chương6

Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên [r]

bằng cách (ly tâm) với

chloroform RNA hòa tan trong pha kết

-

Hình 6.1 Sơ đồ quy trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số

Mô hoặc tế bào

2 Phân tích RNA

2.1 Lai Northern (Northern hybridization)

32

P (hoặc digoxigenin-dUTP) phương pháp

Hình 6.2 Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern Hình phía dưới là

điện di RNA tổng số trên agarose gel được biến tính bằng formamide Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số với mẫu dò được đánh dấu bằng 32

P

2.2 Lai Dot (Dot hybridization)

Lai dot được Kafatos và cs (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose, sau đó màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có đánh dấu 32

P,

và ủ với phim X-quang Mặc dù khó định lượng chính xác do kích thước của các chấm lớn và khác nhau, nhưng trong nhiều trường hợp có thể thu được một ý tưởng tốt về cường độ biểu hiện của một gen đặc biệt nào đó trong các mô đặc trưng hoặc các tế bào nuôi cấy (Hình 6.3)

Hình 6.3 Phân tích dot để định lượng RNA Hàng phía dưới là các nồng độ

RNA chuẩn đã biết Hàng trên là các nồng độ RNA khác nhau được tách chiết từ mô/cơ quan

(complementary DNA)

Q

tuần tự nhiệt và enzyme RNase H của E coli khuôn mẫu là

reverse transcriptase

hoàn/

hoàn

sợi cDNA mang vòng cặp tóc

AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất

DNA polymerase I Tổng hợp sợi cDNA thứ hai

Biến tính thể lai mRNA-cDNA

AAAAAA 3’ mRNA 5’

1

, s

1 Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow, k hai

bacteriophage

: Eco : Eco

-E coli

vector

thức đuôi dA:dT

6.5 dG:dC

-AAAAAACCCCC

C

Tổng hợp sợi cDNA thứ hai

Plasmid

PstI

AAAAAA

AAAAAA TTTTTT

Tổng hợp sợi thứ nhất bằng oligo (dT)-primer

AAAAAA TTTTTT

TTTTTT CCCCCC

CTGC A

Gp

Gp ACGTC

GTGCAGGGGGG Gp

Gp GGGGGGACGTC

Bổ sung các (dC) bằng terminal transferase

Bổ sung các (dG) bằng terminal transferase Cắt bằng Pst I

Gắn

Pst I Plasmid

Biến nạp vào chủng E coli thích hợp Chọn lọc khả năng kháng kháng sinh

Trong quá trình biến nạp, những chỗ sai sót trong DNA được sửa chữa bởi các enzyme của vật chủ để phục hồi các Pst I

ở mỗi đầu của cDNA

G CCCCCC TTTTTTGGGGGGACGTC

Hình 6.6 Minh họa một linker (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận

biết cho BamHI (b) Linker này được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase (c) Cấu trúc này sau đó được cắt bằng BamHI để tạo ra đầu 5’ lồi

(không

cDNA

CCGGATCCGG

GGCCTAGGCC

CCGGATCCGG GGCCTAGGCC

5’ - GATCCGG

GCC

CCG GGCCTAG - 5’

Hình 6.7 Minh họa một adapter (a) Adapter, có đầu tận cùng 5’ tương ứng với

enzyme HindIII, được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase (b) Đầu 5’ của

adapter có thể được dephosphoryl hóa để ngăn cản sự tự kết nối lại

5’ - AGCTTCCGGG

AGGCCC

CCCGGA GGGCCTTCGA – 5’

DNA ligase (a)

(b)

6.8

Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng

được gắn với vector và biến nạp vào E coli

cDNA sợi đôi Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow

Bổ sung linker thứ nhất

Cắt bằng nuclease S1

Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow hoặc bằng DNA polymerase của bacteriophage T4

Bổ sung linker thứ hai

Gắn với plasmid vector

Biến nạp vào tế bào khả biến E coli

Cắt bằng enzyme hạn chế

CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC

3’ (A) n GTCGACTCC

5’

GGAGTCGACGGGGGGGGGG

CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC 3’

(T) n CAGCTGAGG

5’

3’ (A) n GTCGACTCC

5’

GGAGTCGACGGGGGGGGGG

pTCGAC(G) n G(C) n

(A) n G (T) n CAGCTp

Cấu trúc chóp 5’

cDNA sợi thứ nhất

mRNA Tổng hợp cDNA sợi thứ

A A A A (A) n

chỉ , trong khi vector

1.1 Vector gt10

-gayếu tố quyết định (epitopes)

yếu tố quyết định

mẫu dò

2 cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator hoặc

promoter của gen, và kìm hãm phiên mã bằng cách ngăn chặn sự liên kết của RNA polymerase.

DNA

Vector

nhằm

đó là lai nucleic acid

và phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu

1.1 Lai nucleic acid

hoàn

mẫu dò

mẫu dò cho cDNA quan tâm

mẫu dòbiến (degene

+

-nghiêm ngặt (non-stringency)

+

còn ẵ

quá trình

mẫu dòyếu tố quyết định kháng nguyên , mẫu dò

mẫu dò

mẫu dòthu được

của các dòng cDNA thu được:

-trình tự

vector

: -

thân mRNA (pre-mRNA)

Các bước chính của quá trình xây dựng thư viện cDNA như sau:

bỏ

27

bacteriophage

hóabacte

u ,

hoàn

hoàn

hóa

0,5

Tài liệu tham khảo/đọc thêm

1 Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith

JA and Struhl K 2002 Short Protocol in Molecular Biology Vol 1 and 2 5th ed

John Wiley & Sons, Inc USA

2 Brown TA 2001 Gene Cloning-An Introduction 4th ed Blackwell

Science, Oxford, UK

3 Calladine CR and Drew HR 1997 Understanding DNA: The Molecule

and How It Works 2nd ed Academic Press, London, UK

4 Glick BR and Pasternak JJ 2003 Molecular Biotechnology: Principles

and Applications of Recombinant DNA 3rd ed ASM Press, USA

5 Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J 1989 Molecular Cloning-A

Laboratory Manual Cold Spring Habor Laboratory Press, USA

6 Ohman DE 1989 Experiments in Gene Manipulation Prentice Hall,

Englewood Cliffs, New Jersey, USA

7 Primrose SB, Twyman R and Old RW 2001 Principles of Gene

Manipulation 6th ed Blackwell Science, Oxford, UK

8 Rapley R and Walker JM 1998 Molecular Biomethods Handbook

Humana Press Inc New Jersey, USA

9 Surzycki S 2000 Basic Techniques in Molecular Biology

Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany