (2014) đã sử dụng trình tự gen 16S mtDNA để kiểm chứng phân loại và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của 22 loài cá nước ngọt thuộc 17 giống, 15 họ, 8 bộ ở khu vực đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam

Dữ liệu mã vạch DNA đã được xây dựng cho hơn 8.000 loài cá và các trình tự COI mtDNA gửi vào hệ thống dữ liệu DNA barcode (BOLD) (Ragnasingham và Hebert, 2007)

Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) là cơ sở dữ liệu di truyền, chứa các trình tự DNA đã được công bố của 26000 loài sinh vật Genbank được xây dựng trên

cơ sở dữ liệu của Ngân hàng dữ liệu DNA Nhật Bản (DDBJ), phòng thí nghiệm sinh học phân tử châu Âu (EMBL) Việc dựa vào Genbank để kiểm tra đối chiếu độ chính xác của công tác phân loại cá đã và đang được sử dụng rộng rãi

Mặc dù sở hữu sự đa dạng sinh học cao về nguồn lợi cá rạn san hô, tuy nhiên chưa có công bố nào về dữ liệu di truyền mã vạch (DNA barcoding) của cá rạn san hô

ở vùng biển Việt Nam nói chung và vùng biển Khánh Hòa nói riêng

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và phương pháp thu mẫu

Các loài cá rạn san hô được thu từ tháng 10/2014 đến tháng 4/2015 dựa trên phương pháp thu mẫu từ những người đánh bắt cá tại địa phương Địa điểm thu mẫu tại Hòn Đụn, Hòn Nón thuộc thành phố Nha Trang và Bãi Dài thuộc thành phố Cam

Ranh, tỉnh Khánh Hòa (Hình 2.1) Mẫu sau khi thu được rửa sạch và mã hóa Tiến

hành phân loại bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi Mô cơ cá được lưu giữ trong cồn

96o và bảo quản lạnh ở – 20oC để phục vụ cho các nghiên cứu di truyền tiếp theo

Hình 2.1 – Các địa điểm thu mẫu cá trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa

(đánh dấu tròn màu đỏ)

2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.2 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

2.3 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái

Sau khi thu mẫu, chúng tôi tiến hành quan sát sơ bộ bên ngoài cơ thể cá (Hình 2.3), cân trọng lượng (g) cơ thể, đo các chỉ tiêu hình thái (cm) (Hình 2.4), đếm các chỉ tiêu phân loại (Hình 2.5) Cá được phân loại theo các khóa phân loại và mô tả của

Rainboth (1996), Allen và ctv (2005), Nguyễn Nhật Thi (2008), Trần Đắc Định và ctv (2013) Mẫu được bảo quản ở phòng thí nghiệm trường Đại học Nha Trang

Hình 2.3 – Một số bộ phận của bộ cá xương (Trần Đắc Định và ctv, 2013)

 Đo các chỉ tiêu hình thái

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, sau đó dùng thước có chia độ đo (cm) để đo kích thước các mẫu cá theo các chỉ tiêu sau:

- Chiều dài cá (L): đo từ đầu cá đến điểm cuối của thân cá

- Chiều dài cá bỏ đuôi (Lo): đo từ đầu cá đến cuống đuôi

- Chiều cao thân cá (H): đo phần cao nhất của cơ thể cá

- Chiều dài đầu (T): đo từ phần đầu cá đến hết phần mang cá

- Chiều dài gốc vây lưng (lD): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc gốc vây lưng

- Chiều dài gốc vây hậu môn (lA): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc gốc vây hậu môn

- Chiều dài gốc vây ngực (lP): đo từ điểm khởi đầu gốc vây ngực đến cuối vây ngực

- Chiều dài gốc vây bụng (lV): đo từ điểm khởi đầu gốc vây bụng đến cuối vây bụng

Hình 2.4 – Các chỉ số đo trong phân loại cá (Rainboth, 1996)

 Đếm các chỉ tiêu phân loại

Số lượng tia vây là một trong những chỉ tiêu hình thái để phân loại, nó đặc trưng cho mỗi loài

Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, đếm các tia vây cứng, tia vây mềm có trên các vây Trong phân loại cá người ta dùng các chữ đầu của tiếng để ký hiệu cho các vây như sau:

- D (Dorsal fin): Số lượng tia và gai vây lưng

- V (Ventral fin): Số lượng tia và gai vây bụng

- P (Pertoral fin): Số lượng tia và gai vây ngực

- A (Anal fin): Số lượng tia và gai vây hậu môn

- C (Caudal fin): Số lượng tia và gai vây đuôi

Hình 2.5 – Các chỉ số đếm trong phân loại cá (Rainboth, 1996)

Số lượng tia vây cứng được ký hiệu bằng các chữ số La Mã, còn số lượng tia vây mềm ký hiệu bằng chữ số thường, cách nhau bằng dấu phẩy, dao động giữa các mẫu ghi bằng dấu gạch nối

2.4 Nghiên cứu di truyền cá rạn san hô

2.4.1 Tách chiết DNA, nhân gen bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự

(5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) (Palumbi và ctv, 1991) Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: Giai đoạn biến tính ban đầu tại 94oC trong 3 phút; sau đó là 38 chu kỳ của 94oC trong 30 giây, nhiệt độ lai 48oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 7 phút (Hình 2.6)

Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với gen 16S mtDNA

 Điện di kiểm tra kết quả

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % nhuộm

Ethidium bromide

Chuẩn bị gel agarose 1,5 % : Cân 0,6 g agarose rồi cho vào 40 mL đệm TBE 1X

chứa trong bình tam giác 100 mL thứ nhất, đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi gel tan hoàn toàn Để nguội đến nhiệt độ khoảng 60 – 700C rồi chuyển qua bình tam giác 100

mL thứ hai Thêm 1,5 µL Ethidium bromide, lắc nhẹ để tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác)

Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ bản lược ra theo phương thẳng đứng để tránh rách các giếng

Chạy điện di: Cho gel vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản

gel Dùng micropipette trộn đều 3 µL mẫu với 1 µL loading dye 6X, rồi bơm vào các giếng của gel Hút 3 µL DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng Tiến hành chạy điện

di với nguồn điện 90 V, 400 mA trong 20 phút

Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV Transilluminator và xem

các band DNA dưới tia cực tím, sản phẩm của quá trình khuếch đại là các band có kích

thước vào khoảng 650 bp

tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây,

50oC trong 20 giây, cuối cùng là 60oC trong 4 phút Sản phẩm sau đó được phân tích bằng

thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems)

2.4.2 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại

Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá rạn san hô được xử lý và kết nối bằng phần mềm SEQUENCHER, version 5.3 (http://www.genecodes.com/), sau đó kiểm

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sau đó được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cá rạn san hô

Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính theo công thức như sau:

Sự khác biệt di truyền =

Số nucleotide khác biệt

x 100%

Tổng số nucleotide dóng hàng

Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen 16S của DNA ty thể với các mẫu cá rạn san hô, bao gồm 25 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở vùng biển Khánh Hòa, Việt Nam và 32 trình tự từ Genbank Thông tin về các trình tự cá rạn san hô được thể

hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá rạn san hô

thu mẫu

Mã số Genbank

Tác giả

6 Myripristis berndti Nhật Bản AP002940.1 Miya và ctv (2001)

9 Rhinecanthus verrucosus Mỹ EU108819.1 Dornburg và ctv (2008)

11 Labracinus cyclophthalmus Indonesia KP288615.1 Pertiwi và ctv (2014)

13 Parupeneus multifasciatus Nhật Bản AP012314.1 Song và ctv (2014)

19 Ctenochaetus striatus New Zealand AY057301.1 Clements và ctv (2003)

23 Lethrinus nebulosus Nhật Bản AB793300.1 Yogi và ctv (2013)

27 Scolopsis ciliatus Mỹ AF247448.1 Orrell và Carpenter (2004)

29 Iniistius aneitensis Mỹ AY279757.1 Westneat và Alfaro (2005)

31 Cheilinus oxycephalus Canada DQ076709.1 Nagel và Lougheed (2006)

36 Oxycheilinus unifasciatus Pháp JF457553.1 Hubert và ctv (2011)

39 Thalassoma lutescens Mỹ AY850863.1 Barber và Bellwood (2005)

41 Halichoeres prosopeion Mỹ AY850901.1 Barber và Bellwood (2005)

42 Halichoeres hortulanus Nha Trang Nghiên cứu hiện tại

43 Halichoeres hortulanus Pháp JF457474.1 Hubert và ctv (2011)

44 Halichoeres scapularis Mỹ JF457493.1 Barber và Bellwood (2005)

48 Epinephelus fasciatus Trung Quốc DQ088039.1 Wang và ctv (2006)

50 Cephalopholis boenak Mỹ AY947598.1 Craig và Hastings (2007)

52 Diploprion bifasciatum Trung Quốc KP256530.1 Wang và ctv (2015)

54 Plectropomus leopardus Trung Quốc DQ067321.1 Wang và ctv (2006)

55 Plectropomus maculatus Trung Quốc JF750755.1 Chen (2011)

57 Orectolobus japonicus* Trung Quốc KF111729.1 Chen và ctv (2013)

(*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự của các loài cá rạn san hô thu được và trình tự từ Genbank bằng phần mềm MEGA 6.06, sử dụng thuật toán Maximum Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) lặp lại 1000 lần

CHƯƠNG 3 –KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Phân loại hình thái

3.1.1 Thành phần loài các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam

Sau khi tiến hành thu mẫu và phân tích hình thái, nghiên cứu phân loại được 25

loài cá thuộc 22 giống, 15 họ, 5 bộ Danh sách các loài cá được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 – Danh sách các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam

Bộ Họ Giống Loài Tên thường gọi

Upeneus Upeneus tragula Cá phèn sọc đen

Cheilinus Cheilinus oxycephalus Cá bàng chài đầu nhọn

Cheilinus fasciatus Cá bàng chài ngực đỏ

Oxycheilinus Oxycheilinus digramma Cá bàng chài má sọc

Thalassoma Thalassoma lunare Cá bàng chài mặt trăng

Halichoeres Halichoeres melanochir Cá bàng chài vây cam

Halichoeres hortulanus Cá bàng chài bàn cờ

Epinephelus fasciatus Cá mú sáu sọc ngang

Cephalopholis Cephalopholis boenak Cá mú vân sóng

Diploprion Diploprion bifasciatum Cá mú vàng nghệ

Plectropomus Plectropomus leopardus Cá mú da báo

 Tỷ lệ các loài cá xét theo bộ

Trong số các bộ mà nghiên cứu tiến hành phân loại được thì bộ cá vược – Perciformes có số loài nhiều nhất với 21 loài (chiếm 84%) 4 bộ cá còn lại là bộ cá

răng kiếm – Aulopiformes, bộ cá chìa vôi – Syngnathiformes, bộ cá tráp mắt vàng – Beryciformes và bộ cá nóc – Tetraodontiformes với mỗi bộ 1 loài (mỗi bộ chiếm 4%)

 Tỷ lệ các loài cá xét theo họ

Trong số các họ mà nghiên cứu tiến hành phân loại được thì họ cá bàng chài – Labridae có số loài nhiều nhất với 7 loài (chiếm 28%), tiếp theo là họ cá mú – Serranidae với 5 loài (chiếm 20%), họ cá phèn – Mullidae với 2 loài (chiếm 8%) Các

họ còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi họ chiếm 4%)

 Tỷ lệ các loài cá xét theo giống

Trong số các giống mà nghiên cứu tiến hành phân loại được thì giống cá mú –

Epinephelus, giống cá bàng chài – Cheilinus và Halichoeres có số loài nhiều nhất với

2 loài mỗi giống (mỗi giống chiếm 8 %) Các giống còn lại đều chỉ có 1 loài (mỗi giống chiếm 4%)

Bảng 3.2 – Chỉ tiêu hình thái của các loài cá rạn san hô tiến hành phân loại được ở Khánh Hòa

Lutjanus russellii 2 X, 15 III, 12 14 I, 5 17 20,9 ± 0,14 16,5 ± 0,71 6,9 ± 0,14 5,85 ± 0,49 8,5 2,5 4,5 4 122,18 ± 2,1

Iniistius pavo 2 IX, 12 III, 13 10 5 12 16 ± 1,41 14 ± 1,41 5 4 8,25 ± 2,47 5,75 ± 0,35 2,9 ± 0,14 2,85 ± 0,21 70,32 ± 14,29

Ghi chú:

N – Số lượng mẫu cá

D – Số lượng tia và gai vây lưng

A – Số lượng tia và gai vây hậu môn

P – Số lượng tia và gai vây ngực

V – Số lượng tia và gai vây bụng

C – Số lượng tia và gai vây đuôi

Số tia gai cứng được ký hiệu bằng chữ số La

Mã, còn số lượng tia vây mềm ký hiệu bằng chữ số thường, cách nhau bằng dấu phẩy (VD: 2 tia gai cứng, 9 tia mềm thì ký hiệu:

II,9)

L – Chiều dài cá

Lo – Chiều dài cá bỏ đuôi

H – Chiều cao thân cá

T – Chiều dài đầu

lD – Chiều dài gốc vây lưng

lA – Chiều dài gốc vây hậu môn

lP – Chiều dài gốc vây ngực

lV – Chiều dài gốc vây bụng

m – Khối lượng

Thalassoma lunare 2 VIII, 13 III, 11 14 I, 5 12 13,75 ± 0,47 11,5 ± 2,12 3,15 ± 0,49 3 ± 0,71 7 ± 1,4 3,5 ± 0,7 2,5 ± 0,42 1,5 ± 0,7 38.65 ± 0,49

Epinephelus merra 2 XI, 16 III, 8 16 I, 5 16 16,1 ± 2,69 13,1 ± 1,98 4,5 ± 0,71 5,1 ± 0,85 7,75 ± 1,06 2,4 ± 0,57 3,6 2,5 ± 0,42 54,28 ± 22,29 Epinephelus fasciatus 3 XI, 16 III, 8 16 I, 5 16 11,53 ± 0,91 9,93 ± 1,01 3,4 ± 0,17 3,47 ± 0,25 5,6 ± 0,35 1,83 ± 0,15 2,57 ± 0,12 1,8 ± 0,17 23,57 ± 3,94

Plectropomus leopardus 2 VIII, 12 III, 7 16 I, 4 17 17,75 ± 1,06 14,25 ± 1,06 4,5 5 7 ± 0,71 2,45 ± 0,35 2,85 ± 0,21 2,85 ± 0,21 75,03 ± 12,35

3.1.2 Đặc điểm hình thái các loài cá rạn san hô phổ biến thu tại Khánh Hòa, Việt Nam (1) Synodus variegatus (Lacepède, 1803) – Cá mối vện

Tên tiếng Anh: Variegated Lizardfish, Engleman's Lizardfish, Reef Lizardfish Tên tiếng Việt: Cá mối vện, cá thửng vện

Theo FishBase http://fishbase.us/ (cập nhật tháng 02/2015), Synodus variegatus

có hệ thống phân loại như sau:

Ngành: Chordata

Lớp: Actinopterygii Bộ: Aulopiformes Họ: Synodontidae

Giống: Synodus Loài: Synodus variegatus (Lacepède, 1803) Danh pháp trước đây: Salmo variegatus (Lacepède, 1803)

Saurus variegatus (Lacepède, 1803)

Hình 3.1a – Hình thái Synodus variegatus (TĐTL = 1,75 cm)

 Đặc điểm hình thái

Synodus variegatus có thân hình trụ thuôn dài, thóp lại ở phần đuôi Đầu cá dẹp

và ngắn Mõm cá nhọn, miệng rộng, hai hàm dài bằng nhau khi khép lại, trong có nhiều răng nhọn và sắc Mắt cá lồi và nằm cao trên đỉnh đầu Chiều cao thân cá trung bình 3,05 ± 0,35 cm (n = 2), chiều dài trung bình 18,85 ± 2,19 cm (n = 2) và khối

lượng trung bình 63,91 ± 21,53 g (n = 2) (Bảng 3.2) Phần lưng cá màu xám, bên sườn

có 9 – 10 vết đỏ sẫm nằm vắt ngang Phần bụng cá màu trắng Trên hàm, xương nắp mang và trên các vây có nhiều vằn, đốm

Vây lưng nằm ở phần giữa thân, không có tia cứng, có 13 tia mềm, có kèm theo một vây mỡ nhỏ nằm gần cuống đuôi Vây ngực dài nhọn, có 12 tia mềm Vây bụng có

8 tia mềm Vây hậu môn có 8 tia mềm Vây đuôi phân thùy, rãnh chẻ sâu 1/2 chiều dài

vây, có những sọc ngang màu đen (Hình 3.1b)

Hình 3.1b – Đặc điểm hình thái Synodus variegatus

1 – Phần lưng cá màu xám, bên sườn có 9 – 10 vết đỏ sẫm nằm vắt ngang; 2 – Vây

mỡ nhỏ nằm gần cuống đuôi; 3 – Trên các vây cá có nhiều vằn, đốm

Nhận xét:

Loài Synodus variegatus nghiên cứu hiện tại thu được có đặc điểm hình thái

giống với mô tả của Myers (1991), Kuiter và ctv (2001), Allen và ctv (2005) Kích

thước lớn nhất ghi nhận được của S variegatus là 24 cm (Allen và ctv, 2005)

(2) Fistularia commersonii (Rüppell, 1838) – Cá chìa vôi chấm xanh

Tên tiếng Anh: Bluespotted Cornetfish

Tên tiếng Việt: Cá chìa vôi chấm xanh, cá lao, cá phóng lao

Theo FishBase http://fishbase.us/ (cập nhật tháng 02/2015), Fistularia

commersonii có hệ thống phân loại như sau:

Ngành: Chordata

Lớp: Actinopterygii Bộ: Syngnathiformes Họ: Fistulariidae

Giống: Fistularia Loài: Fistularia commersonii (Rüppell, 1838) Danh pháp trước đây: Fistularia depressa (Gunther, 1880)

Hình 3.2a – Hình thái Fistularia commersonii (TĐTL = 4 cm)

 Đặc điểm hình thái

Fistularia commersonii có thân hình trụ thon dài, mõm cá đặc biệt dài và cứng

Đầu cá nhỏ và ngắn, mắt cá tròn to gần hết phần đầu Miệng cá ngắn và hẹp, hàm dưới

có hàng răng nhỏ, môi dưới trề và dài hơn môi trên Chiều dài thân cá 66 cm (n = 1),

chiều cao thân 1,6 cm (n = 1) và khối lượng 112,09 g (n = 1) (Bảng 3.2) Thân cá có

màu nâu, toàn bộ thân không phủ vẩy, trên thân có hai sọc mảnh và hai hàng chấm tròn nhỏ màu xanh tím chạy dọc theo xương sống từ phần nắp mang đến cuống vây đuôi Phần bụng cá màu trắng bạc

Vây cá màu trắng, rìa vây màu cam nhạt Vây lưng và vây hậu môn khá đặc trưng, mọc đối xứng nhau với vây lưng có 15 tia mềm và vây hậu môn có 15 tia mềm Vây ngực có 14 tia mềm Vây bụng không phát triển; chỉ dài 1,2 cm và có 6 tia mềm

Vây đuôi chia thùy, có tia giữa tạo thành một sợi dài (Hình 3.2b)

Hình 3.2b – Đặc điểm hình thái Fistularia commersonii

1 – Mõm cá đặc biệt dài; 2 – Thân cá hình trụ thon dài, toàn thân không phủ

vẩy; 3 – Vây đuôi chia thùy, có tia giữa tạo thành một sợi dài