Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

Chitosan có độ deacetyl trung bình 75 – 85% có thể được ứng dụng làm màng bao trong bảo quản các loại thực phẩm nhưng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa kém hơn chitosan có

LỜI CẢM ƠN

Trải qua 3 tháng cùng với sự nỗ lực hết mình và được sự giúp đỡ từ nhiều phía, tôi đã hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp của mình Qua đây tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm

và các thầy cô đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy, trang bị cho tôi những kiến thức trong suốt thời gian học tập tại trường

PGS.TS Trang Sĩ Trung, Th.S Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô giáo phụ trách tại các phòng thí nghiệm – Trung tâm thí nghiệm thực hành đã tạo điều kiện cho tôi về hóa chất và trang thiết bị thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình và các bạn lớp 54TP2, các bạn cùng thực hiện nghiên cứu trên phòng thí nghiệm đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian vừa qua

Khánh Hòa, tháng 6 năm 2016 Sinh viên thực hiện

Trần Thị Thúy Hằng

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC VIẾT TẮT vi

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng 4

1.1.1 Tính chất của chitosan 6

1.1.2 Ứng dụng của chitosan 10

1.2 Quy trình sản xuất chitosan 12

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất chitosan 14

1.2.2 Ảnh hưởng của độ Deacetyl đến tính chất và ứng dụng của Chitosan 16

1.2.2.1 Ảnh hưởng của độ deacetyl đến tính chất của chitosan 16

1.2.2.2 Ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng ứng dụng của chitosan 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 19

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết 20

2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 1 20

2.2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 2 24

2.2.3.Các phương pháp phân tích 25

2.2.3.1 Xác định độ ẩm và hàm lượng khoáng[14] (phụ lục 3) 25

2.2.3.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp microbiuret[14] (phụ lục 3) 25

2.2.3.3 Xác định độ nhớt của chitosan bằng máy đo độ nhớt Brookfiel[22] (phụ lục 3) 25

2.2.3.4 Xác định độ deacetyl (DD) (Tao và cộng sự) (phụ lục 3) 25 2.2.3.5 Xác định trong lượng phân tử theo phương pháp đo độ nhớt nội (phụ lục 3) 25

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Kết quả chất lượng chitin ban đầu 26

3.2 Kết quả nghiên cứu điều kiện Deacetyl lần 1 26

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến DD của chitosan 26

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến DD của chitosan 29

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến DD của chitosan 31

3.3 Kết quả nghiên cứu điều kiện deacetyl lần 2 33

3.4 Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl > 90% 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung và cộng

sự, 2006) 6

Bảng 1.2 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan 8

Bảng 1.3 Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học 13

Bảng 2.1 Tính chất của chitin 19

Bảng 3.1 Kết quả chất lượng chitin ban đầu 26

Bảng 3.2 Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan 27

Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan 30

Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan 32

Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan 36

Bảng 3.6 Kết quả chất lượng chitosan sau 2 lần deacetyl 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitosan 5 Hình 1.2 Quá trình Deacetyl 13 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 20 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH

đến độ deacetyl của chitosan 21

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ

deacetyl của chitosan 22

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ

deacetyl của chitosan 23

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ

deacetyl của chitosan 24

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl (DD) và phân tử

lượng (Mw) của chitosan 27

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân tử

lượng (Mw) của chitosan 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân

tử lượng (Mw) của chitosan 31

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến DD của chitosan 34 Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến phân tử lượng của

chitosan 35

Hình 3.6 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ Deacetyl >90% 37

LỜI MỞ ĐẦU

Chitosan là một polymer sinh học, có nhiều ứng dụng trong công nghiệp

và cuộc sống, đặc biệt là trong chế biến và bảo quản thực phẩm Khi chế biến những loài thủy sản giáp xác (tôm, cua), lượng chất thải (có chứa chitin) chiếm tới 50% nguyên liệu đầu vào và con số trên thế giới là 5,11 triệu tấn/năm (theo

trường, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của con người và thiên nhiên Tuy nhiên, đây lại là nguồn nguyên liệu chính trong sản xuất chitosan Vì vậy, ứng dụng chitosan vào trong bảo quản nguyên liệu, bán thành phẩm nhằm thúc đẩy ngành công nghệ sản xuất chitosan phát triển, tăng giá trị sản phẩm, làm giảm

ô nhiễm môi trường do phế thải trong quá trình chế biến các sản phẩm thủy sản giáp xác, đồng thời làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm Ở nước ta sản phẩm tôm đông lạnh chiếm một sản lượng rất lớn (theo ước tính ở nước ta chỉ riêng tôm nuôi đã có khoảng hơn 1 triệu ha diện tích với năng suất bình quân 1 – 1,5 tấn/ha), chính vì vậy vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan

Tính cấp thiết của đề tài:

Qua khảo sát và tìm hiểu nhiều tài liệu nghiên cứu thấy được chitosan có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, tuy nhiên khả năng ứng dụng của chitosan còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có mức độ deacetyl của chitosan Mức độ deacetyl của chitosan có ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng ứng dụng của chitosan đặc biệt là chitosan có độ deacetyl cao Theo nhiều nghiên cứu cho biết chitosan có độ deacetyl cao có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa rất tốt Theo Dương và cộng sự (2009), chitosan

có độ deacetyl càng cao, nồng độ dung dịch càng cao thì khả năng tiêu diệt VSV tổng số càng lớn Bên cạnh đó, thực phẩm ta dùng hằng ngày như cá, thịt,

trái cây,… có thể nói rất dễ bị hư hỏng bởi sự xâm nhập của các loại vi khuẩn,

dễ bị oxy hóa bởi không khí khi ta chỉ bảo quản ở các điều kiện thông thường, thời gian bảo quản lại ít, do đó việc bổ sung chất bảo quản nhằm giảm thiểu hư hỏng đối với các nguyên liệu thực phẩm đang được rất nhiều người quan tâm Tuy nhiên, hiện nay với sự phát triển của khoa học, việc lạm dụng hóa chất bảo quản vào trong thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm, và việc sử dụng chất bảo quản vào trong thực phẩm là một vấn đề rất nhạy cảm, như là “con dao hai lưỡi” và rất tốn kém Dựa vào sự tạo màng và khả năng kháng khuẩn của chitosan ta có thể sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm mà không gây hại đến người tiêu dùng và kéo dài thời gian bảo quản Chitosan có độ deacetyl trung bình 75 – 85% có thể được ứng dụng làm màng bao trong bảo quản các loại thực phẩm nhưng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa kém hơn chitosan có độ deacetyl cao với một số loại thực phẩm dễ bị hư hỏng bởi vi khuẩn, vì vậy cần phải sản xuất ra chitosan có độ deacetyl cao để nâng cao khả năng ứng dụng vào thực phẩm, đảm bảo thực phẩm sạch và an toàn Vấn đề được đặt ra ở đây là làm thế nào để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao để đáp ứng nhu cầu trên? Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nha Trang, tôi xin thực

hiện đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao” để

phục vụ trong bảo quản thực phẩm

Mục tiêu của đề tài

Xác định được các điều kiện deacetyl thích hợp nhất để tạo ra sản phẩm chitosan có DD cao

Tính mới của đề tài

Hiện nay trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về chitosan, tuy nhiên có ít tài liệu nghiên cứu để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao, và chưa có công bố chính thức về quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ khử acetyl và thời gian khử acetyl của chitosan trong quá trình deacetyl lần 1

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử acetyl của chitosan trong quá trình deacetyl lần 2

- Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng

Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-1,4-D-glucosamine, hay còn gọi là Poly-β-1,4-2-amino-2-deoxy-D-glucose Qua đây ta thấy chitosan là một polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β-D Glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid[5, 6, 10, 12], là dẫn xuất của chitin sau khi đã được deacetyl, có cấu trúc mạch thẳng, được hình thành từ hai monomer

là N-acetyl-glucosamine (GlcNAc – tiểu phần A) và glucosamine (GlcN – tiểu phần D), với một tỷ lệ phần trăm thấp hơn của tiểu phần A (0 – 40%) Trong tự nhiên, chitosan tồn tại trong vách tế bào của các loài nấm nhưng với một tỷ lệ thấp hơn đáng kể so với chitin Chitosan là tên gọi chung của các polymer là dẫn xuất từ chitin với độ deacetyl (DD) trên 60% Tùy thuộc vào mức độ deacetyl, hàm lượng nitơ trong chitosan sẽ dao động từ 7-9,5% và chitosan sẽ

có sự khác nhau về hoạt tính sinh học, tính chất lưu biến ngoại trừ tính chất chung là đều có thể tan trong dung dịch acid hữu cơ có pH thấp hơn 6,0 như acid acetic, acid formic, acid lactic, acid citric[8]

thí nghiệm đều chứng tỏ chitosan với DD cao thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng làm sạch nước hiệu quả Điều này có thể được giải thích là do sự tăng lên

về khả năng ion hóa và tạo phức của chitosan[4]

năng kháng khuẩn lớn hơn Đồng thời độ DD lớn thì sự tạo phức với nhóm

tăng khả năng ức chế sự phát triển của VSV do sự mất cân bằng Theo kết quả của Lê Tùng Dương (2009), ứng dụng chitosan trong bảo quản cá Đổng Quéo thì với chitosan có nồng độ càng cao, độ DD càng lớn thì khả năng tiêu diệt vi

sinh vật càng mạnh và ngược lại Cụ thể với CTS có DD = 95%, nồng độ 2% thì tiêu diệt được 90,21%, trong khi đó CTS với DD = 85% tiêu diệt được 88,345%; CTS với DD = 75% tiêu diệt được 87,31% VSV tổng số[7]

Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan mạch ngắn, khối lượng phân tử thấp,

độ deacetyl cao có hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan được sản xuất theo quy trình thông thường Một trong số những tính chất đó là hoạt tính chống oxy hóa[1]

Một số tài liệu cho rằng độ deacetyl trong khoảng 55% – 70% gọi là mức

độ deacetyl thấp, khoảng 70% – 80% gọi là mức độ deacetyl trung bình và 85% – 95% được gọi là mức độ deacetyl cao của chitosan[25] Còn có tài liệu cho thấy độ deacetyl thấp nhất tương ứng với chitosan có độ deacetyl dao động từ 40% đến 60% Phần lớn các mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình

từ 70% đến 90% Đối với một số ứng dụng sinh học đặc biệt, chitosan có độ deacetyl cao trên 95% (Tolaimatea et al., 2003)[21]

Công thức cấu tạo của chitosan:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitosan

Công thức phân tử: (C 6 H 11 O 4N)n

1.1.1 Tính chất của chitosan

Độ deacetyl của chitosan

Quá trình deacetyl là quá trình tách nhóm acetyl ra khỏi phân tử chitin

DD là thông số quan trọng, đặc trưng cho tỉ lệ giữa glucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin và chitosan Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino[1]

2-acetamido-2-deoxy-D-Tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn Tương tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao Cụ thể, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên 90% Tuy nhiên, khả năng hút nước của chitosan thì giảm đi khi tăng độ deacetyl Kết quả nghiên cứu của Trung và công sự (2006) cho thấy khả năng hút nước của chitosan có độ deacetyl hóa thấp (75%) đạt đến 659% cao hơn nhiều so với chitosan có độ deacetyl hóa cao chỉ đạt 486% (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung

Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật Thông thường, phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và cộng sự, 1997) Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện deacetyl và thường rất khó kiểm soát Chitosan có phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học Chitosan có phân tử lượng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30 – 200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000 – 4000 cps Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ[1]

Tính tan của chitosan

Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic pKa (hằng số phân ly) của chitosan có giá trị

từ 6,2 đến 6,8 Khi hòa tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương Đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharite tự nhiên tích điện âm Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm Chitosan có DD càng cao thì khả năng tan càng tốt Một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan được trình bày ở Bảng 1.2 Chitosan không hòa tan trong nước, kiềm, cồn[1]

Bảng 1.2 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan

Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan

Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn Gram âm,

vi khuẩn Gram dương và vi nấm Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào DD và Mw So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trí C thứ ở pH nhỏ hơn 6

Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt Chitosan có Mw ≤ 2000 dalton thì khả năng ức chế vi sinh vật kém Chitosan có Mw ≥ 9000 dalton thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao (Jeon và cộng sự, 2000) Tuy nhiên, chitosan có phân tử lớn thì khả năng kháng khuẩn cũng thấp

Chitosan được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm Chitosan có khả năng

ức chế Staphylococus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus

Dung môi Nồng độ thường sử dụng (%)

stolonifer, Aspergillus niger Nồng độ ức chế của chitosan phụ thuộc vào loại

chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5% Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1 – 5 mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và cộng sự, 1999)[1,

13]

Khả năng tạo màng của chitosan

Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt Tính chất cơ lý của màng chitosan như độ chịu kéo, độ rắn, độ ngấm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và

độ deacetyl hóa của chitosan[1]

Chitosan có độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn cao hơn màng chitosan độ deacetyl thấp, tuy nhiên chúng có độ trương nở thấp hơn (Phụ lục 1, Bảng 1)

Các tính chất khác của chitosan:

Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao Hơn nữa, chitosan có thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất màu Do chitosan không tan trong nước nên chitosan ổn định hơn trong môi trường nước so với các polymer tan trong nước như alginate, agar Khả năng tạo phức, hấp phụ với lipid, protein và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến động lớn với các mẫu chitosan (Bảng 1.5) Chitosan có độ deacetyl cao thường hấp phụ màu tốt

Chitosan phản ứng với acid đậm đặc hình thành muối khó tan Chitosan phản ứng với iod và các acid sulfuric cho phản ứng màu tím nên người ta dùng

để phân tích định tính

1.1.2 Ứng dụng của chitosan

Trong nông nghiệp: Chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống

nhằm chống lại sự tấn công của nấm gây hư hỏng hạt trong đất, đồng thời có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm cho hạt Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng trong việc bảo quản kéo dài thời gian

sử dụng của các sản phẩm sau thu hoạch từ nông nghiệp

Trong y dược: Chitosan được sử dụng làm chỉ tiêu tự hủy là do chitosan

là một polymer hữu cơ có thời gian phân hủy nhanh hơn nhiều so với các hợp chất tổng hợp Mặt khác, nó có tính kháng khuẩn không độc hại làm cho vết thương mau lành

Chitosan được sử dụng để tạo da nhân tạo chống nhiễm khuẩn và cầm máu Chitosan có đặc tính làm giảm cholesterol Theo một số nghiên cứu thì tác dụng hạ cholesterol của IMS (N,N,N-Trimethychitosan) là do có chứa phân

được đào thải khỏi cơ thể

Ngoài ra chitosan là một keo dương, có khả năng “bẫy” lượng mỡ và đào thải ra ngoài vì vậy đã có nhiều loại thuốc giảm béo với sự có mặt của chitosan

đã có mặt trên thị trường

Trong công nghệ thực phẩm: chitosan là hợp chất polymer dương do

đó nó có khả năng bắt các keo âm có trong dịch quả, bia, rượu vang, nước giải khát nên chúng được sử dụng như là một chất trợ lọc mang lại hiệu quả cao Chitosan được sử dụng bảo quản thực phẩm tươi sống để thay thế một số chất bảo quản gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng Với tính ưu việt của

chitosan là kháng nấm, kháng khuẩn, chống mất nước trong quá trình bảo quản, không gây hại đối với người sử dụng

Năm 2001 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công việc sử dụng chitosan trong bảo quản thịt bò, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và chất lượng thịt ít biến đổi

Năm 2004 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công chitosan trong bảo quản cá, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và giữ được chất lượng của cá

Ngày nay các nhà công nghệ thực phẩm đã nghiên cứu và sản xuất màng chitosan trong đó có sự phối trộn chitosan, polyetylen và sorbitol tạo màng bền, dai, bóng, đẹp sử dụng để bao bọc sản phẩm như xúc xích Màng này dễ bị phân hủy khi ta loại bỏ do đó giải quyết tốt vấn đề ô nhiễm môi trường

Mặt khác, chitosan có thể được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm trong sản xuất giò chả để thay thế hàn the

Trong mỹ phẩm: Do chitosan có thể dễ dàng cố định trên lớp biểu bì

Nhờ vậy khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm kem dưỡng da chống nắng bằng cách ngăn chặn tia cực tím

Chitosan là một polymer mang điện tích dương có thể kết hợp với protein của tóc nhờ độ keo của nó khi khô làm cho tóc cứng và giữ được nếp tóc

Trong lĩnh vực khác: Do cấu trúc tương tự cenllulose nên chitosan được

nghiên cứu bổ sung vào trong quá trình sản xuất giấy, làm tăng độ bóng, bền, dai của giấy

Ngoài ra, người ta còn sử dụng chitosan để thay thế tinh bột trong quá trình hồ hóa vải, kết quả làm tăng độ bền của sợi, tạo độ bóng đẹp, cố định hình

in trên vải được rõ nét

Chitosan có DD trong khoảng 75 – 85%: thường được sử dụng để làm màng bao trong bảo quản thực phẩm Nguyễn Thị Hằng Phương đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ deaectyl chitosan đến khả năng bảo quản na, tác giả cho rằng với chitosan có DD = 75%, nhúng na vào dung dịch chitosan 1% kết hợp bao gói bằng màng film PE (polyetylen) có độ dày 0,04 mm, bảo quản

thời gian bảo quản đến 12 ngày[10]

Ứng dụng của chitosan có độ deacetyl cao: Chitosan có độ deacetyl

cao thường được ứng dụng trong thực phẩm, y dược, sinh học, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt Chien và cộng sự (2006) bảo quản được các lát

kDal, DD = 95 – 98%) Durango và cộng sự (2005) dùng chitosan 1,5% (MW

= 48,5 kDal, DD = 88,76%) để đánh giá lượng vi sinh vật trên trên carrot cắt

ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn lactic và coliform tổng số - các vi khuẩn có liên quan đến sự hư hỏng của carrot trong thời gian bảo quản[16]

1.2 Quy trình sản xuất chitosan

Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn deacetyl (deacetylation), đây là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin Thông thường quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc Nồng độ thường sử dụng từ 40 – 50%,

độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất của chitosan[3, 23] (Phụ lục 1, Bảng 2)

Quá trình deacetyl theo phản ứng sau:

Hình 1.2 Quá trình Deacetyl

Một số quy trình sản xuất chitin-chitosan bằng phương pháp hóa học:

Bảng 1.3 Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học

STT Nồng độ

NaOH

Thời gian (giờ)

Nhiệt độ ( o C)

Độ deacetyl (%) Nguồn tài liệu

Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản)

Nhiệt độ phòng (26 – 29)

80.22

Trần Thị Luyến và cộng

sự (2004)

Trần Thị Luyến, ĐH Thủy Sản

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất

chitosan

Độ deacetyl của chitosan: là khả năng cắt mạch nhóm acetyl của chitin

để tạo thành chitosan, sự cắt nhóm acetyl càng nhiều thì độ deacetyl càng lớn, hay nói cách khác độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2-deoxy-Dglucopyranose trong phân tử chitin và chitosan Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino[13]

Nhiệt độ của quá trình deacetyl: Nhiệt độ càng cao thì quá trình deacetyl diễn ra càng nhanh Sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao Tuy nhiên, nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan

Thời gian và nồng độ kiềm: Quá trình deacetyl diễn ra nhanh ở giai đoạn đầu Theo Wu và Bough (1978), quá trình deacetyl đạt được 68% trong thời

Tuy nhiên, quá trình deacetyl diễn ra chậm lại, sau 5 giờ chitosan chỉ đạt được 78% DD Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy, sau 2 giờ xử lý độ deacetyl không thay đổi nhiều so với 1 giờ mà chỉ có phân tử lượng của chitosan xử lý sau 2 giờ giảm đáng kể, điều đó cho thấy, từ sau 1 giờ đến hết 2 giờ, chủ yếu diễn ra quá trình cắt mạch chitosan Ngoài ra, nồng độ kiềm cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitosan Nếu nồng độ kiềm quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt và phân tử lượng của chitosan Tuy nhiên, nếu nồng độ kiềm xử lý nhẹ dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn

Tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm: Tỷ lệ chitin: dung dịch NaOH thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử dụng tỷ lệ 1:15

Ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu: nếu chitin ban đầu không được chiết rút trong điều kiện phù hợp (ví dụ: xử lý tách khoáng ở nồng độ acid HCl quá cao, thời gian dài) thì chitin bị cắt mạch dẫn đến chitosan thu được có phân

tử lượng và độ nhớt thấp Kích thước của chitin ban đầu, kích thước hạt càng nhỏ

thì quá trình deacetyl hóa diễn ra nhanh và sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao hơn (độ nhớt, phân tử lượng, độ tan tốt hơn)

Điều kiện môi trường xử lý: Để hạn chế sự cắt mạch chitin trong quá trình deacetyl hóa, người ta thực hiện công đoạn này trong môi trường khí nitơ

để hạn chế sự tiếp xúc với oxy không khí Kết quả nghiên cứu của Bough và cộng sự (1978) khẳng định deacetyl hóa trong môi trường khí nitơ thì tạo ra sản phẩm chitosan có phân tử lượng và độ nhớt cao hơn sản phẩm chitosan được deacetyl hóa trong môi trường không khí[21]

Quá trình deacetyl diễn ra chậm, đặc biệt ở nhiệt độ thấp, vì vậy muốn rút ngắn thời gian sản xuất thì công đoạn deacetyl nên thực hiện ở nhiệt độ cao

Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được phụ thuộc nhiều vào các yếu tố nồng độ NaOH sử dụng, nhiệt độ, thời gian xử lý và tỷ lệ Nồng độ NaOH và nhiệt độ xử lý càng cao thì độ deacetyl đạt càng cao Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm chitosan thu được sẽ thấp (Phụ lục 1, Bảng 3)

Để đạt được độ deacetyl cao trên 90% thì một thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy muốn chitosan thành phẩm đạt được độ deacetyl 96% khi sử dụng chitin từ phế

2 lần (Phụ lục 1, Bảng 4) Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt được

độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl thì tốc độ tách nhóm acetyl diễn ra rất chậm Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp tục deacetyl thì quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn và đạt được độ deacetyl cao

Tuy nhiên, cần phải lưu ý là chế độ deacetyl ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng và độ nhớt của chitosan của sản phẩm chitosan, chế độ deacetyl càng cao (nồng độ NaOH cao, nhiệt độ cao, thời gian dài) thì chitosan thu được có phân

tử lượng thấp (Phụ lục 1, Bảng 5) Do đó, để đạt được độ nhớt cao, phân tử lượng lớn thì thực hiện quá trình deacetyl ở chế độ phù hợp, không nên sử dụng nồng độ NaOH quá cao, nhiệt độ quá cao

1.2.2 Ảnh hưởng của độ Deacetyl đến tính chất và ứng dụng của Chitosan

1.2.2.1 Ảnh hưởng của độ deacetyl đến tính chất của chitosan

Tính chất của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết, độ deacetyl hóa, phân tử lượng và độ rắn Chitosan có độ tinh khiết càng cao thì càng dễ tan, màu sắc dung dịch hòa tan có độ trong cao, có tính kết dính cao và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực hơn Khả năng thấm nước của màng chitosan có

độ deacetyl hóa thấp thì cao hơn so với màng chitosan có độ deacetyl hóa cao Phân tử lượng của chitosan cũng là một thông số quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng hấp phụ chất màu Độ rắn của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nguồn gốc chitin, độ deacetyl hóa, phân tử lượng

nhiễu xạ tia X

Mức độ deacetylation (DDA) ảnh hưởng đến vật lý, hóa học và sinh học của chitosan, chẳng hạn như cơ sở acid và đặc điểm tĩnh điện, phân hủy sinh học, tính chất hấp phụ, Có nhiều phương pháp để tăng hoặc giảm mức độ deacetyl Sự gia tăng nhiệt độ hay nồng độ NaOH có thể tăng cường việc loại

bỏ các nhóm acetyl từ chitin và tạo ra các loại chitosan có tính chất khác nhau

và dựa vào đó để ứng dụng nó vào các loại thực phẩm hay dược phẩm phù hợp (Baxter et al., 1992)

Độ deacetylation thấp nhất tương ứng với chitosan có độ deacetyl dao động từ 40% - 60% Phần lớn các mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình từ 70% - 90% Đối với một số ứng dụng sinh học đặc biệt, chitosan

có độ deacetyl cao trên 95% (Tolaimatea et al., 2003)[20]

1.2.2.2 Ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng ứng dụng của chitosan

Chitosan với độ deacetyl hóa thấp có khả năng hấp thụ nước cao hơn so với chitosan có độ deacetyl hóa cao Các loại màng được hình thành từ chitosan

có độ deacetyl hóa thấp cũng thể hiện khả năng hấp thụ nước và khả năng thẩm thấu cao hơn các loại màng từ chitosan với độ deacetyl hóa cao Điều này có lẽ

là do chitosan với độ deacetyl hóa thấp có độ rắn thấp hơn[9]

Khả năng hấp thụ chất béo và chất màu của chitosan có độ deacetyl hóa cao lại cao hơn chitosan với độ deacetyl hóa thấp Điều này là do số nhóm amine tích điện dương trong mạch chitosan có độ deacetyl hóa cao lại nhiều hơn[9, 24]

Màng chitosan với độ deacetyl hóa cao có độ căng dãn và dẻo dai cao hơn màng chitosan với độ deacetyl hóa thấp, có lẽ là do độ rắn cao hơn và do

sự hình thành liên kết hydro nội phân tử nhiều hơn Điều này cũng có thể giải thích rằng độ trương nở của màng chitosan bị ảnh hưởng chủ yếu bởi những nhóm ưa nước trong những vùng vô định hình của màng và sự hình thành liên kết hydro nội phân tử[9, 15, 24]

Khả năng kháng khuẩn của chitosan tăng lên theo độ deacetyl hóa của chitosan Vì chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì khả năng hòa tan của nó càng lớn và chitosan tích điện dương càng nhiều trong môi trường acid[9, 24]

Các công trình nghiên cứu trước đó:

Ahn và cộng sự (2003) báo cáo rằng màng bao chitosan (120kDa, DD = 85%) cải thiện được thời hạn sử dụng và chất lượng của bánh mỳ bằng cách ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật, làm chậm quá trình oxy hóa và thoái hóa[16]

Park và cộng sự (2005) đánh giá hiệu quả kháng nấm của chitosan 2% (DD = 89,9%; hòa tan trong 0,5% acid acetic) và chitosan 2% chứa 0,3%

potassium sorbate (PS) chống lại Cladosporium sp và Rhizopus sp đã được

phủ trên dâu tây tươi bằng cách ngâm[16]

Del Blanco và cộng sự (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan DD (73% đến 95%) trên tính nhũ tương hóa Kết quả cho thấy rằng tất cả DD cho

ra hệ nhũ tương nước/dầu/nước phân tán ổn định với các độ nhớt khác nhau Hai giá trị DD tối ưu đã được tìm thấy là 81% và 88%, cho hệ nhũ tương hóa hoàn toàn không có dầu dư hoặc lắng[16]

 Các phương pháp đánh giá độ deacetyl chitosan

Bên cạnh phân tử lượng, độ deacteyl – DA hoặc (deacetyl – DD) cũng là một chỉ tiêu quan trọng có nhiều ảnh hưởng đến các tính chất lý hóa và chức

năng của chitin, chitosan Độ acetyl hay deacetyl của chitin, chitosan có thể được đánh giá thông qua nhiều phương pháp khác nhau, các phương pháp này

có thể xếp thành 3 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp quang phổ (spectroscopic methods) gồm phương pháp NMR, UV và IR; (2) nhóm phương pháp truyền thống (conventional methods) với các phương pháp chuẩn độ và nhuộm màu với ninhydrin; và nhóm phương pháp phá vỡ cấu trúc (destructive methods) gồm phương pháp phân tích nguyên tố, thủy phân với acid/enzyme kết hợp với phân tích sắc ký hoặc so màu

Mỗi phương pháp đều có những ưu và hạn chế riêng, việc lựa chọn phương pháp phân tích sẽ tùy thuộc vào đặc điểm của mẫu cần phân tích và điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tuy nhiên các phương pháp thuộc nhóm 1 và 3 thường được sử dụng rộng rãi hơn[8, 19] Đối với các nghiên cứu cần xác định độ deacetyl thường xuyên với số lượng mẫu lớn thì các phương pháp xác định thông qua đo mức độ hấp thụ tia cực tím của N-acetyl glucosamine tỏ ra có ưu thế vì đơn giản, nhanh và chi phí thấp[8, 17], đặc biệt thủ tục phân tích sử dụng acid phosphoric làm dung môi hòa tan chitin, chitosan

do Hsiao và cộng sự đề xuất, sau đó được phát triển bởi Hein và cộng sự, được chứng minh là có độ tin cậy cao với một phổ DD rộng vì vậy thích hợp cho cả chitin và chitosan[8, 17, 18] Độ deacetyl của mẫu sau deacetyl là giá trị trung bình độ deacetyl của phần tan và không tan trong acid loãng của sản phẩm, và việc phân riêng hay không phân riêng phần tan và không tan không có ảnh hưởng đến kết quả[8, 23]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chitin được sản xuất từ tôm thẻ chân trắng theo quy trình của Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2003 (phụ lục 2) Chất lượng của chitin nguyên liệu được trình bày ở Bảng 2.1

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Theo các kết quả khảo sát, để độ deacetyl của chitosan >90% đòi hỏi quá trình deacetyl phải tiến hành nhiều lần, do đó bố trí thí nghiệm nghiên cứu chitosan có độ deacetyl cao được biểu diễn theo sơ đồ Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết

2.2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 1

a Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl chitosan trong quá trình deacetyl lần 1

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng

độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan

Thuyết minh quy trình:

Chuẩn bị 4 cốc thủy tinh 1000ml, các cốc được đánh dấu từ 1 đến 4, cho vào mỗi cốc 50g chitin, sau đó tiến hành cho vào cốc 1, 2, 3, 4 dung dịch NaOH lần lượt với các nồng độ 40%, 45%, 50%, 55%, tỷ lệ w/v : 1/15, đun ở điều

Sau 12 giờ, đem mẫu đi rửa về pH = 7 và đem đi sấy ở tủ sấy bằng quạt

Chitin

Xay (4 mm)

Thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần, kết quả tính theo giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm

b Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ deacetyl chitosan trong quá trình deacetyl lần 1

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt

độ đến độ deacetyl của chitosan

Thuyết minh quy trình:

Chuẩn bị 5 cốc thủy tinh 1000 ml được đánh dấu từ 1 đến 5 Tất cả các mẫu đều sử dụng 50g chitin được deacetyl với dung dịch NaOH 50% theo tỷ lệ chitin : NaOH là 1:15, trong 12 giờ, ở điều kiện nhiệt độ khác nhau: cốc 1, 2,

Rửa về trung tính và sấy khô

nhận từ quá trình deacetyl được phân tích DD và Mw để xác định nhiệt độ thích hợp

Thí nghiệm trên được lặp lại 3 lần, kết quả tính theo giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm

c Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ deacetyl chitosan trong quá trình deacetyl lần 1

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời

gian đến độ deacetyl của chitosan

Thuyết minh quy trình:

Chuẩn bị 6 cốc loại 1000 ml được đánh dấu từ 1 đến 6 Tất cả các mẫu đều sử dụng 50g chitin, deacetyl với dung dịch NaOH 50% theo tỷ lệ chitin :

Chọn thời gian thích hợp cho quá trình deacetyl chitosan