Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật

Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại l

số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức Trong khi đó kỹ thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại

do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do con người thiết kế Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các

hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với bất kỳ cây trồng nào Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma nào cũng có khả năng đó

Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980 Đến nay, các kỹ thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau Lúc đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm chất cây trồng Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các

loài thực vật khác nhau Muốn chuyển một gene thành công cần phải chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gene, nhưng đôi khi các loài nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân hoá, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn chỉnh Do đó hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song song

Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng

hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế Trở ngại lớn nhất là tính đặc

trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho

phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng Sự phát triển của các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương pháp biến nạp gene trực tiếp Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene (particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật Việc biến nạp ở các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn Các phương pháp biến nạp khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế Chẳng hạn các phương pháp biến nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương pháp biến nạp gene qua ống phấn

Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã

có những bước tiến rất lớn Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng Vì thế chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật

II Kỹ thuật chuyển gene

1 Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene

Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene

lạ Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh

và chấp nhận sự biến nạp Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến Một số ít tế bào trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp Những tế bào

khác chỉ có một trong hai khả năng ấy Một số lớn các tế bào trong cơ thể

có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không thể làm được Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ quan

Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên

cơ thể Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng sinh và tái sinh của các tế bào soma Tuy nhiên phản ứng này khác nhau giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây Nói chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA Vì thế gene chỉ có thể được

đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm

hay bằng súng bắn gene Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ Tuy nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu hiện của gene được biến nạp DNA không phải của virus có thể liên kết với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ DNA, RNA của virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp trong cây trừ vùng mô phân sinh

- Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát triển thành một cây biến nạp Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn Hạt phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường Hạt phấn thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp Trong khi đó, việc

biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn

Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi Việc biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô phân sinh thường cho ra những cây khảm

Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây

hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay

phát sinh phôi Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và

có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh

2 Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng

Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh

vật này Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung dịch muối Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với lithium chloride hoặc lithium acetat Vì vậy người ta sử dụng phương pháp

này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae) Đối

với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn

2.1 Biến nạp vào tế bào riêng lẻ

Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào Tế bào động vật không có thành Trong nuôi cấy, chúng được biến nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với calcium phosphat (hình 9.1a) Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b) Tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng Có thể thực hiện chuyển nạp bằng những phương pháp khác nhau:

Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào

2.1.1 Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes

mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật A tumefaciens có chứa

một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2)

Hình 9.2Cấu trúc của Ti-plasmid

Hình 9.3 Agrobacterium gây khối u ở thực vật

A tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất

là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm (Hình 9.3) Sự hình thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần phải có sự hiện diện của

vi khuẩn Khả năng này có được do A tumefaciens đã chuyển một đoạn

DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh 2.1.1.1 Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật

Tạo khối u

Tổng hợp nopaline

Sử dụng nopaline

Điểm xuất phát sao chép Các chức năng

chuyển T-DNA

Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D

Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là

T-DNA (Transferred T-DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc

(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự phân chia tế bào liên tục Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường

gọi là opine Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine

synthetase và nopaline synthetase

Vùng B có liên quan đến sự tái sinh

Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp

Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong

việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật

Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA

mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng cacbon và nitrogen cho vi khuẩn

2.1.1.2 T-DNA và các trật tự biên 25 bp

Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật

tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và biên phải (right border – RB) Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên này đều được chuyển sang tế bào thực vật LB và RB là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển DNA Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc

10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA Quá trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB

Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu quả Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid hydrolase) Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin Đặc điểm này được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các

tế bào không được biến nạp

2.1.1.3 Vùng vir

Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển

T-DNA sang tế bào thực vật Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6 operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn virC và E có liên quan với việc hình thành khối u Trừ virG và A, các operon khác đều là đa cistron Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương Hoạt động của các operon này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết

ra từ vết thương của cây Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha hydroxyacetosyringon

2.1.1.4 Quá trình chuyển T-DNA

Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt hoá nhờ hoạt động của các gene vir Hoạt động này xảy ra khi

Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ

vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast

Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA

(protein virA) Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,

đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi trường Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc phosphoryl hoá) gene virG Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác Bằng cách như vậy, protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp Từ đó, một mạch T-DNA được giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải Điều này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói trên tại hai trật tự biên Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC

mã hoá Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật Phức hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-

DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium

Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,

cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật

Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA Trong các

mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình 9.4) Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được

nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu

quả cho tác nhân chuyển gene Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho

chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium

2.1.2 Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast

Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó

để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào Tuy nhiên thành tế bào có thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5) Kết quả thu được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác

thí nghiệm Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng

có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus

Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium

Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái sinh từ protoplast

Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi Phôi thực vật sinh

trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy Các cây lúa và

ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi

2.1.2 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện

Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện

tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm nhập vào chất nguyên sinh Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người

ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào 2.1.3 Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast

Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu tiên vào năm 1987 Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn

có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng

tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào

1-1,5 μm được dùng làm vi đạn (microprojectile) Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm Đĩa kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với nòng súng Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu nhẹ Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao Ra khỏi đầu nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào Một tỷ lệ nhất định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá trình biến nạp gene (Hình 9.6)

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene

2.1.4 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm (microinjection)

ông ở khá nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7) Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền Ngoài ra, nó còn đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên

2.2 Biến nạp toàn bộ cơ thể

Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn Phần lớn thực vật được tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên có vấn đề với phương pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác Từ một tế bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong

đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau, sau khi nở hoa và tạo hạt Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động vật Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ

2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới

và ở Việt nam

2.3.1 Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene Bảng 9.1 trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều loài Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống cây trồng quan trọng

- Cây ngô:

1988) Tuy nhiên, có thể dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát sinh các phôi được biến nạp gene Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được

tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar

) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử dụng rộng rãi Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ

Agrobacterium cũng đã được thông báo Các thể biến nạp gene của dòng

ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung (cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non Tần số được thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30% Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi)

9.1

TT Loài Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng

4 Canola Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ,

8 Đu đủ Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus

9 Đậu phụng Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus

10 Bạch dương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, virus,

chống chịu chất diệt cỏ

12 Lúa Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

13 Đậu tương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ

nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công Mẫu vật sử dụng là phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành Hygromycin B là marker chọn lọc thường dùng cho lúa Tần số biến nạp có thể cao tới 50% (tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn

gene) Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium

cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene

- Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene ở lúa mì DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông Các callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố

ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate ammonium Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và kết quả là một số lớn cây thất thoát Phân tích di truyền và phân tử đã xác nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp Nói chung công nghệ di truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene

- Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn Các phôi hợp tử non, các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn

đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus

lùn vàng ở lúa mạch Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân

lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc

dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của gene

- Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn gặp nhiều khó khăn Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene Thực tế, đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền Kết quả đầu tiên ở

đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium

Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking

chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các mẫu lá mầm được xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate Có thể biến

nạp gene hiệu quả vào

dụng nhưng rất khó tái sinh được cây Để biến nạp gene vào các giống đậu tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản - phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c

đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai Hàng trăm cây đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho nhiều phenotype khác nhau Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50 nhưng thường thay đổi từ 2-10) Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời, như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập

và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên

Phaseolus thành công rất ít Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene

Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp

Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus

khảm màu vàng đã được phục hồi Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ

tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện Kỹ

thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và

vỏ hạt của các cây biến nạp

- Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây

bông giống Coker 312 (Umbeck 1987) Cây bông biến nạp gene cũng của giống t

1990) Hầu hết các giống bông có giá trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus Một số ít các giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô tính (somaclonal variation) Phương thức phân phối gene ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi cây biến nạp gene

một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu

(Fabaceae) Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển

sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của các nhà tạo giống (Hình 9.8)

Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif

Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O2 ở vùng phản ứng Điều kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ

2được vùng phản ứng sạch O2 hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như legoglobin Đó là mộ

) đang tìm cách giải quyết

III Kỹ thuật RFLP

1 Đại cương về kỹ thuật RFLP

Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn Khi sử dụng một hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho những đoạn DNA dài ngắn khác nhau Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp ) đều dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt Cá thể đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác

Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng

sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau Ngược lại khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá

thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại

2 Thư viện chỉ thị (marker) phân tử

DNA marker là những marker phân tử được tạo ra nhờ kỹ thuật phân cắt DNA bằng các enzyme giới hạn (restriction endonuclease) Khi tạo ra những đọan DNA mới, người ta đã cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gene định vị trên nhiễm sắc thể nào đó Bản đồ di truyền đơn giản của ruồi giấm đã được phát hiện từ năm 1925 Những tính trạng có biểu hiện giống nhau về di truyền được xếp vào cùng một nhóm liên kết gene, trên cùng một nhiễm sắc thể Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể đo đếm được, gene đó được xem là marker gene Ví dụ liên kết gene giữa lá mầm có màu tím và tính kháng rầy nâu của một vài giống lúa ở Đông bắc

Ấn độ Khi giống kháng có lá mầm màu tím được lai với giống nhiễm có

lá mầm màu xanh, ở thế hệ F2 có xuất hiện con lai có lá mầm màu tím Như vậy lá mầm màu tím được xem như marker đối với tính kháng rầy nâu

Việc lập bản đồ gene và chọn lọc nhờ marker như vậy rất chậm Mặt khác số marker quá ít và chỉ có ở quy mô hình thái Việc áp dụng isozyme marker có ưu điểm hơn, nhưng số marker cũng quá ít, không đáp ứng được nhu cầu nghiên cứu

DNA marker đã được chứng minh là có tầm quan trọng hơn về lâu dài, do số lượng của nó lớn hơn rất nhiều lần isoenzyme marker Việc áp dụng DNA marker dễ dàng hơn và trong tương lai sẽ rẽ hơn

Muốn phát hiện ra chuỗi mã DNA đặc biệt nào đó, người ta phải áp dụng một kỹ thuật lai DNA-DNA Các đoạn DNA được tách riêng ra nhờ

kỹ thuật điện di sẽ biến tính trước khi nó được chuyển qua màng lọc Như vậy các DNA trên màng lọc là DNA ở dạng sợi đơn Để tìm một đoạn DNA đặc biệt nào đó trên màng lọc cần phải có một DNA thăm dò, lai với DNA đặc hiệu, thông qua các liên kết base Nếu DNA thăm dò đã được đánh dấu bằng chất đồng vị hay hoá chất nào đó thì sẽ xác định được một chuỗi mã di truyền DNA cần nghiên cứu

Về căn bản, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như một DNA marker Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau:

- PCR-based: ALP, AFLP, SSR, SSCP

- DNA/DNA hybridization-based: RFLP, minisatellite

Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể chia thành:

+ Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, ADF, AFLP + Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP

Những ưu điểm của DNA-marker so với marker hình thái và isozyme marker là:

- Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền

- Có nhiều marker trong quần thể

- Đo lường không chi phối ảnh hưởng môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

Bảng 9.2 Các loại DNA marker

Single strand conformation polymorphism Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite)

RFLP maker

Trong các DNA marker, RFLP là marker được dùng phổ biến và được biết nhiều nhất Để tạo ra chất thăm dò RFLP marker và thể đa hình DNA gồm nhiều giai đoạn:

- Phân lập DNA

Trước hết phải chuẩn bị chất thăm dò của marker và bộ lọc DNA lai

Đó là giai đoạn có tính chất quyết định trong phân tích RFLP Ví dụ cần

có DNA từ mô lúa với số lượng nhiều và chất lượng tốt Mô lúa được nghiền trong nitơ lỏng Chất đệm khi ly trích DNA có chứa SDS, chất này

có thể phân giải màng tế bào và màng nhân, phóng thích DNA vào dung dịch SDS là chất tẩy khá mạnh, có thể làm biến đổi protein ở nhiệt độ

650C Sự biến đổi này làm cho DNA gắn với protein bị tách rời ra khỏi DNA cần nghiên cứu Protein và chất cặn của tế bào được tách rời ra khỏi DNA bằng phenol/chloroform hoặc bằng phương pháp kết tủa chọn lọc của những chất cặn tế bào với potasium acetate DNA ở pha lỏng sẽ được kết tủa bằng cách thêm isopropanol

Phân lập DNA bằng phương pháp này chỉ áp dụng đối với DNA có kích thước lớn hơn 30 kb và có ít tạp chất polysaccharide Lượng nhỏ của tạp chất này sẽ gây khó khăn khi chạy điện di trên gel, do đó phải hết sức thận trọng khi tách DNA

Nguồn gốc mô cũng ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng DNA Mô cây khỏe và trẻ cho kết quả phân lập DNA tốt hơn từ mô già hoặc từ các loài lúa hoang dại do bị lẫn tạp polysaccharide

DNA được phân lập có thể tồn trữ trong điều kiện -200C Phải chú ý rằng đông lạnh nhiều lần hoặc làm tan băng nhiều lần cũng có thể làm phân huỷ DNA

Trong quá trình phân lập phải sử dụng nhiều dung môi Có hai dung môi quan trọng là EDTA và Tris

- Tris (Trima, base) được sử dụng với khả năng đệm rất có hiệu quả trong dung môi Ở pH 8.0, DNA rất ổn định Trong điều kiện môi trường axit, purine rất dễ bị loại thải (được gọi là “depurination”) do cầu nối phosphodiester dễ bị phá vỡ Do đó, người ta phải kiểm soát pH của dung môi ở mức 8.0 khi dùng Tris

- DNA có thể bị hỏng bởi các enzyme Enzyme này có thể truyền từ tay người làm thí nghiệm, hoặc từ không khí Để ngăn ngừa khả năng DNA bị thuỷ phân bởi enzyme, người ta phải sử dụng thêm EDTA Tất cả các enzyme thuỷ phân DNA được biết hiện nay đều cần Mg++

làm cofactor EDTA có thể kìm giữ Mg++

và làm bất hoạt nó trong dung môi Không có Mg++, enzyme không thể hoạt động

Tiến trình thuỷ phân DNA được thực hiện bằng restriction endonuclease DNA sẽ được đưa về một bộ sưu tập DNA thống nhất sau khi hoàn tất việc phân cắt các chuỗi mã thành những đoạn (DNA fragment) riêng biệt Độ lớn của các đoạn này sau khi tiêu hoá khoảng 30

kb, có khi nhỏ hơn 100 bp Để xác định các DNA fragment thông qua kỹ thuật phân tích Southern, người ta điện di các DNA trên agarose gel Sau khi điện di, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử Người ta có thể quan sát chúng bằng mắt, nhờ kỹ thuật nhuộm màu DNA với ethidium bromide và xác định dưới tia cực tím Khi phân tích Southern, các đoạn DNA được chuyển vào các tấm lọc, nhờ lực mao dẫn

Ở giai đoạn prehybridization (trước khi lai DNA) người ta khóa các vị trí trên màng- nơi quá trình lai sẽ xảy ra, các DNA (gene liên kết với marker)

sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (RFLP-marker) được đánh dấu bằng phóng xạ Sau khi hybridization, tấm lọc hay màng lọc được rửa để loại bỏ các RFLP-marker không gắn hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu Tiếp đó nó tự ghi trên biểu đồ phát xạ Sau khi điện di, gel được chụp dưới tia cực tím Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục Nó sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X-quang Các vạch có tính đa hình (polymorphism) có thể được quan sát để đánh giá

Có hàng triệu đoạn DNA sau khi phân cắt bằng một restriction endonuclease nào đó Nhưng chúng không thể được sử dụng như RFLP marker, nếu từng đoạn này chưa được thanh lọc làm cho thuần khiết và chưa được khuếch đại nhằm có đủ số lượng các đoạn DNA đồng nhất, thuần chủng

Theo ý nghĩa này, RFLP phải có tính chất như sau:

- Có số lượng cao trong mỗi quần thể

- Đồng trội (Codominant )

- Đo trực tiếp DNA

- Không bị ảnh hưởng của môi trường

- Không bị ảnh hưởng do yếu tố có tính chất phát triển

RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhưng qui trình thực hiện rất phức tạp, nguy hiểm đến sức khoẻ người thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lượng và chất lượng cao Do đó người ta có xu hướng

áp dụng các marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở của phản ứng chuỗi polymerase

3.3 Lập bản đồ di truyền bằng chỉ thị RFLP

Việc lập bản đồ gene cũng như việc chọn lọc giống cây trồng trên cơ

sở DNA marker phát triển nhanh, nhờ sự khám phá ra phản ứng chuỗi trùng hợp PCR và một dạng polymerase có tính chịu nhiệt Xây dựng bản

đồ di truyền thường căn cứ trên sự xuất hiện của các biến dị có tính chất nền tảng di truyền của quần thể

Phương pháp phân tích đa hình về chiều dài các đoạn DNA (RFLP) bằng kỹ thuật enzyme giới hạn, là cắt rời DNA hệ gene thành nhiều đoạn ngắn dài khác nhau, từ đó lập nên bản đồ hệ gene, gọi là bản đồ enzyme giới hạn của mỗi cá thể

3.4 Ứng dụng kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật

Trước đây người ta đã sử dụng các dị thể đánh dấu đơn lẽ trong thực vật bậc cao để xem xét các đặc tính hình thái Ví dụ, gene gây tính lùn, gene tạo ra sự thiếu lục lạp hoặc làm biến dạng lá cây Mặc dù các marker rất có ích trong nhiều nghiên cứu ứng dụng cũng như cơ bản, nhưng nó rất hạn chế trong chọn giống cây trồng Những năm gần đây, có hai loại marker mới đã được phân lập, chúng có nhiều triển vọng trong việc ứng dụng vào công tác chọn giống Đó là protein marker và DNA marker Những marker phân tử này khác với marker hình thái ở 5 đặc điểm di truyền như sau:

- Kiểu gene của các locus phân tử có thể được xác định ở khắp cây trồng, ở mức độ tế bào, mô Kiểu hình của tất cả marker hình thái có thể chỉ được phân biệt ở mức độ ở dạng cây bên ngoài

- Một số tương đối lớn các allele được tìm thấy ở các locus phân tử Trong khi các gene ở các locus chứa marker hình thái, xuất hiện với tần số thấp hơn và thường bị kích thích tạo ra các đột biến gene

- Không ảnh hưởng gây hại đi kèm theo các gene của marker phân tử Trong khi ở marker hình thái, nó thường kết hợp với ảnh hưởng do kiểu hình bất lợi gây ra

- Alelle của marker phân tử thường là đồng trội, do đó nó cho phép tất

cả các kiểu gene được thể hiện trong mọi thế hệ phân ly giữa tính trội và lặn