101 Chương 6 Các Phương pháp trong Chọn giống Thực vật I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong chọn giống. Có hai kiểu chọn lọc cơ bản, đó là: chọn lọc theo kiểu hình và chọn lọc theo kiểu gene; nhưng tất cả đều dựa trên cơ sở là nguồn biến dị di truyền của sinh vật. Ngày nay chúng ta đều biết rằng, chỉ có các biến dị di truyền (các đột biến, biến dị tổ hợp) mới đóng vai trò là nguồn cung cấp nguyên liệu cho quá trình chọn lọc và tiến hoá của sinh vật. Trong khi Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo, ông cũng đã phân bịêt được các biến dị di truyền (biến dị không xác định) và biến dị không di truyền (biến dị xác định), nhưng chưa giải thích được nguyên nhân của chúng. Về vai trò sáng tạo của chọn lọc, + Chọn lọc tự nhiên Theo quan điểm của Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh các biến dị cá thể trong quá trình sinh sản và dưới tác dụng của các điều kiện môi trường sống. Chỉ những biến dị nào có lợi cho bản thân sinh vật thì được giữ lại, còn các biến dị nào không có lợi thì bị đào thải. Chọn lọc tự nhiên thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang các biến đổi thích nghi trên cơ thể ngày càng hợp lý. Có những trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy và hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho quá trình chọn lọc phát huy nhanh hơn. Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn của cây trồng vừa có lợi cho con người, vừa có lợi cho sinh vật. Ngược lại, đối với một số đặc tính như rụng hạt ở cây ngũ cốc, chất lượng nông sản cao . thì giữa chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn nhau. Do vậy sự thúc đẩy quá trình hình thành giống mới xảy ra chậm hơn. Vì vậy trong công tác chọn giống, chọn lọc nhân tạo có tác dụng vô cùng quan trọng để tạo ra giống mới. + Chọn lọc nhân tạo Darwin là người đầu tiên tổng kết đầy đủ nhất về vai trò tác dụng của tác dụng nhân tạo. Theo Darwin, biến dị, di truyền và chọn lọc là ba yếu tố quyết định sự tiến hoá của sinh vật. Chọn lọc nhân tạo đã tích luỹ những biến dị có lợi và loại bỏ những biến dị không có lợi cho con người. Chính 102 chọn lọc nhân tạo đã tạo nên các đặc điểm thích nghi kỳ diệu trên cơ thể vật nuôi, cây trồng (phù hợp với các thị hiếu thẩm mỹ và nhu cầu về kinh tế của con người). Nếu như trong chọn lọc tự nhiên, động lực của chọn lọc là đấu tranh sinh tồn, thì trong chọn lọc nhân tạo động lực thúc đẩy chính là lợi ích kinh tế của con người. II. Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc 1. Hệ thống sinh sản của cây trồng Ở cây tự thụ phấn(autogamous), do đặc điểm sinh học về cấu tạo hoa, việc lai tạo với cây trồng khác trong cùng loài gặp nhiều khó khăn. Mặt khác, phần lớn cây tự thụ phấn là đồng hợp tử. Hạt giống thương phẩm của nó đựơc sản xuất bằng phương pháp tự thụ phấn. Còn ở các cây giao phấn hay thụ phấn chéo, việc lai tạo trong tự nhiên xảy ra thuận lợi. Đặc điểm của những cây dị giao là dị hợp tử, do vậy hiệu ứng trội sẽ đóng góp việc hình thành các tính trạng. Phương pháp chọn giống ở cây sinh sản vô tính nói chung là các biến dị xảy ra đều tạo nên các kiểu gene đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Chọn ra kiểu gene mong muốn trong môi trường nhất định sẽ tạo ra các dòng vô tính phục vụ sản xuất. Ở đây nhân tố môi trường có tác động nhất định đến các hệ thống sinh sản của cây. 2. Hiện tượng ưu thế lai Ưu thế lai là hiện tượng thường gặp ở tất cả các loài cây giao phấn và một số loài cây tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa . Hạt lai thương mại hiện nay đã được áp dụng rộng rãi ở cả các cây tự thụ phấn và cây giao phấn (xem chương 4). 3. Cấu trúc của bộ máy di truyền tế bào Mức độ đa bội có ảnh hưởng nhất định đến chiến lược chọn giống cây trồng: tứ bội thể được dùng thông dụng ở các loài cây thức ăn gia súc nhằm làm tăng sản lượng chất khô và các đặc tính tốt khác. Việc chọn lọc một tính trạng nào đó như khả năng chống chịu sâu bệnh của củ cải đường, khoai tây . bằng cách chọn các dạng tam bội tỏ ra có hiệu quả hơn. 4. Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm là tính trạng số lượng hay tính trạng chất lượng mà có các phương pháp chọn lọc khác nhau. Thông thường, tính trạng chất lượng được kiểm tra bởi một gene, còn tính trạng số lượng do nhiều gene kiểm tra và chịu ảnh hưởng lớn bởi môi trường và tác động qua lại giữa các gene. Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường được áp 103 dụng là chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy. Càng có nhiều gene tham gia thì sẽ ít có cơ hôi tạo ra sự ngẫu nhiên để đạt được một tổ hợp gene tốt nhất của một chu kỳ chọn lọc. Do vậy cần có sự phối hợp của chọn lọc nhằm làm tăng các tổ hợp tốt nhất ở chu kỳ tiếp theo. Trong trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu được các tính trạng tốt ở mỗi chu kỳ. 5. Sự hoạt động của các gene (xem cơ sở di truyền học của hiện tượng ưu thế lai, chương 4) III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc Ngoài những nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến quá trình chọn lọc như mức độ biến dị của tính trạng được chọn à phương pháp chọn lọc, thì nguyên nhân chủ quan cũng góp phần quan trọng và mang tính quyết định, do vậy cần tuân thủ các nguyên tắc cơ bản khi chọn lọc. (1) Có mục tiêu và phương hướng: Mục tiêu và phương hướng của nhà chọn giống càng cụ thể và rõ ràng thì công tác chọn giống càng nhanh chóng có hiệu quả. (2) Chọn vật liệu khởi đầu thích hợp: Nguyên tắc này mang tính quyết định đối với công tác chọn giống. Ví dụ, khi muốn tạo ra cây trồng có tính chịu rét, chịu hạn, chịu mặn hoặc khả năng chống chịu sâu bệnh v.v. cần chọn những vật liệu có các gene chống chịu về những đặc tính này và cần được thực tiễn sản xuất thừa nhận các đặc tính này trên quy mô lớn. (3) Cần dựa vào tính trạng trực tiếp và tính trạng tổng hợp: Các tính trạng có mối quan hệ mật thiết với nhau, sự tương quan này còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Việc phát hiện ra mối tương quan càng sớm bao nhiêu thì kết quả chọn lọc càng nhanh bấy nhiêu. Ví dụ, tính trạng chịu hạn của cây ngoài các đặc điểm về cấu tạo bộ rễ ra thì đặc điểm về kích thước lá, đường kính lá, đặc điểm về hình dáng là góp phần quan trọng cho tính trạng tổng hợp chịu hạn của cây trồng. (4) Vật liệu chọn giống cần đảm bảo trồng trong điều kiện đồng đều và thích hợp: Đây là nguyên tắc bắt buộc, vì chỉ có trong những điều kiện phù hợp như vậy, các đặc tính hay tính trạng của giống cây trồng mới biểu hiện ra và thông qua công việc đánh giá, quá trình chọn lọc đó mới đảm bảo tính khách quan và chính xác. (5) Ruộng chọn giống cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật phù hợp: Muốn đánh giá tiềm năng năng suất của giống cây trồng, cần áp dụng những biện pháp kỹ thuật tối ưu về đất đai, thời vụ phân bón, tưới tiêu . Còn muốn đánh giá giống trong điều kiện sản xuất thì áp dụng các quy trình kỹ thuật ngoài sản xuất mà không có bất kỳ một sự ưu tiên nào ngoài 104 việc chọn lọc sao cho các giống ngày càng trở nên thuần chủng. (6) Cần chọn lọc theo đúng mục tiêu đề ra và phải chọn lọc trong môi trường phù hợp: Chẳng hạn, trong việc chọn các giống chịu mặn, chịu úng, chịu hạn . thì các vật liệu chọn giống cần trồng trong điều kiện tự nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn Hoặc trong đánh giá khả năng kháng bệnh cũng vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng trong mùa vụ có dịch bệnh phát sinh mạnh nhất. (7) Kết hợp chọn lọc ở trong phòng và trên đồng ruộng trong suốt thời kỳ sinh trưởng của giống, khi đó các giống cây trồng mới được chọn ra một cách nhanh chóng và chuẩn xác. IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại thông dụng 1. Một số phương pháp chọn giống truyền thống Chọn giống là một quá trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi của một nền nông nghiệp. Nói chung, các phương pháp chọn giống truyền thống vẫn tương đối phổ biến, trong đó tái tổ hợp giữa các kiểu gene ưu tú vẫn là khâu then chốt để tạo ra vật liệu chọn giống cho quá trình chọn lọc. Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào sự tái tổ hợp của các gene và nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính của sinh vật (tuân theo các nguyên lý di truyền cổ điển của Mendel và Morgan). Các quy trình chọn giống khác nhau đã được sử dụng cho các kiểu cây trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản là tự thụ phấn hay giao phấn. Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ là thông dụng nhất. Các bố mẹ được chọn kỹ lưỡng và lai thông qua thụ phấn bằng tay (Hình 6.1). Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường một dạng bố mẹ là giống đã được cải tiến và dạng kia là một giống kháng hoặc loài hoang dại. Phải mất vài thế hệ lai và chọn lọc để chuyển gene kháng cho dạng bố mẹ đã được cải tiến và phục hồi các đặc tính mong muốn của dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.). Tại Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila - Philippines), mỗi năm có tới hàng chục ngàn dòng chọn giống được kiểm tra và lưu giữ về khả năng kháng rầy nâu và sâu hại lá. Tại đây đã lai tạo và phóng thích nhiều giống lúa mới (IR-8, IR-36, IR-64, .) góp phần tạo nên cuộc "cách mạng xanh" trong những năm 1960 và 1970 ở các nước đang phát triển. 105 Hình 6.1 Hình trên: Hoa lúa, khử nhị đực và tiến hành lai giữa hai giống lúa thông qua thụ phấn bằng tay. Hình dưới: Một giống lúa bán lùn, năng suất cao gọi là IR-8 (trái), một phần của cuộc cách mạng sanh lần thứ hai, được IRRI tạo ra bằng cách lai chéo giữa hai dòng lúa bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) và DGWG từ Trung Quốc (phải). Với thân thấp hơn và cứng hơn, giống lúa mới có thể mang các bông to hơn nhưng không bị đổ. 2. Một số phương pháp chọn giống hiện đại Sự phát triển của công nghệ sinh học (CNSH) trong vài thập niên gần đây đã và đang đưa lại các kiểu quy trình chọn giống mới. Trong chọn lọc với sự hỗ trợ của marker (marker-assisted selection), các marker DNA liên kết với các tính trạng quan tâm (ví dụ các gene kháng côn trùng) được sử dụng để cải tiến hiệu quả của chọn giống. Các marker DNA còn hỗ trợ cho việc phân tích số lượng, tác dụng và sự đinh khu trên nhiễm sắc thể của các gene thứ yếu ở thực vật, thông qua một quá trình gọi là phân tích các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL). Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) cho phép sử dụng bất kỳ sinh vật nào để làm nguồn cung cấp tính kháng. Chẳng hạn, vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) là nguồn cung cấp gene mã hoá các độc tố diệt côn trùng đã được dùng để tạo ra giống lúa chuyển gene kháng được loại sâu đục thân (xem Hình 6.2). Vấn đề này sẽ được thảo luận kỹ ở chương 9. CNSH bao gồm một các loạt phương pháp và quy trình sử dụng cơ thể sống và các hệ thống sinh học được biến đổi để tạo ra sản phẩm mới và tăng năng suất cây trồng, vật nuôi. Trong trồng trọt và nhất là trong cải 106 lương giống cây trồng, hầu hết các quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô và tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần hoặc mô phôi để thực hiện quá trình biến đổi, rồi sau đó cho tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều cần thiết là phải hiểu và nắm vững sự tái sinh cây từ nuôi cấy mô đối với từng loại xác định trước khi áp dụng để bổ sung cho phương pháp chọn tạo giống hiện hành. kết quả nuôi cấy mô và tế bào mấy chục năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ các loài cây trồng khác nhau hay các kiểu gene khác nhau trong nội bộ một loài, hoặc thậm chí từ các bộ phận khác nhau trên cùng một cây có phản ứng khác nhau đối với một kỹ thuật nuôi cấy cụ thể. Điều này đã cản trở việc xây dựng các qui trình đồng nhất để có thể áp dụng thường xuyên trong các chương trình chọn giống cho nhiều loài cây trồng. Để ứng dụng kỹ thuật này trong chương trình chọn tạo giống cần phải vạch ra các quy trình cụ thể cho từng loại vật liệu di truyền và môi trường nuôi cấy. 2.1. Nuôi cấy mô và tế bào Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực. Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế . Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn giống. (1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền 107 hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa . Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất, nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene có ích đã được chuyển vào cây trồng. Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngoài noãn. Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn. (2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội: Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F 2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F 2 đến F 7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do 108 đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine. (3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào: Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng 109 sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống. 2.2. Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới được đề xuất bởi Keller và Melchers (1973) là nhằm khắc phục hàng rào lai hữu tính giữa các loài có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào soma hay dung hợp tế bào trần. Đó là kỹ thuật cho phép hợp nhất các tế bào soma không có thành tế bào của cá thể hoặ các loài khác nhau, và sau đó cho tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp. Trong lai hữu tính, các tính trạng liên quan DNA bào quan kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần, ngoài khả năng dung hợp nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới. Ty thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid. Như vậy, bằng con đường lai soma người ta có thể thu được tổ hợp mới của lạp thể hay ty thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất. Dung hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau, giám định, nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu dục là sản phẩm dung hợp. 110 Lai soma được sử dụng có hiệu quả để kết hợp khả năng kháng các bệnh virus ở khoai tây từ các kiểu gene trong một loài cũng như từ các loài khác nhau (Venzen, 1994). Lai soma là một phương tiện có hiệu quả để chuyển bất dục đực tế bào chất và đa dạng hoá nguồn bất dục trong việc tạo giống lai. 2.3. Chuyển gene hay kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền thực vật là sự chuyển một đoạn DNA lạ, thường là một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây chuyển gene. Gene lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động vật, thậm chí gene tổng hợp. Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước: xác định và phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu hiện của gene. Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin) chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố di truyền vận động trong quá trình chuyển gene. Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều khiển T-DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian nhất định. Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm các bước sau đây: [...]... hình chính của giống Số lượng cây chọn tùy thuộc vào nguồn giống có được + Gieo cây đời con trên ô gồm 3-4 hàng và quan sát độ đồng đều của các tính trạng kiểu hình khác nhau + Trộn hạt các đời con có dạng giống và đồng đều lại để nhân giống Chọn lọc quần thể được xem như là một phương pháp chọn tạo giống để cải lương các giống cây trồng tự thụ phấn 1.3.2 Chọn lọc cá thể - Giống dòng thuần Chọn lọc cá... nghi Trong khi đó một dòng thuần biến đổi rất ít 1.3 Chọn lọc Chọn lọc là một quá trình nhờ đó cá thể hay một nhóm cá thể được chọn ra từ một quần thể hỗn hợp và không đồng nhất Chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn bằng chọn lọc hàng loạt hay chọn lọc hõn hợp (chọn lọc quần thể) và chọn lọc cá thể hay dòng thuần (chọn lọc phổ hệ) 1.3.1 Chọn lọc quần thể Ở phương pháp chọn lọc quần thể, người ta chọn. .. giống dòng thuần được thực hiện trong hai trường hợp: - Tạo các dòng thuần từ một giống địa phương thích ứng tốt hay từ một quần thể nhân tạo hay giống quần thể được chọn lọc theo phương pháp chọn lọc quần thể đã và đang được dùng nhiều trong sản xuất - Tạo các dòng thuần từ một quần thể đang phân ly của thể lai Trong cả hai trường hợp trên, chi tiết chọn lọc đời sau của từng cá thể phụ thuộc vào các. .. quý, thường là những giống tổng hợp hoặc giống nhập nội Tuy nhiên nếu vật liệu ban đầu là những giống địa phương thì dòng thuần được tạo ra từ đó lại có tính thích nghi cao, còn nếu vật liệu ban đầu là các giống lai thì kết quả tạo giống mới sẽ nhanh hơn Có 3 phương pháp cơ bản để tạo dòng tự phối ở ngô (bắp): - Phương pháp chuẩn: chọn các cây khỏe mạnh và điển hình cho quần thể của vật liệu ban đầu rồi... phương pháp cách ly Các bắp tốt được lựa chọn theo kiểu bắp/hàng Sự chọn lọc được lặp lại như vậy ở các thế hệ tiếp theo - Phương pháp hốc đơn: đây là một biến dạng của phương pháp chuẩn, hàng được thay thế bằng hốc đơn 3 cây trong mỗi chu kỳ chọn lọc Vì thế phương pháp này có ưu điểm là cho phép đánh giá được số lượng thế hệ nhiều hơn trên cùng một đơn vị diện tích, nhưng lại hạn chế về khả năng chọn. .. thường xảy ra nhiều hơn 1.1 Phương pháp chọn tạo Chọn tạo giống cây sinh sản sinh dưỡng thì kỹ thuật được ứng dụng cơ bản giống như các phương pháp chọn tạo giống cây hữu tính, bao gồm: nhập nội, chọn lọc và tạp giao, chỉ khác về cách xử lý quần thể lúc khảo nghiệm Đối với cây nhân vô tính, khi một kiểu gene đã được xác định nó có thể được duy trì vĩnh viễn bằng phương pháp vô tính hay sinh dưỡng mà... gene kháng sâu có thể cơ mặt trên một giống nhất định của một loại cây trồng nào đó Trong trường hợp này, việc chọn lọc là để phân lập được các kiểu gene kháng Đối với cây tự thụ phấn, sử dụng phương pháp chọn hỗn hợp hoặc chọn dòng thuần để chọn giống kháng Đối với cây giao phấn, thường dùng phương pháp chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc hồi quy Cây giao phấn có hiệu quả chọn lọc cao hơn cây tự thụ phấn vì... các dòng thuần Quần thể chọn ra trên thực tế đồng đều về các tính trạng nông học quan trọng như màu hạt, kích cỡ hạt, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh Chọn lọc quần thể chủ yếu được dùng để lọc các giống lẫn hoặc lọc các lô hạt giống lẫn của các chương trình sản xuất hạt giống Việc lọc các giống lẫn bằng chọn lọc quần thể được tiến hành như sau: + Chọn lọc từ 200 đến 2.000... đồng ruộng trong điều kiện tự nhiên khi bệnh phát triển Sàng lọc tính đề kháng trong điều kiện tự nhiên thường được tiến hành khi không có phương pháp gây nhiễm nhân tạo hoặc với các bệnh ít quan trọng, không cần đến phương pháp phức tạp hay tốn kém Người ta đưa ra các phương pháp sàng lọc nhân tạo đối với các bệnh quan trọng của cây trồng chủ yếu Một phương pháp sàng lọc tốt phải có đủ các điều kiện... sau: - Trường hợp các giống địa phương hình thành từ các quần thể bằng phương pháp chọn lọc quần thể, mang ít cây dị hợp, số lớn cây là đồng hợp tại nhiều locus - Trường hợp của quần thể đang phân ly, từng cây riêng rẽ ban đầu dị 116 hợp trở thành đồng hợp sau các đời liên tiếp Nhiều chương trình chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn quan tâm đến việc chọn tạo các giống dòng thuần vì: (i) Giống dòng thuần . 101 Chương 6 Các Phương pháp trong Chọn giống Thực vật I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan. dụng các phương pháp chọn giống mới để đạt hiệu quả tối đa bằng cách kết hợp các chu kỳ tự phối và ngoại phối với nhau. Các phương pháp chọn tạo giống