Các phương pháp phát hiện E.Coli trong thực phẩm

Các phương pháp phát hiện E.Coli trong thực phẩm

Trường Đại Học Kỹ Thuật – Công Nghệ TP.HCM

Khoa Công Nghê Thực Phẩm



Đề tài:

-Tp.HCM tháng

11/2011-Mục lụcChương 1 : Tổng quan 4

I Sơ lược về vi khuẩn E.coli 4

1 Đặc điểm sinh học 4

1.1 Hình thái 4

1.2 Tính chất nuôi cấy 4

1.3 Tính chất hóa sinh 5

1.4 Kháng nguyên 6

1.5 Phân loại 6

2 Khả năng gây bệnh 7

3 Chẩn đoán vi sinh vật 12

3.1 Chẩn đoán trực tiếp 12

3.2 Chẩn đoán gián tiếp 12

4 Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh 13

4.1 Điều trị 13

4.2 Phòng bệnh 13

Chương II : Các phương pháp phát hiện E.coli 14

I Phương pháp truyền thống 14

1 Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN 14

1.1 Nguyên tắc 14

1.2 Quy trình phân tích 14

1.3 Cách đọc kết quả 15

2 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 15

2.1 Nguyên tắc 15

2.2 Môi trường và hóa chất 15

2.3 Quy hoạch phân tích 16

2.4 Cách tính kết quả 16

3 Phương pháp làm giàu vi khuẩn 17

3.1 Nguyên lý 17

3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh 17

3.3 Môi trường và thuốc thử 17

3.4 Cách làm 17

II Phương pháp hiện đại 22

1 Phương pháp PCR 22

1.1 Nguyên tắc 22

1.2 Môi trường tăng sinh 22

1.3 Môi trường phân lập 22

1.4 Trích ly DNA 22

1.5 Qui trình multiplex-PCR 24

1.6 Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR 24

2 Phương pháp ELISA 25

2.1 Nguyên tắc 25

2.2 Các phương pháp ELISA 26

2.3 Phát hiện E.coli O157:H7 bằng phương pháp Elisa 29

2.4 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng trong xác định E.coli O157:H7 30

2.5 Ưu điểm của phương pháp E.lisa 30

3 Phát hiện E.coli bằng phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang 30

Kết Luận 34

Phụ Lục 35

Tài liệu tham khảo 47

I SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E.COLI)

Escherichia coli do Theodore Escherich

(1857-1911), một nhà vi khuẩn học người Áo, phát

hiện lần đầu tiên năm 1885 Chi Escherichia thuộc

họ vi khuẩn đường ruột Trong các loài thuộc chi

này, E.coli được chọn làm điển hình và có vai trò

quan trọng nhất trong y học

E.coli là một trong những thành viên chính

của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng cũng là

căn nguyên của nhiều bệnh nhiễm trùng, trong đó có

những bệnh nó là căn nguyên đứng đầu

E.coli đã được sử dụng làm mô hình nghiên

cứu về sinh học phân tử trong lĩnh vực vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung

E.coli K12 là vi khuẩn được sử dụng làm mô hình nghiên cứu nhiều nhất nhiều thành

tựu về di truyền học, hóa sinh học đã được thu trên cơ sở nghiên cứu vi khuẩn này

Ngày nay E.coli cũng được sử dụng nhiều trong công nghệ sinh học.

Mặc dù E.coli là loài vi khuẩn được nghiên cứu sâu nhất, cho đến nay nó vẫn

tiếp tục được quan tâm nghiên cứu, với rất nhiều phát hiện mới ở tầm phân tử, đặc biệt

cơ chế bệnh sinh của các type gây bệnh (pathotype)

1 Đặc điểm sinh học

1.1 Hình thái

E.coli là trực khuẩn Gram âm Kích thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;

trong những điều kiện không thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi

khuẩn có thể rất dài như sợi chỉ Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông và

có khả năng di động

1.2 Tính chất nuôi cấy

E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường Một số có

thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý

Có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5-400C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C

Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ

khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3 đến 4 giờ đãlàm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau hai ngày trên mặt môi trường có

váng mỏng Những ngày sau, dưới đáy ống có thể thấy lắng cặn E.coli không mọc

trên canh thang Selenit

Hình 1.1: Hình chụp vi khuẩn E.coli dưới kính hiển vi với kích

Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 8 đến 10 giờ, dung kính lúp đã cóthể quan sát được khuẩn lạc Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hìnhthái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng có thể gặp dạng R, hoặc M Trên môi trường

phân lập, tùy theo chất chỉ thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như trên thạch

lactose) hoặc màu đỏ (như trên thạch MacConkey) Không mọc được trên môi trườngSS

Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị trong sàng lọc nhanh,

như EAEC tạo thành váng đặc trường khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton

1.3 Tính chất hóa sinh

E.coli có khả năng lên men nhiều loại đường và có sinh hơi Hầu hết E.coli đều lên men lactose và sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong đó có EIEC) không hoặc

lên men rất chậm Một số chi khác trong họ vi khuẩn đường ruột cũng có khả năng lên

men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia và Citrobacter) được gộp vào một nhóm vi khuẩn có tên chung là coliform.

E.coli có khả năng sinh indole Không sinh H2S Không sử dụng được nguồncarbon của citrate trong môi trường Simmons Có decarboxylase, vì vậy có khả năngkhử carboxyl của lysine, ornithin, arginin và acid glutamic Betagalactosidase dươngtính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 giờ âm tính, sau 48 giờ có thể dươngtính

Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh của một số loài thuộc chi Escherichia

Thử nghiệm

Các loài

E.coli

(bìnhthường)

E.coli

(inactive)

Kháng nguyên H: hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định.

1.5 Phân loại

Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các type huyết thanh.

Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanhkhác nhau Mỗi type huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụO86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B)

Dựa vào vị trí gây bệnh các E.coli có khả năng gây bệnh ở người được chia

thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic

E.coli) hay E.coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli).

- Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:

EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột

EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột

DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột

- Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:

MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não

UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu

2 Khả năng gây bệnh

E.coli là thành viên thuộc nhóm vi hệ bình thường của đường tiêu hóa, chiếm

tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%) Tuy nhiên, E.coli cũng là

1 vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây tiêu chảy, viêmđường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm

khuẩn huyết E.coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh E.coli còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa, nhiễm trùng trong bỏng Theo

báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây

bệnh thường gặp (1988-1994) thì E.coli đứng thứ hai (sau S.aureus) về tỷ lệ phân lập

được (tính chung tất cả các loại bệnh phẩm) ở nước ta

Những type huyết thanh có khả năng gây bệnh thường gặp trên lâm sàng là:O111B4, O86B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12

Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tùy loại:

 ETEC-E.coli sinh độc tố ruột

Hai yếu tố động lực quyết định khả năng gây bệnh của ETEC là: khả năng bámdính vào niêm mac ruột và sản xuất độc tố Khả năng bám dính và cư trú trên tế bàobiểu mô ruột non là điều kiện đầu tiên để có thể gây bệnh Khả năng này có vai trò củakháng nguyên CFA (clonisation factor antigen) đã được mã hóa bởi gen trên plasmid

Quyết định khả năng gây tiêu chảy của ETEC là độc tố ruột Có hai loại độc tốruột: loại không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) và loại chịu nhiệt ST (heat stable

toxin) Một chủng E.coli có thể sinh một trong hai hoặc cả hai độc tố đó.

Độc tố ruột LT là ngoại độc tố, gồm hai loại LT I được mã hóa bởi gen trênplasmid và LT II được mã hóa bởi gen trên nhiễm sắc thể LT I và LT II có cấu trúc và

cơ chế tác động giống nhau và giống với độc tố ruột của vi khuẩn tả Cấu tạo của LTgồm 1 tiểu phần A (active) với phân tử lượng 25.000 Dalton và năm tiển phần B

(binding) với phân tử lượng 11.500 Dalton LT bám vào thụ thể GM1 của tế bào biểu

mô ruột non nhờ tiểu phần B Tiều phần A được đẩy vào tế bào biểu mô hoạt hóaenzyme adenylate cyclase làm tăng AMP vòng (cAMP-cyclic adenosinemonophosphate), dẫn đến làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl- Hậu quả của quá trìnhnày là áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng, nước được kéo từ tế bào ra lòng ruột gâytiêu chảy

Độc tố chịu nhiệt ST có trọng lượng phân tử xấp xỉ 5000 Dalton ST tác độnglên ruột bằng sự hoạt hóa enzyme guanylate cyclase làm tăng GMP vòng (cGMP-cyclic guanosine monophosphate) GMP vòng gây rối loạn chuyển hóa nước và điệngiải giống như AMP vòng ST còn làm mất hoặc làm teo một phần nhung mao của tếbào biểu mô ruột Người ta đã nói đến ST-I và ST-II ST-I gồm ST-Ia và ST-Ib Hầuhết các chủng sản xuất ra ST-Ib phân lập được từ người, còn ST-Ia thì hầu hết từ độngvật hoặc các thức ăn có nguồn gốc động vật Chưa gặp các chủng sinh ST-II gây tiêuchảy ở người

Tiêu chảy do ETEC thường khởi phát đột ngột, phân toàn nước không có nhày,máu

 EIEC-Ecoli xâm nhập ruột

EIEC gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Khảnăng xâm nhập được mã hóa bởi gen trên plasmid 140MDa Các gen trên plasmid này

mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpaA đến IpaD, Ipa-Invasion plasmidantigen) EIEC cho kết quả (+) tính trong thử nghiệm khả năng gây viêm kết giác mạcchuột lang (thử nghiệm Sereny) EIEC còn có khả năng sản xuất độc tố ruột giống một

số Shigela Gen mã hóa cho độc tố này có tên là sen (Shigella enterotoxin) Cơ chế gây

bệnh giống vi khuẩn lỵ Vì vậy trong y văn hiện nay viết căn nguyên gây bệnh lỵ trực

khuẩn (bacillary dysentery) gồm Shigella và EIEC EIEC xâm nhập vào trong tế bào

biểu mô đại tràng, làm tiêu các túi thực bào và nhân lên trong bào tương, phá hủy tếbào rối mới xâm lấn sang các tế bào khác Tổn thương nhất chính là viêm loét hoại tửniêm mạc đại tràng Triệu chứng lâm sàng điển hình là đi ngoài phân ít, có lẫn nhàymáu

EAEC-E.coli bám dính kết tập ruột

EAEC thường gây tiêu chảy kéo dài hoặc mạn tính, nhất là ở trẻ em Nó cũng

là một trong những căn nguyên quan trọng của nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở khách

du lịch Cơ chế bệnh sinh trong tiêu chảy do EAEC vẫn chưa được sáng tỏ hoàn toàn.Những yếu tố động lực chính của EAEC được nói đến gồm các diềm bám dính kết tậpAAF (aggregative adhesion fimbriae), Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR, proteinPet và độc tố EAST-1 (enteroaggregative heat-stable toxin-1) Diềm bám dính kết tậpđược cho là yếu tố quyết định độc lực Ba loại AAF đã được nói đến là AAF/I, AAF/II

và AFF/III, trong đó loại I và II có cấu trúc bó, loại III có dạng sợi riêng biệt Các AFFtạo nên kiểu bám dính hình chồng gạch trên tế bào Hep-2 Yếu tố aggR có vai trò điềuhòa sự biểu hiện của các AFF Protein Pet được tiết qua màng ngoài vi khuẩn, gây tích

tụ dịch và gây độc cho biểu mô tiêu hóa EAST-1 có khả năng phá hủy tế bào biểu mô.Ngoài các yếu tố dộc lực nêu trên EAEC còn tiết ra 1 protein có khả năng làm tan máu

và làm mất thăng bằng vận chuyển ion qua màng

Các yếu tố độc lực nêu trên của EAEC phần lớn được mã hóa bởi các gen nằmtrên plasmid có phân tử lượng 60 MDa Một số yếu tố độc lực đực mã hóa bởi các gentrên nhiễm sắc thể đang được nghiên cứu

Khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton, EAEC tạo thành váng đặc trưng

Tính chất này được dùng để sàng lọc nhanh các chủng E.coli thuộc loại EAEC.

Bảng 1.2: Tóm tắt các đặc điểm liên quan đến khả năng gây bệnh của các E.coli gây bệnh đường

ruột

Loại

E.coli hoặc yếu tố độc lực Gen động lực Cơ chế gây bệnh Đặc điểm lâm sàng

EPEC

Plasmid 50-70 MDa (EAF):

Mã hóa BFP (bundle-forming pilus),

Per (plasmid-encoded regulator) và

Ler (LEE-encoded regulator PAI

nhiễm sắc thể (LEE)

TTSS gồm: intimin (eaeA), các

protein tiết; Tir, EspA, EspB, EspD,

EspF, EspG và MAP

(mitochondria-associated protein)

EAST-1

CDT (Cytolethal distending toxin)

Bám dính tại chỗ nhờBFP

Tổn thương mô A/E

Các tổnthương A/E

Tiêu chảycấp

ETEC

ETEC

Các CFA mã hóa bởi plasmid: CFA-I

(fimbriae cứng), CFA-III (tạo bó),

CFA-II và CFA-IV (fimbriae mềm) và

pili dài liên quan với type IV

Độc tố chịu nhiệt LT I và LT II (mã

hóa bởi plasmid)

Độc tố vững bền với nhiệt STa và STb

(mã hóa bởi plasmid và transposon)

Bám vào niêm mạcruột non (CFA I-IV)

và sản xuất các độc tốruột LTI, LTII, STa,STb

Hoạt hóa adenylatecyclase- tăng cAMP –giảm hấp thu Na+/tăngtiết Cl- - tiêu chảyHoạt hóa guanylatecyclase- tăng cGMP –tiết chloride và/hoặcgiảm hấp thu NaCl –tiêu chảy

Tiêu chảycấp, phânthườngtoàn nướckhông cónhầy máu

EIEC Các gen trên plasmid 140 MDa mã Vi khuẩn bám và xâm Hội chứng

hóa các kháng nguyên xâm nhập

(invasion plasmid antigen) IPaA –

IpaD

nhập vào biểu mô đạitràng, nhân lên gâyviêm loét hoại tử niêmmạc đại tràng

lỵ trựckhuẩn

EAEC

Điểm bám dính kết tập AAF

(aggregative adhesion fimbriae)

Yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggr

Protein pet

Độc tố EAST-1 (enteroaggregative

heat-stable toxin-1)

Protein làm tan máu và mất thăng

bằng vận chuyển ion qua màng

AAF tạo nên kiểu bámdính hình chồng gạchaggR điều hòa sự biểuhiện của AAF

gây tích tụ dịch và gâyđộc tố cho biểu môtiêu hóa

EAST-1 phá hủy tếbào biểu mô

Protein làm tan máu

và làm mất thăng bằngvận chuyển ion quamàng

Tiêu chảykéo dài

tế bào biểu mô ruột

- ức chế quá trình tổnghợp protein của tế bàobiểu mô đại tràng, dẫnđến làm chết tế bào,

- gây hội chứng HUS

Tiêu chảy

ra máu (doxuất huyếtđại tràng)

EAST-1 phá hủy tếbào biểu mô

Tiêu chảyphânthườngkhông cómáu

EHEC còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga Yếu tố động lực chính của

EHEC là độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc đối với tế bào Vero VT

(veroccytotoxin) vì vậy loại này thuộc nhóm có tên là VTEC – Verocytotoxin E.coli.

Hiện nay, có ba loại Stx do EHEC sinh ra đã được xác định là Stx1, Stx2 và Stx2v.Các độc tố này được mã hóa bởi các gen prophage thích hợp trên nhiễm sắc thể

Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc các vi nhung mao hất thu của tế bào biểu môruột Nó cũng xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng, ức chế quá trình tổng hợpprotein dẫn đến làm chết tế bào Hậu quả là viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảyphân như máu Những trường hợp hoại tử nặng có thể gây thủng ruột

Stx còn có thể gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagicuremic syndrome) Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân,làm hẹp và tắc mao mạch tiểu cầu thận Hậu quả của quá trình này là mức lọc của thậnsuy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp.

 EPEC – E.coli gây bệnh đường ruột

EPEC được bắt đầu nghiên cứu rất sớm, từ những năm 1940 EPEC bám dínhvào niêm mạc ruột gây tổn thương đặc trưng là sự phá hủy vi nhung mao ở riềm bànchải của niêm mạc ruột Loại vi khuẩn này có vai trò rất quan trọng trong viêm dạ dàyruột gây tiêu chảy ở trẻ em

 DAEC – E.coli bám dính phân tán

DAEC là type gây bệnh được mô tả tương đối gần đây Nó được xác định làmột type gây bệnh riêng vì không có các gen độc lực đặc trưng của các type khác đãđược mô tả trước

Khác với E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC), các E.coli gây bệnh ngoài đường

ruột (ExPEC) là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội khi “lạc chỗ” Chúng có thể là thànhviên của hệ vi khuẩn bình thường ở ruột nhưng khi vào máu, vào dịch tủy não, vàođường tiết niệu thì trở nên gây bệnh, nhất là ở những người có cơ chế đề kháng bị suygiảm Tuy nhiên đã xác định được những gen độc lực của ExPEC thường gặp trongcác nhiễm trùng ngoài đường ruột

MAEC có kháng nguyên vỏ có liên quan về mặt hóa học và miễn dịch với

polysaccharide nhóm B của Neisseria meningitides Cho đến nay, hiểu biết về sự nhạy cảm của trẻ sơ sinh với loại E.coli này chưa đầy đủ Nhiều tác giả cho rằng có sự liên

quan chủ yếu đến cơ địa của trẻ Theo kết quả của nhiều nghiên cứu, tới 80% các

trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh do E.coli.

UPEC là nguyên nhân chủ yếu của nhiễm trùng đường tiết niệu yếu tố độc lực

quan trọng của UPEC là P-pili Nhờ Pili này, E.coli có thể gắn đặc hiệu vào kháng

nguyên P, là một trong các kháng nguyên nhóm máu Ngoài ra nó coàn có một số yếu

tố độc lực khác cũng tham gia vào cơ chế gây bệnh v\các nhóm huyết thanh hay gặp

là O1, O2, O4, O6, O7 và O75 Các chủng có kháng nguyên K1, K2, K3, K5,K12,K13 là hay gặp nhất những vi khuẩn này thường có các gen mã hóa cho các yếu

Qui trình chuẩn đoán trực tiếp E.coli cơ bản gống với qui trình chuẩn đoán các

vi khuẩn đường ruột

Có thể làm tiêu bản soi trực tiếp đối với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâmnước tiểu hoặc nước não tủy

Đối với viêm màng não mủ có thể phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của vikhuẩn bằng phản ứng ngưng kết latex Dễ làm, cho kết quả rất nhanh và độ tin cậy rấtcao Nguyên lý của phản ứng này như sau: các hạt latex có gắn kháng thể kháng

E.coli gây bệnh được trộn dịch nảo tủy, nếu trong bệnh phẩm có kháng nguyên đặc hiệu của E.coli thì phản ứng sẽ dương tính Đó là phản ứng ngưng kết thụ động.

Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nhất là nuôi cấy phân lập Bệnh phẩm phânđược nuôi cấy trên môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo.Nước tiểu giữa dòng được tiến hành cấy đếm trên môi trường đặc, trước đây thường

sử dụng thạch thường, hiện nay có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa cókhả năng định danh Tiến hành cấy máu khi nghi có nhiễm khuẩn máu

Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hóahọc và định tên bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanhmẫu

Để xác định các E.coli sinh độc tố người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp

khác nhau như phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm trên tế bào nuôi,phương pháp đồng ngưng kết, ELISA…

Kỹ thuật khuếch đại gen PCR cũng đã được áp dụng trong chẩn đoán E.coli Ở

nước ta hiện nay chủ yếu mới sử dụng PCR trong định danh khi vi khuẩn đã được

phân lập thuần nhất Các kỹ thuật PCR xác định E.coli trực tiếp từ bệnh phẩm đang

được nghiên cứu phát triển

3.2 Chẩn đoán gián tiếp

Trên thực tế phương pháp huyết thanh học không được sử dụng để chẩn đoán

các nhiễm khuẩn do E.coli.

4 Nguyên tắc điều trị và phòng bệnh

4.1 Điều trị

E.coli thuộc vào các vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là các chủng phân

lập được từ nước tiểu, vì vậy cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thíchhợp

Ngoài việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất có giá trị trong điều trịnhư bồi phụ nước, điện giải trong trường hơp ỉa chảy (việc này nhiều khi có vai tròquyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết các cản trở trên đường tiết niệu, rútống thông sớm nếu có thể được.

4.2 Phòng bệnh

Hiện nay chưa có phương pháp nào phòng bệnh đặc hiệu Để đề phòng nhiễm

khuẩn đường tiêu hóa do E.coli, thực hiện các biện pháp phòng bệnh chung không

đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác

Thực hiện các biện pháp ngăn ngừa nhiễm trùng bệnh viên vì E.coli là một

trong các vi khuẩn gây bệnh cơ hội quan trọng

Để phòng nhiễm khuẩn đường tiết niệu do E.coli: thực hiện vệ sinh vùng hậu

môn và bộ phận sinh dục ngoài, thực hiện nghiêm túc nguyên tắc vô trùng khi phảitiến hành thăm dò hoặc đặt thông đường tiết niệu Điều trị loại trừ các yếu tố nguy cơkhác

I Phương pháp truyền thống

1 Định lượng E.coli bằng phương pháp MPN

1.1 Nguyên tắc

Số lương E.coli trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp có thể được xác

định bằng phương pháp MPN ( Most Probable Number) Phương pháp này dựa vàonguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khácnhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ốngnghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham Mỗi nồng độ pha loãngđược ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiệndiện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệmcho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và được vào bảng MPN để suy ra

số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu

Môi trường và hóa chất :

- Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate)

- Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL)

- Môi trường lỏng E.coli (E.coli medium, canh EC)

Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham

úp ngược Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trongống Durham

- Môi trường thạch đĩa EMP

- Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate)

- Canh MR-PV

- Thuốc thử Methyl Read

- Thuốc thử α-napthol

I.2 Quy trình phân tích

Tuần tự cấy 1ml dung dịch mẫu đã pha loãng 10-1vào 3 ống nghiệm giống nhau,mỗi ống chứa 10ml canh LSB Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và

10-3 Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại(hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm) nếu nghi ngờ số lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao,phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn Ủ các ống nghiệm ở 370C trong 48giờ Ghi nhận ống có sinh hơi Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch mẫu từ các ốngLSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ Ghi nhận

số ống cho kết quả (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng

Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môitrường canh EC, ủ ở 44,5 ± 0,20C trong 24 giờ Đếm số lượng các ống cho kết quả (+)(sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng

Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ông (+) trên môi trường canh EC sang môitrường thạch đĩa MBN Ủ các đĩa này ở 370C trong 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giả

định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím) Chọn khuẩn lạc có đường kính lớn hơn1mm và cấy vào các môi trường MRVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử

nghiệm IMViC Khuẩn lạc E.coli giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là +

+ - - chính là E.coli Ống nghiệm cho kết quả trong môi trường EC và khuẩn lạc E.coli

giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm

có E.coli (+) Thực hiện tương tự cho tất cả các ông nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.

1.3 Cách đọc kết quả

Ở tất cả các trường hợp nêu trên, từ số lượng các ông nghiệm có E.coli (+) ở mỗi

độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thích hợp (bảng 3 x 3 tức 9 ống nghiệm) đểtính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay MPN/mlmẫu ban đầu chưa pha loãng

2 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

2.2 Môi trường và hóa chất

- Môi trường canh Tryptone Soya Agar (TSA) và môi trường Violet Red BileAgar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thủy tinh, đun chảy và làm nguội ởnhiệt độ 450C trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng

- Môi trường canh Escherichia coli broth (EC Broth) được phân phối 10ml trongmỗi ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược, hấp khử trùng để nguội và kiểm trakhông có sự hiện diện của bọt khí trong ống Durham Các ống EC này được bảo quản

rắn) Sau khi được làm đồng nhất bằng cách trên, dung dịch mẫu thu được có độ phaloãng là 10-1 so với ban đầu

Dịch mẫu đồng nhất được tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân bằng cáchchuyển 1ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng Dung dịch này

có độ pha loãng 10-2, sau đó tiếp tục chuyển 1ml dịch mẫu này vào ống nghiệm thứ haichứa 9ml dung dịch pha loăng ta sẽ thu được dịch mẫu có độ pha loãng 10-3 Tiếp tụcthực hiện để được các độ pha loãng thập phân tiếp theo sao cho chứa <100 tế bào

E.coli trong 1ml dung dịch pha loãng

Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri Bổ sung vào mỗi đĩa đãcấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt

450C Lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần để trộn dịchmẫu với môi trường Để nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ để hồi phục các tế bào bị tổngthương

Bổ sung vào mỗi đĩa 10 – 15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C trênmôi trường TSA Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37 ±

10C trong 24 – 48 giờ Thực hiện tương tự trên mẫu ở 2 nồng độ pha loãng liên tiếpsao cho mỗi đĩa xuất hiện từ 10 – 100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với mỗinồng độ pha loãng

Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muốimật, đường kính ≥ 0,5 mm), dung que cấy vòng chuyền sang môi trường canh EC, ủ ở

44 ± 0,50C trong 24 giờ

Chọn các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) và dung que cấy vòng chuyền sang cácmôi trường sau: canh Tryptone, canh MR-VP, thạch Simmon Citrate Ủ các môitrường trên ở 44 ± 0,50C trong 24 giờ

Thử nghiệm Indol, Methyl Read, Voges Proskauer, Citrate Ghi nhận khuẩn lạc

cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( IMViC là + + - -).

fi: độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếmR: tỷ lệ khẳng định

3 Phương pháp làm giàu vi khuẩn

3.1 Nguyên lý

Phương pháp này dựa vào làm giàu vi khuẩn trước trong canh thang dinh dưỡng

và MacConkey, rồi làm giàu trong canh thang LST và EE sau đó ria lên thạch L-EMB.Những khuẩn lạc khả nghi được kiểm tra về đặc tính sinh hóa và huyết thanh của EEC

3.2 Thiết bị và đồ thủy tinh

1 Chậu nước 440C và 41,50C

2 Tủ ấm 350C

3 Máy pha trộn

4 Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri

3.3 Môi trường và thuốc thử

1 Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46)

2 Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76)

3 Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14)

4 Môi trường indole và thuốc thử (mt 44, mt 98)

5 Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28)

6 Thạch MacConkey (mt 80)

7 Canh thang MacConkey (mt 17)

8 Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19)

9 Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6)

10 Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3)

11 Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86)

12 Canh thang urê (các thành phần là thạch urê nhưng không có agar) (mt 93)

13 Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54)

14 Kháng huyết thanh E.Coli

3.4 Cách làm

1 Chuẩn bị mẫu:

Cân 25g mẫu bằng thao tác vô khuẩn rồi cho vào 225ml canh thangMacConkey và 225ml canh thang dinh dưỡng trong blender vô khuẩn và làmđồng nhất trong 30 giây (1:10)

trong 6h, Chuyển một quai cấy sang 30ml canh thang EE Ủ ấm 41,50C trong18h.

4 Xét nghiệm sơ bộ về huyết thanh :

Trung hòa canh thang LST và EE với 10% NaHCO3, nhỏ một giọt canh thangcủa mỗi thứ lên trên phiến kính sạch và cho thêm một giọt huyết thanh đa giá

OB và một giọt nước muối 0,5% Trộn các giọt trên và xem ngưng kết

Đặc tính sinh vật hóa học của E.Coli

tiện khác biệt Sản xuất axit mạnh mẽ bởi các sinh vật như E.coli kết quả trong một

ánh xanh kim loại Yếu hơn quá trình lên men kết quả lactose trong môi trường vớimột màu hơi hồng tím Thuộc địa của men nonlactose vẫn không màu, hoặc ít nhấtkhông đậm hơn so với màu sắc của các phương tiện truyền thông

Hình 2.1: Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch EMB

Hình 2.3: Thử nghiệm Indole Ống 1: E.coli cho kết quả dương tính Ống 2: E.coli cho kết quả âm tính

Hình 2.4: Thử nghiệm Urease (1): E.coli (-) ; (2): E.coli (+)

Hình 2.5: Thử nghiệm Cytochrome oxidase với vi khuẩn E.coli

(A) Cho kết quả (-)

(A) (B)

Hình 2.6: Thử nghiệm VP (a): E.coli (+); (b): E.coli (-)

Hình 2.7: Thử nghiệm MR (a): E.coli (+); (b): E.coli (-)

II Phương pháp hiện đại

1 Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction)

1.1 Nguyên tắc

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp invitro để

tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu khuếch đại, nhân sốlượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzymepolymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

1.2 Môi trường tăng sinh

Do số lượng E.coli nhóm STEC, đặc biệt là E.coli gây bệnh hiện diện trong

thực phẩm rất ít, cho nên trước khi phân lập cần sử dụng môi trường tăng sinh peptonđệm có bổ sung kháng sinh cefiximw (0,0125mg/l) và vancomycin (8mg/l) để ức chếcác vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn sống hoại sinh khác

1.3 Môi trường phân lập

Hình2.8 : Thử nghiệm Citrate với vi khuẩn E.coli

(a): E.coli (+) (b): E.coli (-)

Môi trường phân lập là môi trường MacConkey (MAC), Sorbitol MacConkey(SMAC), Sorbitol MacConkey (CT-SMAC) có bổ sung kháng sinh cefixime

(0,05mg/l) và tellurite (2,5mg/l) Khoảng 90% E.coli đều lên men đường lactose, trên môi trường MAC, E.coli điển hình có khuẩn lạc màu đỏ, trên môi trường SMAC và CT-SMAC, E.coli không lên men đường sorbitol nên cho khuẩn lạc màu trắng, những dòng E.coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng.

Trên từng loại môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC chọn ngẫu nhiên 6-10khuẩn lạc rời rạc đại diện cho mỗi nhóm hình thái, cấy từng khuẩn lạc được chọn vàotừng ống thạch nghiêng NA Làm thử nghiệm sinh hóa IMViC cho từng khuẩn lac

riêng lẻ thuộc nhóm đó để xác định E.coli.

1.4 Trích ly DNA

Việc trích ly DNA được thực hiện như sau: thu khoảng 6-10 khhuẩn lạc E.coli

trên môi trường thạch (MAC hoặc SMAC, hoặc CT-SMAC) cho vào eppendorf đựngsẵn 0,4-0,5 ml nước cất hai lần vô trùng, đun sôi 10 phút, lấy ra và chuyển vào tủ âm -

700C giữ trong 10 phút Sau khi rã đông hoàn toàn, ly tâm 13000 vòng trong 3 phút

Để yên và hút phần dung dịch ở phía trên làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm)

Mẫu

MAC

(370C/24 giờ)

SMAC (370C/24 giờ)

Pepton (vancomycin,cefixime) (370C/24 giờ)

CT-SMAC (370C/24 giờ)

Chọn 6-10 khuẩn lạc theotừng nhóm riêng: trắng hoặcChọn 6-10 khuẩn lạc đỏ hồng

Sơ đồ 1: Qui trình phân lập, định tính và phát hiện gen độc lực E coli

Cấy từng khuẩn lạc được chọn vào từng ống thạch nghiêng NA (370C/24 giờ)

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc

đã chọn theo từng nhóm riêng và mỗi nhóm

cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4-0,5 ml H2O

cất khử ion 2 lần

Thử IMViC (+ + - -)

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)

Multiplex-PCR (+)

(-) Ly trích DNA riêng theo từng ống NA

Loại bỏ ống NA đã giữ Multiplex-PCR