bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất chiết xuất nấm men ứng dụng làm phụ gia thực phẩm

Thông tin chung: - Tên đề tài: “Bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất chiết xuất nấm men ứng dụng làm phụ gia thực phẩm” - Sinh viên thực hiện: 1 Nguyễn Thị Thanh Tâm 1053012672 CNSH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHIẾT XUẤT NẤM MEN ỨNG DỤNG LÀM PHỤ GIA THỰC PHẨM

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học

TP Hồ Chí Minh, tháng 4/2014

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH

SẢN XUẤT CHIẾT XUẤT NẤM MEN ỨNG DỤNG LÀM PHỤ GIA THỰC PHẨM

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ sinh học

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Thanh Tâm Nữ:

Nguyễn Đình Huy Nam Trần Thu Hương Nữ Phạm Thị Nguyệt Nữ

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về phụ gia thực phẩm 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 4

1.2 Giới thiệu chiết xuất nấm men 5

1.2.1 Định nghĩa: 5

1.2.2 Nguyên liệu và cơ chế sản xuất 6

1.2.3 Thành phần dinh dưỡng 9

1.2.4 Ứng dụng 11

1.3 Tổng quan về nấm men 12

1.3.1 Lịch sử nấm men 12

1.3.2 Phân loại nấm men 12

1.3.3 Cấu tạo và thành phần hóa học 12

1.3.4 Sự sinh trường và phát triển của Saccharomyces cerevisiae 15

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men 17

1.3.6 Các phương pháp phá vỡ tế bào nấm men 19

1.4 Giới thiệu về enzyme protease 29

1.4.1 Định nghĩa và phân loại 29

1.4.2 Nguồn thu nhận 30

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme 31

1.4.4 Ứng dụng 34

Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Vật liệu nghiên cứu 36

2.1.1 Địa điểm thí nghiệm 36

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất thí nghiệm 36

2.1.3 Dụng cụ thí nghiệm 36

2.1.4 Môi trường nuôi cấy nấm men 37

2.2.1 Quy trình sản xuất 38

2.2.2 Sơ đồ nghiên cứu 40

2.3 Bố trí thí nghiệm 42

2.3.1 Khảo sát nguyên liệu nấm men 42

2.3.2 Khảo sát môi trường nuôi cấy và thời gian thu sinh khối nấm men 42

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân nấm men 43

2.3.4 Khảo sát quá trình tự phân nấm men kết hợp bổ sung enzyme 51

2.3.5 Khảo sát quá trình tự phân kết hợp bổ sung muối và ethanol 58

2.3.6 Khảo sát quá trình tự phân kết hợp lạnh đông 64

2.3.7 So sánh hiệu quả của các phương pháp phá vỡ tế bào 66

2.3.8 Khảo sát quá trình cô đặc bằng nhiệt 67

2.3.9 Đánh giá chất lượng sản phẩm 67

Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 69

3.1 Khảo sát nguyên liệu nấm men 70

3.2 Khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy nấm men 70

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân nấm men 72

3.3.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men/nước 72

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 75

3.3.3 Ảnh hưởng của pH 77

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian 78

3.3.5 Quy hoạch thực nghiệm quá trình tự phân 80

3.4 Khảo sát quá trình tự phân nấm men kết hợp bổ sung enzyme 81

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme Alcalase trong quá trình tự phân kết hợp bổ sung enzyme 81

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình tự phân kết hợp bổ sung enzyme 83

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH trong quá trình tự phân kết hợp bổ sung enzyme 85

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trong quá trình tự phân kết hợp bổ sung enzyme 86

kết hợp bổ sung enzyme 88

3.5 Khảo sát quá trình tự phân kết hợp bổ sung muối và ethanol 89

3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến quá trình tự phân 89

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình tự phân 91

3.5.3 Quy hoạch thực nghiệm 92

3.6 Khảo sát quá trình tự phân kết hợp phương pháp vật lí 93

3.6.1 Khảo sát quá trình lạnh đông 93

3.6.2 Khảo sát quá trình lạnh đông kết hợp tự phân 95

3.7 So sánh hiệu quả của các phương pháp phá vỡ tế bào 96

3.8 Khảo sát quá trình cô đặc bằng nhiệt 96

3.9 Đánh giá chất lượng sản phẩm 98

Phần 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 99

4.1 Kết luận 100

4.2 Kiến nghị 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

PHỤ LỤC i

Bảng 1.1: Thành phần chính của chiết xuất nấm men 10

Bảng 1.2: Thành phần các vitamine trong chiết xuất nấm men 10

Bảng 1.3: Thành phần các acid amin trong chiết xuất nấm men 10

Bảng 1.4: Các thành phần của vách tế bào nấm men 13

Bảng 2.1: Phương pháp khảo sát các thành phần trong nấm men 42

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát môi trường và thời gian nuôi cấy 43

Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nấm men/ nước 45

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ 46

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát pH 47

Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian 48

Bảng 2 7: Điều kiện thí nghiệm quá trình tự phân 50

Bảng 2 8: Kế hoạch bố trí thí nghiệm quá trình tự phân 50

Bảng 2.9: Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ enzyme Alcalase 52

Bảng 2.10: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 53

Bảng 2.11: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH 54

Bảng 2.12: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian 55

Bảng 2 13: Điều kiện thí nghiệm quá trình tự phân kết hợp bổ sung enzyme 57

Bảng 2 14: Kế hoạch bố trí thí nghiệm tự phân có bổ sung enzyme 57

Bảng 2.15: Bảng bố trí thí nghiệm nồng độ muối 59

Bảng 2.16: Bảng bố trí thí nghiệm nồng độ ethanol 61

Bảng 2 17: Điều kiện thí nghiệm quá trình tự phân kết hợp bổ sung muối và ethanol 62

Bảng 2 18: Kế hoạch bố trí thí nghiệm tự phân kết hợp bổ sung muối và ethanol 63

Bảng 2.19: Bảng bố trí thí nghiệm lạnh đông-rã đông 65

Bảng 2.20: Bố trí thí nghiệm kết hợp lạnh đông và quá trình tự phân 65

Bảng 2 21: So sánh hiệu quả của các phương pháp phá vỡ tế bào nấm men 66

Bảng 2.22: Bố trí thí nghiêm quá trình cô đặc 67

Bảng 2.23: Đánh giá các thành phần có trong sản phẩm chiết xuất nấm men cô đặc 68

Bảng 3.1: Kết quả hàm lượng các thành phần trong nguyên liệu nấm men 70

theo phương pháp đo độ đục (*109 cfu/ml) 70

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men/nước đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 72

Bảng 3 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men/nước đến hàm lượng thu hồi chất khô trong dịch tự phân 74

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 75

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 77

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 78

Bảng 3 8: Kết quả quy hoạch thực nghiệm 80

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Alcalase đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 81

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân có bổ sung enzyme 83

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân có bổ sung enzyme 85

Bảng 3 12: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân có bổ sung enzyme 86

Bảng 3 13: Kết quả quy hoạch thực nghiệm 88

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 89

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 91

Bảng 3.16: Kết quả quy hoạch thực nghiệm 92

Bảng 3.17: Kết quả quá trình lạnh đông – rã đông 93

Bảng 3.18: Kết quả thí nghiệm lạnh đông kết hợp tự phân 95

Bảng 3 19: So sánh hiệu quả của các phương pháp phá vỡ tế bào nấm men 96

Bảng 3.20: Kết quả quá trình cô đặc bằng nhiệt 96

Bảng 3.21: Đánh giá các thành phần có trong sản phẩm chiết xuất nấm men cô đặc 98

Hình 1.1 Chiết xuất nấm men dạng bột 5Hình 1.2: Sự phát triển của nấm men 16Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của môi trường

và thời gian nuôi cấy đến số tế bào nấm men 71 Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men/nước

đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 73Hình 3.3: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tỉ lệ nấm men/nước

đến hàm lượng chất khô trong dịch tự phân 74Hình 3.4: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 76Hình 3.5: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của pH đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 77Hình 3.6: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 79Hình 3.7: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme

đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 82Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân có bổ sung enzyme 84Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của pH đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 85Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian đến

hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 87Hình 3.11: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ muối

đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 90Hình 3.12: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ ethanol

đến hàm lượng acid amin trong dịch tự phân 91Hình 3.13:Biểu đồ thể hiện hàm lượng acid amin

sau quá trình lạnh đông – rã đông 94Hình 3.14:Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của quá trình lạnh đông

kết hợp tự phân đến hàm lượng acid amin 95

đến sản phẩm chiết xuất nấm men 97

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: “Bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất chiết xuất nấm men ứng dụng làm phụ gia thực phẩm”

- Sinh viên thực hiện:

1 Nguyễn Thị Thanh Tâm 1053012672 CNSH 2010-2014 4

Xây dựng được quy trình sản xuất chiết xuất nấm men hoàn thiện với các thông

số tối ưu, từ đó tạo thành các sản phẩm dùng để tăng cường vị cho các món ăn cũng như cung cấp chất dinh dưỡng như vitamin, khoáng, acid amin thiết yếu cho người tiêu dùng

Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi dự định sẽ nghiên cứu các quá trình sau:

 Nuôi cấy nấm men để thu sinh khối

 Khảo sát các phương pháp phân giải tế bào nấm men như phương pháp tự phân, phương pháp sử dụng enzyme, kết hợp các phương pháp…để thu được lượng protein nội bào là cao nhất

 Tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm

3 Tính mới và sáng tạo:

Sản phẩm chiết xuất nấm men còn khá mới mẻ với người tiêu dùng Hiện nay, trong nước cũng chưa có nhiều công trình nghiên cứu quy trình sản xuất chiết xuất nấm men hoàn thiện

Đề xuất được quy trình sản xuất chiết xuất nấm men hoàn thiện để ứng dụng tạo một loại phụ gia hoàn toàn tự nhiên, góp phần làm tăng giá trị cảm quan cho các sản phẩm chế biến có bổ sung gia vị, đồng thời cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể thông qua các sản phẩm này

5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:

Kết quả đề tài có thể được ứng dụng rộng rãi và sẽ giúp ích rất nhiều cho các nhà sản xuất thực phẩm trong việc nâng cao giá trị sản phẩm

6 Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ

tên tạp chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):

Ngày tháng năm

Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài

(ký, họ và tên)

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên

thực hiện đề tài (phần này do người hướng dẫn ghi):

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: Nguyễn Thị Thanh Tâm

Sinh ngày: 03 tháng 11 năm 1992

Nơi sinh: Đồng Nai

Lớp: SH10A5 Khóa:2010 - 2014

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 39/80B, khu phố 3, phường Tam Hòa, Biên Hòa, Đồng Nai Điện thoại: 0903330904

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời xa xưa, con người đã biết sử dụng nấm men để sản xuất bánh mì và các loại đồ uống như bia, rượu Bên cạnh đó, người ta còn biết tận dụng sinh khối nấm men làm nguồn thức ăn tốt cho gia súc, gia cầm và cá do có hàm lượng protein cao Đến năm 1897, nhà hóa học và enzyme học người Đức, Eduard Buchner, đã thành công trong việc tách chiết các thành phần tự nhiên từ tế bào nấm men, tạo ra một hỗn hợp chiết xuất nấm men giàu dinh dưỡng Do chứa nhiều acid amin, vitamin, carbonhydrate và muối, nên ngày nay các sản phẩm chiết xuất nấm men đã được nhiều nước phát triển trên thế giới sử dụng như một chất tăng cường vị, bổ sung dinh dưỡng

và tạo ra hương vị ngon miệng tự nhiên cho các món ăn

Tuy phổ biến trên thế giới nhưng các sản phẩm này ở Việt Nam còn đắt, thị trường trong nước còn nhiều hạn chế cũng như chưa có nhiều công trình thực hiện nghiên cứu sản xuất Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó, nhóm chúng tôi quyết định nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất chiết xuất nấm men hoàn thiện, ứng dụng để

sản xuất phụ gia tự nhiên giàu dinh dưỡng, thông qua đề tài “Bước đầu nghiên cứu

quy trình sản xuất chiết xuất nấm men ứng dụng làm phụ gia thực phẩm”

Trong đề tài, đầu tiên nhóm chúng tôi sẽ khảo sát quá trình nuôi cấy nấm men thông qua việc thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy để đạt được hiệu quả về hàm lượng sinh khối là lớn nhất Sau đó, chúng tôi sẽ khảo sát các biện pháp tách chiết như phương pháp tự phân, phương pháp sử dụng enzyme,…đồng thời tiến hành ly tâm thu dịch và tinh sạch bằng cách lọc để tạo ra sản phẩm chiết xuất nấm men tinh sạch có chất lượng cao

Trong phạm vi nghiên cứu, do điều kiện phòng thí nghiệm còn nhiều hạn chế, nên chúng tôi chỉ tạo sản phẩm chiết xuất nấm men dạng cô đặc với hương vị đặc trưng và giàu dinh dưỡng

Với đề tài này, chúng tôi hy vọng đưa ra được một quy trình sản xuất chiết xuất nấm men hoàn thiện để ứng dụng tạo một loại phụ gia hoàn toàn tự nhiên, góp phần làm tăng giá trị cảm quan cho các sản phẩm chế biến có bổ sung gia vị, đồng thời cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể thông qua các sản phẩm này

Kết quả đề tài có thể được ứng dụng rộng rãi và sẽ giúp ích rất nhiều cho các nhà sản xuất thực phẩm trong việc nâng cao giá trị sản phẩm

Phần 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về phụ gia thực phẩm [8]

1.1.1 Định nghĩa

Theo FAO: Phụ gia là chất không dinh dưỡng được thêm vào các sản phẩm

với các ý định khác nhau Thông thường các chất này có hàm lượng thấp dùng để cải thiện tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị cũng như bảo quản sản phẩm

Theo WHO: Phụ gia là một chất khác hơn là thực phẩm hiện diện trong thực

phẩm, là kết quả của một số mặt: sản xuất chế biến, bao gói, tồn trữ… Các chất này không bao gồm các chất bẩn bị nhiễm vào thực phẩm

Theo Ủy ban Tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (Codex Alimentarius Commisson- CAC): Phụ gia là một chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không

được tiêu thụ thông thường như một thực phẩm và cũng không được sử dụng như một thành phần của thực phẩm Việc bổ sung chúng vào thực phẩm là để giải quyết mục đích công nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải thiện kết cấu hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó Phụ gia thực phẩm không bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất độc bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì hay cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm

Theo TCVN: Phụ gia thực phẩm là những chất không được coi là thực

phẩm hay một thành phần chủ yếu của thực phẩm, có hoặc không có giá trị dinh dưỡng, đảm bảo an toàn cho sức khỏe, được chủ động cho vào thực phẩm với một lượng nhỏ nhằm duy trì chất lượng, hình dạng, mùi vị, độ kiềm hoặc acid của thực phẩm, đáp ứng về yêu cầu công nghệ trong chế biến, đóng gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm

Tóm lại, phụ gia thực phẩm:

 Không phải là thực phẩm

 Các chế phẩm tự nhiên hoặc tổng hợp

 Đưa vào thực phẩm một cách cố ý để thực hiện mục đích kỹ thuật nhất định

 Lưu lại ở dạng thực phẩm ở dạng nguyên thể hoặc dẫn xuất nhưng vẫn đảm bảo an toàn cho người sử dụng

Với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện nay giới hạn phụ gia được sử dụng trong thực phẩm ngày càng chính xác hơn đảm bảo an toàn cho người sử dụng thực phẩm

1.1.2 Phân loại

Tùy theo mục đích sử dụng, người ta thường chia phụ gia thực phẩm ra làm các nhóm chính như sau:

 Phụ gia bổ sung chất dinh dưỡng cho thực phẩm

 Phụ gia bảo quản thực phẩm

 Phụ gia làm tăng giá trị cảm quan của thực phẩm, như: chất tạo màu, chất tạo mùi, chất tạo vị

 Phụ gia tạo cấu trúc

 Một số phụ gia khác

Trong số các phụ gia nói trên thì nhóm phụ gia tạo vị là một nhóm khá quan trọng trong bữa ăn hàng ngày Ngoài các chất tạo vị mặn ngọt như đường muối thì người ta còn sử dụng thêm các chất tăng cường vị cho các món ăn, điển hình như là bột ngọt, hạt nêm…

Ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế, người tiêu dùng không chỉ yêu cầu một bữa ăn ngon, đầy đủ, mà họ còn quan tâm nhiều hơn đến vấn đề an toàn cho sức khỏe Vì vậy bột ngọt ngày càng bị hạn chế sử dụng do gây ra các tác dụng phụ Mặc

dù đã được kiểm định là an toàn khi sử dụng nhưng thực tế người tiêu dùng vẫn rất e

dè Theo một số nghiên cứu trên thế giới: “Bột ngọt chỉ là một chất phụ gia có tác dụng điều vị cho thực phẩm, bản thân bột ngọt không phải là chất dinh dưỡng Nếu dùng quá nhiều bột ngọt có thể gây ra nhiều tác dụng phụ khác nhau: cảm giác nóng rát ở khuôn mặt, cánh tay hoặc ngực; tê bức xạ từ cổ đến tay, ngứa ran ở mặt, cánh tay hoặc cổ, nhức đầu, ngực đau, buồn nôn, tim đập nhanh, buồn ngủ, khó thở và suy yếu Đặc biệt tình trạng khó thở sẽ trở nên tồi tệ hơn ở những người bị hen Đối với những người bị mỡ máu, tiểu đường, trẻ em, phụ nữ mang thai và những người béo phì, đau đầu kinh niên, hen suyễn rất dễ dị ứng với bột ngọt (nguồn trích dẫn Vnmedia) [21]

Vì những lí do trên, và do nhu cầu về an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe, nên hiện nay người tiêu dùng có xu hướng sử dụng các loại thực phẩm, gia vị có nguồn gốc tự nhiên nhưng vẫn đảm bảo vị ngon đậm đà cho các món ăn, ví dụ như các sản

phẩm chiết xuất từ bò, heo, gà và chiết xuất nấm men… Bên cạnh đó, cùng với trang thiết bị máy móc và công nghệ ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, hỗ trợ rất nhiều cho việc nghiên cứu và phát triển những sản phẩm gia vị hoàn toàn tự nhiên, không hóa chất đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng khó tính

 Kết luận:

Trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, việc sử dụng chất phụ gia ngày càng phổ biến Với nhu cầu quan tâm sức khỏe ngày nay, người tiêu dùng không những mong muốn mua được một sản phẩm thơm ngon, mà họ còn yêu cầu sản phẩm phải đạt cả về giá trị dinh dưỡng và không ảnh hưởng đến sức khỏe người dùng Với các thành phần tự nhiên, chiết xuất nấm men được công nhận là một sản phẩm an toàn có tác dụng tạo vị ngọt cho các món ăn, đồng thời cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu cho người tiêu dùng và nâng cao giá trị sản phẩm do chứa nhiều acid amin không thay thế và vitamin B

1.2 Giới thiệu chiết xuất nấm men [20]

1.2.1 Định nghĩa:

Chiết xuất nấm men là tên gọi cho các hình thức khác nhau của các sản phẩm chế biến từ nấm men, được thực hiện bằng cách chiết xuất nội bào (loại bỏ vỏ tế bào), chúng được sử dụng như phụ gia thực phẩm, hương liệu, hoặc làm các chất dinh

dưỡng cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Hình 1.1 Chiết xuất nấm men dạng bột

Chiết xuất nấm men có rất nhiều ứng dụng trong thực phẩm, đặc biệt như là một chất tạo hương vị trong súp, nước chấm, snack, và thực phẩm ăn liền Với tính năng làm tăng mùi vị nó giúp làm giảm lượng muối cần thiết trong thực phẩm, điều này rất phù hợp với xu hướng sản xuất thực phẩm tốt cho sức khỏe hiện nay Hơn nữa chiết xuất nấm men chứa nucleotide tự nhiên còn có thể làm tăng hương vị và kích thích khẩu vị của những dạng thực phẩm ít béo

1.2.2 Nguyên liệu và cơ chế sản xuất

Bản chất của quá trình sản xuất ra men chiết xuất chính là quá trình phá vỡ tế bào nấm men bánh mì hay phế liệu nấm men bia để thu hỗn hợp nội bào gồm các chất như amino acid, nucleotide, chuỗi peptide, protein, đường, vitamin, và những hợp chất

có hương vị thơm ngon

1.2.2.1 Nguyên liệu

Nấm men dùng trong sản xuất chiết xuất nấm men thường là các chủng thuộc

giống Saccharomyces Chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi

trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin, peptide), vitamine và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa được tiến hành, đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển của nấm men

Các chủng nấm men có thể dùng để sản xuất chiết xuất nấm men:

Nấm men bánh mì (baker’s yeast):

Nấm men bánh mì tươi có khoảng 30-33% chất khô; 40-58% protein; 35-45% carbohydrate; 4-6% lipid và 5-7,5% chất khoáng và một số loại vitamin như vitamin nhóm B, tiền vitamin D

Nấm men bánh mì thương phẩm bao gồm các sản phẩm dạng lỏng, dạng cream, dạng ép và dạng men khô hoạt động và không hoạt động Nấm men bánh mì

là các loại nấm men thuộc chủng Saccharomyces cerevisiae, giàu protein, lysine và

vitamin nhóm B Men khô dạng hoạt động gồm các hạt tế bào men sống có năng lực lên men, còn men khô không hoạt động là dạng men chết, không có năng lực lên men thường dùng làm bột nhào trong quá trình làm bánh hay tạo hương vị cho bánh

Nấm men bia (brewer’s yeast):

Nấm men bia gồm hai chủng Saccharomyces được dùng là S uvarum (trước đây gọi là S carlsbergenis) và S cerevisiae

Nấm men bia cũng đã được nuôi cấy trên những môi trường đặc biệt để thu sinh khối giàu protein và vitamin B làm chất bổ sung dinh dưỡng cho người và động vật nuôi Đặc biệt khác với nấm men bánh mì, nấm men bia dinh dưỡng hay Torula, nấm men bia khá giàu crôm (vi khoáng cần để duy mức đường máu bình thường) và selen (vi khoáng có vai trò nâng cao năng lực miễn dịch) Vách tế bào nấm men bia còn có năng lực hấp phụ độc tố nấm mốc rất mạnh; ngày nay sản phẩm này đã được chế biến thành phụ gia vô hoạt độc tố nấm mốc trong thức ăn có hiệu quả và đã được thương mại hoá trên khắp thế giới

Nấm men bia dinh dƣỡng (nutritional brewer’s yeast):

Nấm men bia dinh dưỡng là những nấm men chết còn lại sau quá trình làm bia Sinh khối nấm men thu được từ ngành bia là rất lớn, cứ sản xuất 1.000 lít bia thì thu được 12kg nấm men sệt tương ứng với 1,5 kg nấm men khô trong đó chứa khoảng 700g protein Hàng năm, sản lượng bia của nước ta đạt khoảng 2,5-3,0 tỷ lít, với sản lượng này thì sinh khối nấm men khô thu được sẽ vào khoảng 3,500 – 4,000 tấn

Sinh khối nấm men thu được từ quá trình làm bia thường có vị đắng (do nhựa hoa Houblon bám trên tế bào nấm men) và có thành tế bào ở dạng bền vững (do liên kết peptido-glucan của vách tế bào nấm men) Do vậy để sử dụng sinh khối nấm men làm thực phẩm hay thức ăn chăn nuôi thì cần loại bỏ vị đắng và phá vỡ liên kết peptido-glucan thành tế bào

Ngoài ra, sinh khối nấm men loại này cũng giầu vitamin nhóm B và chất khoáng như Ca, P, K, Mg, Cu, Fe, Zn, Mn và Cr

Nấm men probiotic (probiotic yeast):

Probiotic là chế phẩm bổ sung tế bào vi khuẩn hay những thành phần của tế bào vi khuẩn có tác dụng làm cân bằng vi khuẩn đường ruột, nhờ vậy có lợi cho sức khoẻ động vật

Nấm men probiotic, như nấm thuộc chủng S boulardii, có vai trò ngăn chặn

và hạn chế sự hoạt động của vi khuẩn bệnh như E coli, Shigella và Samonella Đặc

biệt S boulardii là loại nấm probiotic an toàn, chịu nhiệt, có năng lực sống trong ống

tiêu hoá, kháng lại kháng sinh, phát triển nhanh trong một thời gian ngắn, không khu trú lâu dài trong đường ruột và dễ loại bỏ khỏi đường ruột khi không sử dụng Do

những ưu điểm này mà nấm S boulardii đã được dùng làm phụ gia probiotic trong chăn nuôi từ hơn 50 năm nay Các loại nấm men khác như S.cerevisiaes, Candida pintolopesii, C saitoana cũng đã được phép dùng làm phụ gia probiotic và cũng đã được dùng phổ biến trong chăn nuôi do có những tính chất tương tự như S boulardii

Nấm men Torula (Torula yeast):

Nấm men là nguồn protein đơn bào có nhiều ưu thế hơn so với nguồn protein truyền thống như đỗ tương, thịt và cá Nó không những giàu protein, thời gian tạo sinh khối nhanh, liên tục, không phụ thuộc vào thời tiết khí hậu mà còn có thể phát triển trên những nguyên liệu rẻ tiền như phụ phẩm của ngành mía đường, làm giấy, chế biến tinh bột và hoa quả…

Nấm Candida utilis được nuôi cấy trong môi trường mật rỉ đường hay phụ

phẩm của ngành giấy chứa hỗn hợp đường và chất khoáng Sau khi nuôi cấy, nấm men được thu hoạch, rửa, xử lý nhiệt và làm khô Xử lý nhiệt có vai trò vô hoạt men, tức là là làm mất năng lực lên men Sinh khối nấm men chứa hơn 50% protein, giàu lysine, threonine, acid glutamic, chất khoáng và vitamin (niacine, acid pantothenic và các vitamin B khác) Sinh khối nấm men Torula có hương vị của thịt đã được dùng làm phụ gia trong nhiều thực phẩm chế biến như gia vị, súp và nước sốt Nó cũng được dùng trong thực phẩm của người ăn chay, của trẻ nhỏ…

Sinh khối nấm men Torula là nguồn thức ăn tốt vì hàm lượng protein cao, protein lại dễ tiêu hoá (tỷ lệ tiêu hoá cao hơn bột thịt xương: 87% so với 70%)

Đặc biệt hơn, nấm men Torula còn chứa một hàm lượng cao nucleotide tạo cho sản phẩm có hương vị rất thơm ngon, nhưng hương vị lại dịu, không gắt, do vậy

nó là nguồn gia vị thực phẩm của người

Kết luận: Trong các chủng nấm men, mỗi chủng đều có những thành phần

có lợi, đều có thể được dùng để sản xuất chiết xuất nấm men Trong đề tài, đối tượng

chúng tôi chọn để sản xuất chiết xuất nấm men là nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae vì tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae rất giàu dinh dưỡng, nhất là

protein lysine và vitamin nhóm B, đồng thời chúng dễ nuôi cấy trong các điều kiện môi trường khác nhau, có khả năng tăng trưởng và phát triển nhanh

1.2.2.2 Cơ chế sản xuất [20]

Bước 1: Cung cấp glucose để tăng sinh khối tế bào

Nấm men là tế bào sống nên nó sẽ hấp thụ thức ăn chứa đường (đường, mạch nha, cao đường…) để tăng kích thước tế bào (tăng sinh khối) và sinh sản theo cấp số nhân bằng cách nảy chồi Để có được chiết xuất nấm men ta cần cung cấp lượng đường đủ để nấm men phát triển đến một mật độ cần thiết

Bước 2: Sử dụng các phương pháp phá vỡ tế bào

Khi nấm men đã đạt đến sự phát triển tối ưu và đạt mật độ cần thiết, nó được trải qua các quá trình xử lý khác nhau để phá vỡ thành tế bào như xử lý nhiệt, tự phân, sử dụng enzyme, hoặc các tác nhân vật lý, hóa học Do trong tế bào nấm men cũng chứa các enyme phân giải tế bào, nên chúng ta có thể tận dụng enzyme có sẵn trong nấm men và thêm một lượng enzym tự nhiên để bắt đầu quá trình phá vỡ tế bào, giải phóng các chất bên trong và phân giải chúng thành các hạt nhỏ hơn Cụ thể là các enzyme protease giúp chuyển đổi các protein của nấm men thành một hỗn hợp nhỏ hơn, giàu dinh dưỡng bao gồm các acid amin

Bước 3: Sấy khô và sẵn sàng cho sử dụng

Trong bước cuối cùng, thành phần không phân huỷ được bởi enzyme và không

có giá trị dinh dưỡng được tách ra từ phần còn lại của hợp chất bằng cách sử dụng máy ly tâm, phần này sẽ lắng lại dưới đáy ly tâm và được loại bỏ Hỗn hợp dinh dưỡng còn lại sau đó được sấy khô thành bột hoặc dạng sệt để có thể dễ dàng được vận chuyển đến các nhà sản xuất thực phẩm, và được sử dụng để làm phong phú thêm hương vị cho thực phẩm

1.2.3 Thành phần dinh dưỡng [11]

Chiết xuất nấm men là nội bào của tế bào nấm men, chúng gồm tế bào chất, nhân tế bào, các cơ quan tế bào và thường rất giàu acid amin, vitamin (vitamin B, Glutathione), cacbonhydrate và muối

Bảng 1.1: Thành phần chính của chiết xuất nấm men

Bảng 1.2: Thành phần các vitamine trong chiết xuất nấm men

1.2.4 Ứng dụng

- Chiết xuất nấm men được sản xuất hoàn toàn tự nhiên, không phải ghi nhãn E trên bao bì như các chất điều vị khác nên sản phẩm xuất khẩu có thể được đưa vào các thị trường khó tính nhất

- Có vị ngọt tự nhiên, dùng trong thực phẩm sẽ tạo vị ngon tự nhiên cho sản phẩm

- Được sản xuất từ men, không thuộc danh mục động vật nên hoàn toàn thích hợp với các sản phẩm chay, các sản phẩm tự nhiên cho người muốn giữ gìn và nâng cao sức khỏe

- Cung cấp các nguồn dinh dưỡng rất tốt cho cơ thể

- Chiết xuất nấm men có khả năng điều hòa các vị khác như ngọt đường, mặn, chua… khiến cho các vị này trở nên hòa hợp với nhau hơn, tạo cảm giác rất ngon miệng

- Có thể ứng dụng rất rộng rãi vào công nghiệp thực phẩm như mì ăn liền, sản phẩm thịt, sản phẩm nước chấm, bánh snack, trong chế biến thức ăn nhà hàng khách sạn

 Kết luận

Theo xu hướng hiện nay, các nhà sản xuất thực phẩm đang tìm kiếm sản phẩm dùng để thay thế một phần tỉ lệ bột ngọt trong sản phẩm hoặc thay thế hoàn toàn bột ngọt Sản phẩm thay thế phải thỏa mãn một số điều kiện: vị umami đậm đà và hậu vị lâu hơn, sản phẩm phải được sản xuất tự nhiên hơn, giá cả hợp lý,… Vì vậy chiết xuất nấm men là một giải pháp hoàn hảo với quy trình nghiên cứu đơn giản và kinh tế như sau: Từ sinh khối tế bào nấm men ban đầu  tạo các điều kiện thích hợp cho enzyme trong tế bào hoạt động phá vỡ vách tế bào  từ đó tiến hành ly tâm thu hỗn hợp chiết xuất nấm men

Và trong quy trình sản xuất chiết xuất nấm men, giai đoạn phá vỡ vách tế bào là một trong những giai đoạn quan trọng Do đó, việc đầu tiên là cần tìm hiểu về nấm men, đặc biệt là các điều kiện dinh dưỡng và cấu tạo vách tế bào, được thể hiện qua phần tổng quan về nấm men sau

1.3 Tổng quan về nấm men [1]

1.3.1 Lịch sử nấm men

Nấm men được con người sử dụng từ rất lâu, trước khi chữ viết ra đời Những chữ viết tượng hình cổ xưa cho thấy người Ai Cập cổ xưa đã sử dụng nấm men cho lên men rượu từ cách đây hơn 5000 năm Tuy nhiên vào thời đó con người chưa hiểu được

cơ chế sinh học của quá trình lên men, thậm chí người Ai Cập cổ xưa cho rằng đó là một hiện tượng siêu nhiên

Người ta cho rằng quy trình lên men rượu là do sự nhiễm vi sinh vật tự nhiên vào bột, ngũ cốc và từ trái cây có chứa đường Quần thể vi sinh vật bao gồm nấm men và

vi khuẩn lên men lactic được tìm thấy trên đại mạch và trái cây

Mãi cho đến khi kính hiển vi ra đời, nấm men đã được định nghĩa là một sinh vật sống và là tác nhân của quá trình lên men rượu Một thời gian ngắn sau khám phá này người ta đã có thể nuôi nấm men trong môi trường thuần khiết Vào đầu thế kỉ 20 con người đã sản xuất được nấm men thương mại

1.3.2 Phân loại nấm men

Loài: Saccharomyces cerevisiae

1.3.3 Cấu tạo và thành phần hóa học

1.3.3.1 Cấu tạo

Tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ những thành phần cơ bản sau:

 Vách tế bào

Tùy thuộc vào điều kiện phát triển của môi trường mà trọng lượng khô của vách

tế bào chiếm khoảng 10-25%

Vách tế bào nấm men chứa chủ yếu là glucan, mannan, lipid, protein và một lượng nhỏ chitin

Bảng 1.4: Các thành phần của vách tế bào nấm men Thành phần

(mức độ polymer hóa) Khối lƣợng phân tử

% khối lƣợng vách tế bào Tỷ lệ

Vách tế bào nấm men là một cấu trúc 2 lớp Lớp trong gồm glucan và chitin Lớp này chứa 80-90% là các chuỗi beta-(1,3)-glucan và vài nhánh beta-(1,6)-glucan, chitin chỉ chiếm một phần rất nhỏ từ 1-2% nhưng có vai trò rất quan trọng, có tác dụng giúp tạo nên độ cứng cơ học, độ đàn hồi cho tế bào, và tạo nên tính không thấm của các cấu trúc dạng sợi Lớp bên ngoài là một hàng rào với mannoprotein được glycosyl hóa cao

có chức năng bảo vệ lớp glucan khỏi những enzyme phân hủy

Những thành phần của vách tế bào liên kết với nhau tạo thành một phức hợp đại phân tử, tập hợp chúng lại thành vách tế bào nguyên vẹn

 Cấu trúc beta-(1,3)-glucan

Là thành phần polysaccharide chủ yếu của vách tế bào của tất cả các loại nấm, nó

có ảnh hưởng đến cấu trúc hóa học, chức năng lý hóa và sinh tổng hợp của tế bào Beta-(1,3)-glucan hiện diện trong hầu hết vách tế bào của các loại nấm trừ Zygomycetes Sự hiện diện của beta-(1,3)-glucan trong vách tế bào nấm men

S.cerevisiae được biết đến khá sớm từ những năm 1950, nhưng phải mất khoảng 16

năm để xác định được cấu trúc hóa học của nó, cụ thể là beta-(1,3)-glucan có mạch nhánh beta-(1,6)-glucan

Mức độ polymer hóa được ước lượng khoảng 1500 Gawronski (1999) nghiên cứu về cấu trúc của beta-(1,3)-glucan đã nhận thấy rằng phân tử beta-(1,3)-glucan có một mạch chính gồm các liên kết tại vị trí (1,3) và thỉnh thoảng phân nhánh tại vị trí C6

Phân tử beta-(1,3)-glucan có thể tạo thành cấu trúc xoắn Cấu trúc xoắn này có thể do một chuỗi đơn tạo thành-gọi là xoắn đơn, hoặc do ba chuỗi liên kết với nhau tạo thành xoắn ba

Beta-(1,3)-glucan synthase là một enzyme định vị trên màng plasma xúc tác sự tổng hợp beta-(1,3)-glucan Beta-(1,3)-glucan mới được tổng hợp rất dễ dàng để khuếch tán ra khoảng không ngoại bào thông qua các lỗ trên màng plasma

 Cấu trúc beta-(1,6)-glucan

Dạng thứ hai của beta-glucan được tìm thấy trong phần lớn vách tế bào nấm men

là polysaccharide phân nhánh tại vị trí C6 trên chuỗi beta-(1,3)-glucan Tùy từng loại

nấm mà chuỗi nhánh này hiện diện với hàm lượng khác nhau Ví dụ trong S.cerevisiae mạch nhánh chiếm khoảng 5% trong tổng số polysaccharide, 20% trong C.albicans

Beta-(1,6)-glucan hoạt động như chất keo kết dính bằng cách tạo ra những liên kết giữa beta-(1,3)-glucan, chitin đến những protein của vách tế bào

 Chitin

Chitin là một chuỗi thẳng của các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết (1,4), nó là thành phần trong vách tế bào của các loại nấm, có loại nấm men mà chitin chiếm đến 60%

Trong S.cereviciae, chitin hiện diện chỉ khoảng 2% (w/w) so với tổng lượng vách

tế bào Chitin chủ yếu tập trung ở vị trí nảy chồi của nấm men, chitin cũng có mặt trong vách tế bào, liên kết cộng hóa trị với beta-(1,3)-glucan và beta-(1,6)-glucan

Sử dụng phương pháp tinh thể học tia X cho thấy có ba dạng chitin là alpha, beta, lamda; dạng alpha là dạng được tìm thấy trong các loài nấm Cấu trúc của alpha-chitin tương tự như cấu trúc của cellulose với các chuỗi N-acetylglucosamine đối kháng song song liên kết nhau bằng liên kết hydro Liên kết hydro gắn kết các nhóm amine giúp

làm tăng độ bền của tinh thể Những liên kết này cùng với nhóm methyl acetamide giúp ngăn chặn sự xâm chiếm của nước và sự hòa tan của các tinh thể

 Mannoprotein

Mannoprotein là polymer của đường mannose liên kết cộng hóa trị với protein-là những protein có kích thước khoảng 100kDa- được gắn kết với beta-(1,6)-D-glucan thông qua eo glycosylphosphatidylinositol GPI

Mannoprotein đóng vai trò quan trọng trong tính thấm của tế bào

 Chất nguyên sinh

Khi tế bào còn non, chất nguyên sinh là đồng nhất và độ nhớt thấp hơn so với tế bào trưởng thành Ở tế bào già, tế bào chất không đồng nhất do xuất hiện không bào và các cơ quan khác

 Nhân tế bào

Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men đã có nhân thực Nhân thường có hình bầu dục hay hình tròn nằm gần không bào trung tâm với kích thước 1 – 2 μm Nhân được bao bọc bởi màng nhân, bên trong là một lớp dịch nhân chứa hạch nhân hay còn gọi là nhân con Nhân của tế bào nấm men chứa protein, acid nucleic, nhiều hệ men và các ribosome

1.3.3.2 Thành phần hóa học

Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước chiếm 75% khối lượng chung

Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau

1.3.4 Sự sinh trường và phát triển của Saccharomyces cerevisiae

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn

Hình 1.2: Sự phát triển của nấm men

 Giai đoạn thích nghi

Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trường đến lúc chúng bắt đầu sinh sản

Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trường mới Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái và sinh lý, kích thước tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bên ngoài Số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể

 Giai đoạn logarit

Số lượng và sinh khối tế bào trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân Khả năng thích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trường ngoài tăng lên rõ rệt, đồng thời xuất hiện chức năng lên men rượu Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lượng sinh sản, thời gian nảy chồi, nhưng không nên đánh giá kích thước của tế bào cũng như những dấu hiệu khác của khuẩn lạc Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thường nhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thước của tế bào có phần nhỏ đi

 Giai đoạn thoái hóa

Số lượng tế bào giảm xuống do có hiện tượng tiêu hủy Lượng protein và acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến Như vậy có thể thấy

số lượng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lượng tế bào ở giai đoạn này lớn

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men

1.3.6 [10] [11]

1.3.6.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn carbohydrate, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin

Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trước tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacaride thành các dạng đường

mà nấm men đồng hóa được

Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trường mà nguồn

carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trường đường với nguồn nguyên liệu được nấu chín thì tốt hơn Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trường đường và môi trường tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt

Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường cám, số lượng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy

Môi trường rỉ đường hoặc dung dịch đường được acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dưỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 30°C, lượng sinh khối thu được khoảng 25 – 50 g/l

Môi trường nước chiết giá đậu 3% cũng được sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lượng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trưởng khác

Tuy nhiên, vitamin C trong nước chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men

1.3.6.2 Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển

của chúng Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 33 – 35ºC, trên 43ºC và

dưới 28ºC thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn Ở 30ºC, nấm men

hoang dại phát triển nhanh hơn S cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 – 38ºC chúng phát triển

nhanh hơn 6 – 8 lần Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt

độ thấp khoảng 20 – 23ºC, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn

1.3.6.3 pH môi trường

pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6 Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6

1.3.6.4 Tốc độ sục khí và khuấy trộn

Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của tế bào nấm men Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy được hoà tan vào môi trường nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong

tế bào

chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là được nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trường

Khi nuôi cấy nấm men ở quy mô công nghiệp, kích thước của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hưởng gián tiếp lên sự tăng trưởng của nấm men

1.3.7 Các phương pháp phá vỡ tế bào nấm men [1]

Bản chất của quá trình tự phân nấm men chính là quá trình phá vỡ màng tế bào,

do đó, muốn thu được hàm lượng chất dinh dưỡng cao từ nội bào thì phương pháp thực hiện là một yếu tố quan trọng

Như chúng ta đã biết, các thành phần bên trong tế bào được ngăn cách với môi trường bên ngoài bởi một cấu trúc vững chắc gọi là màng tế bào Màng này cung cấp một sức mạnh cơ học cho tế bào và bảo vệ tế bào khỏi các tác động bên ngoài Khả năng co giãn của tế bào giúp chống lại áp suất thẩm thấu ở bên ngoài tế bào

Về mặt ứng dụng, những vật chất sinh học như protein,acid amin, enzyme được chiết rút từ tế bào và được tinh sạch để phục vụ cho nghiên cứu sinh học hoặc sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm thì trước hết chúng phải được giải phóng ra khỏi tế bào Như vậy việc phá vỡ tế bào là bước đầu tiên cho sự thu nhận các sản phẩm nội bào, cung cấp cho những quy trình tiếp theo Đó cũng chính là bước quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm

Như vậy mục đích của việc phá vỡ tế bào là:

- Thu nhận một lượng lớn sản phẩm nội bào mong muốn nhưng vẫn duy trì hoạt động của sản phẩm ở mức độ cao nhất

- Phương pháp đông lạnh – rã đông

- Phương pháp gây sốc thẩm thấu

- Phương pháp sử dụng nitơ lỏng

- Tự phân có bổ sung enzyme

 Kết hợp giữa các phương pháp trên

Phương pháp này được sử dụng từ lâu để phá vỡ tế bào vi sinh vật Đây cũng là phương pháp được lựa chọn đầu tiên khi cần phá vỡ bào tử, tế bào nấm men, tế bào nấm; nó cũng được dùng để phá vỡ tế bào vi tảo

Kích thước của hạt nghiền cũng rất quan trọng, qua một số nghiên cứu người ta nhận thấy rằng kích thước hạt nghiền tối ưu cho vi khuẩn là 0,1mm, 0,5mm đối với nấm men, nấm sợi, vi tảo, 1-2,5mm dành cho các mô như mô não, mô cơ, gan và da Tốc độ phá tế bào sẽ tăng 50% nếu sử dụng hạt nghiền là zirconium thay vì là hạt thủy tinh, vì do tỷ trọng của chúng nặng hơn Đối với các loại mô dai, cần sử dụng các hạt nghiền làm từ hỗn hợp crom-thép, vì tỷ trọng của chúng nặng hơn thủy tinh 5 lần Thông thường lượng hạt nghiền tỷ lệ thuận với tốc độ phá tế bào

Đây là phương pháp thô sơ nhất trong các phương pháp phá vỡ tế bào

Phương pháp này có một số bất lợi sau:

- Hiệu suất không cao

- Hạn chế đối với khối lượng mẫu lớn

- Thay đổi độ tinh sạch của sản phẩm

Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Phương pháp này đã được các nhà khoa học sử dụng từ rất lâu để thu nhận chế phẩm enzyme

Buchner (1897) nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh để thu nhận chế phẩm enzyme

Macfadyen và Rowlanat (1901) phá hủy tế bào gây bệnh thương hàn bằng cách nghiền với bạc

Stevens và West (1992) nghiền Streptococcus với vụn thủy tinh để thu chế phẩm

lipase, invertase, và peptase

Lee và cộng sự (1942) nghiền Azotobacter vinelandii để thu chế phẩm enzyme

dehydrogenase…

Đống Thị Anh Đào, Nguyễn Đức Lượng, Lê Văn Nhương, Yumi Yoshikawa, Kanji matsumoto (1999) đã sử dụng các phương pháp nghiền khác nhau (như nghiền

bi, nghiền cao áp,…) cho tế bào nấm men để thu nhận enzyme Superoxide Dismutase – là enzyme oxy hóa khử [5]

1.3.7.2 Phương pháp vật lý

Phương pháp sử dụng sóng siêu âm

 Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng sóng âm thanh với tần số cao để phá vỡ tế bào Sóng

âm thanh được tạo ra và được truyền đến mẫu nhờ một đầu dò bằng kim loại đặt trong mẫu, áp lực sóng gây ra sự tạo thành các vi bọt Những vi bọt này lớn lên và bùng nổ mạnh Sự bùng nổ này tạo ra sốc sóng đủ năng lượng để phá màng tế bào, thậm chí cả những liên kết cộng hóa trị

 Thuận lợi của phương pháp này là:

- Có thể tiến hành phá nhiều mẫu có thể tích nhỏ cùng lúc

- Những tế bào khó phá vỡ (như bào tử) cũng có thể được phá vỡ

 Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số bất lợi:

- Nhiệt độ nước tạo ra trong quá trình phá mẫu Có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách luôn giữ lạnh hệ thống trong suốt quá trình phá mẫu

- Độ ồn cao Hầu hết các thiết bị sử dụng sóng siêu âm đều yêu cầu người vận hành phải bảo vệ tai

- Có khả năng gây biến đổi sản phẩm, do sự xuất hiện của các gốc tự do trong quá trình phá mẫu và những gốc tự do này có thể phản ứng với hầu hết các phân

tử sinh học

- Giá thành cao

Phương pháp gây sốc thẩm thấu

 Định nghĩa:

Sốc thẩm thấu xảy ra khi nồng độ muối, cơ chất hay bất kỳ một chất hòa tan nào

ở môi trường ngoài cao hơn nhiều so với bên trong tế bào, làm cho nước từ trong tế bào thoát ra ngoài

Dựa vào nguyên tắc đó ta có thể áp dụng để phá vỡ tế bào Đầu tiên ta cho tế bào vào môi trường có nồng độ muối hay đường cao, sau đó nhanh chóng pha loãng môi

trường với nước Ngay lập tức sự gia tăng áp lực cao trong tế bào chất sẽ gây nguy hại cho màng tế bào, dẫn đến sự phá vỡ tế bào

Tuy nhiên phương pháp này không thích hợp cho những tế bào có vách cứng

Phương pháp đông lạnh – rã đông

Phương pháp đông lạnh – rã đông thường được sử dụng để phá vỡ tế bào vi khuẩn và tế bào động vật Kỹ thuật này làm đông lạnh tế bào trong tủ lạnh hoặc trong nước đá khô, sau đó tiến hành rã đông ở nhiệt độ phòng 37°C Phương pháp này làm tế bào bị trương phồng lên và cuối cùng bị phá vỡ bằng những tinh thể nước đá được tạo thành bên trong tế bào trong suốt quá trình đông lạnh, sau đó bị co lại trong quá trình

rã đông Sự lặp lại chu kỳ đông lạnh – rã đông sẽ có hiệu quả trong việc phá vỡ tế bào Tuy nhiên, phương pháp này không phá vỡ tế bào một cách có hiệu quả, bởi vì còn tùy thuộc vào cấu trúc màng tế bào, nhưng có thể sử dụng kỹ thuật này để tiền xử

lý tế bào – làm cho tế bào yếu đi – trước những xử lý tiếp theo

Phương pháp sử dụng nitơ lỏng

 Nguyên tắc:

C, có khả năng gây tê cóng nhanh khi tiếp xúc với mô sống Nitơ lỏng phải được giữ trong những thiết

bị chuyên dụng như bình chân không

Khi cho tế bào tiếp xúc với nitơ lỏng, sự tạo thành những tinh thể nước đá bên trong tế bào và sát bên ngoài tế bào xảy ra, sẽ gây tổn thương cơ học lên màng tế bào

và các bào quan bên trong tế bào

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước

Avery và Cullen (1920) thu nhận chế phẩm enzyme từ Pneumococcus, dùng để

trình rã đông

Black (1951) thu chế phẩm enzyme aldehyde dehydrogenase từ nấm men bằng

C

Koespsell và Johnson (1942) đông lạnh sinh khối dạng paste của Clostridium butylicum trong 12 ngày để thu chế phẩm enzyme xúc tác cho quá trình lên men rượu

Lê Phương Thảo (2005) sử dụng nitơ lỏng kết hợp với nghiền cơ học để phá vỡ

tế bào nấm men thu chế phẩm enzyme

 Những ưu và khuyết điểm của phương pháp vật lý trên

- Đơn giản, dễ thực hiện

- Không cần qua quá trình xử lý cơ học mạnh

- Không gia tăng nhiệt độ trong suốt quá trình phá vỡ tế bào

Tuy nhiên cũng có những khuyết điểm :

- Thường không được áp dụng cho quy mô lớn

- Không thích hợp cho những tế bào có vách cứng (như phương pháp gây sốc thẩm thấu)

Sở dĩ chất tẩy có khả năng hòa tan protein màng tế bào là do có cấu trúc giống với lớp đôi lipid Dạng micelle của các phân tử chất tẩy có cấu trúc tương tự như lớp đôi màng sinh học, nên các phân tử protein có thể sát nhập vào trong các hạt micelle này thông qua các tương tác kị nước Những vùng kị nước của các protein màng – những protein được chèn vào trong lớp đôi lipid – sẽ được bao xung quanh bởi một lớp gồm các phân tử chất tẩy, phần ưa nước sẽ hướng ra môi trường nước Điều này giúp hòa tan protein màng

Sự hòa tan màng bởi chất tẩy gồm nhiều giai đoạn khác nhau Các monomer của chất tẩy sẽ gắn kết vào lớp đôi lipid của màng sinh học Ở nồng độ thấp – khi tỷ lệ chất tẩy : lipid màng ở khoảng 0,1 : 1 cho đến 1 : 1, lớp đôi lipid tương đối nguyên vẹn, nhưng sự hòa tan một số protein màng có thể xảy ra Khi gia tăng nồng độ lên đến khoảng 2 : 1, sự hòa tan màng xảy ra dẫn đến sự tạo thành các micelle hỗn hợp Các micelle này gồm nhiều dạng, có thể là hỗn hợp của phospholipid – chất tẩy, chất tẩy,

chất tẩy – protein, và lipid – chất tẩy – protein Ở tỷ lệ 10 : 1 tất cả những tương tác tự nhiên giữa lipid và protein bị chuyển đổi thành tương tác giữa chất tẩy và protein

 Lựa chọn chất tẩy cho việc phá vỡ tế bào

Không có một quy định nào chuẩn xác cho việc lựa chọn chất tẩy để làm tan tế bào Chất tẩy lý tưởng tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể Thông thường chất tẩy không ion là những chất tẩy nhẹ, có khả năng phá vỡ các tương tác lipid : lipid, lipid : protein, và không có khả năng phá vỡ tương tác protein : protein nên không gây biến tính protein, và giúp giữ lại được các chức năng của protein cũng như những tương tác protein : protein cho các phân tích enzyme hoặc thí nghiệm miễn dịch CHAPS – chất tẩy thuộc nhóm Zwitterion – và Triton X – chất tẩy không ion – thường được sử dụng cho mục đích trên Ngược lại, chất tẩy ion là một tác nhân tẩy mạnh, nó phá hủy tương tác protein : protein nên gây biến tính protein, do đó sẽ phá hủy hoạt tính và chức năng của protein

Việc lựa chọn chất tẩy còn tùy thuộc vào mẫu thí nghiệm Tế bào động vật, vi khuẩn, nấm men… đều có những yêu cầu rất khác nhau do sự hiện diện hay không hiện diện của vách tế bào

 Loại bỏ chất tẩy khỏi sản phẩm protein

Dựa vào đặc tính tự nhiên của chất tẩy, người ta đề xuất một vài phương pháp loại bỏ chất tẩy khỏi sản phẩm chiết rút :

Dựa trên tính kị nước : phương pháp này dựa trên khả năng tạo liên kết kị nước với resin của chất tẩy Chất hấp thụ là resin – kị nước, không tan trong nước – có thể được sử dụng để loại bỏ chất tẩy dư thừa Thông thường một dung dịch có chứa chất tẩy sẽ được trộn lẫn với resin Resin có gắn kết chất tẩy sẽ được loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc

Phương pháp sắc ký lọc gel : phương pháp này dựa trên sự khác nhau về kích thước của các hạt micelle hỗn hợp : protein – chất tẩy, chất tẩy –lipid, và các hạt micelle chất tẩy đơn thuần Trong hầu hết các trường hợp các hạt micelle protein – chất tẩy sẽ bị giữ lại trong các lỗ

Phương pháp dialyse :

Các chất có khối lượng phân tử nhỏ sẽ được lọc qua màng bán thấm, nếu khối lượng phân tử lớn sẽ được giữ lại trên màng

Phương pháp sắc ký trao đổi ion :

Phương pháp này lợi dụng sự khác nhau về điện tích giữa các hạt micelle hỗn hợp protein – chất tẩy và các hạt micelle chất tẩy đơn thuần Khi những chất tẩy không ion được sử dụng, ta có thể chọn các điều kiện để các hạt micelle chứa protein được hấp thụ lên cột, trong khi đó những hạt micelle không chứa protein sẽ xuyên qua cột, không bị giữ lại

Các protein bị giữ lại trên cột sẽ được rửa giải bằng dung dịch đệm không chứa chất tẩy, có cường độ ion mạnh hơn

Phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ

 Nguyên tắc :

Những hợp chất ưu lipid này (toluene, ether, phenylether alcohol,ethanol, methanol, chloroform…) có khả năng liên kết kị nước với lớp đôi phospholipid của màng tế bào Sự gắn kết này làm giãn nở màng, làm thay đổi liên kết của màng, thậm chí có thể dẫn đến sự trương phồng của lớp đôi phospholipid Hơn nữa, sự chèn vào của các dung môi này phá vỡ tương tác giữa lipid và protein, làm ảnh hưởng lên chức năng của màng sinh học

Phương pháp sử dụng tác nhân chaotrope :

 Nguyên tắc :

Tác nhân chaoptrope (urea, quanidien…) có khả năng phá vỡ cấu trúc của nước

và làm giảm tính ổn định của protein bằng cách phơi bày các nhóm kị nước ra môi trường và phá vỡ các tương tác hydro để duy trì cấu trúc bậc 2 của phân tử protein cho phép hòa tan dễ dàng phân tử protein, dẫn đến phá vỡ màng tế bào, giải phóng thành phần tế bào

 Các nghiên cứu trong và ngoài nước :

Tobias Von der Haar (United Kingdom) phá tế bào bằng cách ngâm trong NaOH

có chứa 2-Mercaptoethanol và SDS để thu protein

1.3.7.4 Phương pháp sinh học

Phương pháp tự phân

 Định nghĩa : « Autolyse » - tự phân – có nghĩa là tự phân hủy Khi tế bào chết,

sự tự phân hủy và phá vỡ màng tế bào xảy ra bằng chính những enzyme trong tế bào, giải phóng những thành phần tế bào chất ra môi trường như acid amine, peptide, polypeptide, acid béo, vitamine, acid nucleic…

 Quá trình tự phân hủy của nấm men gồm hai giai đoạn :

Sự phân hủy những cấu trúc tế bào, chủ yếu được cấu tạo từ protein, do quá trình proteolyse

Sự phá hủy vách tế bào

Tế bào nấm men có chứa một lượng lớn các enzyme thủy phân protein, những enzyme này thường tập trung trong không bào Khi tế bào chết, các enzyme này được giải phóng ra khỏi không bào và tiếp xúc với những cơ chất của nó Những enzyme thuộc nhóm protease sẽ thủy phân các liên kết peptide và phá vỡ cấu trúc protein tạo thành các peptide và acid amine

Vách tế bào là một lớp vách cứng bao bên ngoài tế bào Có nhiều enzyme liên kết với màng tế bào, những enzyme này tham gia phá hủy các cấu trúc ngoại bào và phá vỡ vách tế bào

Vách tế bào chiếm khoảng 15 – 20% trọng lượng khô của tế bào, vách tế bào chứng khoảng 80 – 90% polysaccharide, cùng với một lượng nhỏ protein và lipid Polysaccharide chủ yếu là mannan, glucan, và một lượng nhỏ chitin Mannan liên kết với protein – gọi là mannaprotein – là thành phần cấu trúc quan trọng của vách tế bào Các enzyme như glucanase, protease đóng vai trò quan trọng trong sự phân hủy cấu trúc vách tế bào Dẫn đến kết quả là vách tế bào sẽ bị thủng lỗ, hỗn hợp mannan, glucan, protein và những oligosaccharide có liên kết (1,6) sẽ được giải phóng ra môi trường