Xây dựng Quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR(Polumerase Chain Reaction) và thử nghiệm ứng dụng

Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lân qui mô tác hại ở nhiều nước...

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐOÀN THỊ NGỌC TUYỀN

XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2005

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Linh Thước và thầy Nguyễn Tiến Dũng đã tận tình hướng dẫn em thực hiện luận văn này

Cảm ơn tất cả các thầy cô Khoa Sinh Trường Đại học sư phạm và Trường Đại học Khoa học tự nhiên (Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh) đã tận tâm giảng dạy trong suốt thời gian em học tập tại nhà trường

Cảm ơn các bạn Huệ, Na, Phượng, Thanh, Ánh và tất cả các bạn của Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen - Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tận tình hỗ trợ tôi về mặt cơ sở vật chất cũng như về mặt kĩ thuật

Cảm ơn gia đình đã hỗ trợ vật chất và động viên tinh thần cho con trong suốt thời gian học tập xa nhà

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AOAC : Assciation of Official Analytical Chemist (Hiệp hội các nhà phân

tích nhà nước)

bp : Base pair - cặp base

CEN : European Committee for Normalization (Hội đồng Châu Âu về chuẩn hóa)

FP : False positive (dương tính giả)

FN : False negative (âm tính giả)

KDa : Kilo Dalton (1000Da, đơn vị khối lượng protein)

RA : Relative accuracy (độ chính xác tương đối)

RS-P : Relative sensitivity (độ nhạy tương đối)

RS-N : Relative specificity (độ đặc hiệu tương đối)

ISO : International Standards Organisation (Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế) Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hội đồng phân tích thực

phẩm Bắc Âu)

PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ polymerase)

TAE : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)

TE : Tris - EDTA

Taq : Thermus aquaticus

UV : Ultraviolet (tia tử ngoại)

WHO : World Health Organization

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lẫn qui mô tác hại ở nhiều nước Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), có đến hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật gây ra [20]

Hiện nay, xuất khẩu thực phẩm đang chiếm tỷ trọng quan trọng trong kinh tế xuất khẩu của nước ta Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động rất lớn đến các tiêu chuẩn về chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến các trang thiết bị được xem là giải pháp đóng vai trò quyết định, giúp nâng cao năng lực kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Về mặt này việc kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật

gây bệnh trong thực phẩm như E coli, Samonella, Shigella, Virio… có vai trò rất quan trọng

E coli được xem là vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm, là loài vi khuẩn gây bệnh

cơ hội có thể gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội

chứng tả Ngoài ra, E coli còn gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng Qui trình kiểm tra E coli gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp

truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài 3 - 4 ngày) và độ nhạy thấp Trong khi đó các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử như lai phân tử, PCR có khả năng khắc phục được các nhược điểm này, đang được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất ở nước ta đã đặt ra yêu cầu cần có phương pháp

phát hiện nhanh E coli gây bệnh trong thực phẩm, thay thế các phương pháp truyền thống, cho

phép giám sát tính an toàn và giảm tối đa nguy cơ gây bệnh từ nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm

Do vậy, mục tiêu của đề tài luận văn này là thiết lập qui trình phát hiện E coli trong thực

phẩm bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay thế các phương pháp truyền thống

PHẦN I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM

1.1 Một số khái niệm liên quan

Trong lĩnh vực thực phẩm hiện nay, có hai khái niệm đang được sử dụng rộng rãi là vệ sinh thực phẩm và an toàn thực phẩm và một số khái niệm quan trọng khác cần được phân biệt

- Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : là khái niệm để biểu thị thực phẩm không chứa vi sinh vật gây bệnh và không chứa độc tố Khái niệm này cũng bao hàm tình trạng vệ sinh trong khi vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm

- An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: là khả năng không gây ngộ độc của thực phẩm đối với con người bởi vi sinh vật hoặc bởi hóa chất, các yếu tố vật lý Theo nghĩa rộng, khái niệm này còn được hiểu là khả năng cung cấp đầy đủ và kịp thời về số lượng và chất lượng thực phẩm khi một quốc gia gặp thiên tai hoặc một lý do nào đó Mục đích của an toàn thực phẩm là việc bảo đảm được thực phẩm không bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học, độc tố hoá học và các yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trong các quá trình sản xuất, vận chuyển, chế biến và bảo quản thực phẩm

- Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong thực phẩm Ngộ độc thực phẩm được chia thành 2 nhóm:

+ Ngộ độc do chất độc của vi sinh vật tạo ra trong nguyên liệu hoặc hóa chất từ quá trình

chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến… Các độc chất này đã có trong thực phẩm trước khi được tiêu thụ

+ Ngộ độc do nhiễm trùng: là trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào cơ thể bằng đường tiêu hóa và tác động tới cơ thể do sự hiện diện của bản thân vi khuẩn hoặc do độc tố của vi khuẩn

- Độc tố [7, 8]: là các hợp chất hóa học có trong nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm ở

một hàm lượng có thể gây ngộ độc khi được tiêu thụ bởi người hay động vật Độc tố có thể tồn

tại ở nhiều trạng thái khác nhau và được tạo ra trong thực phẩm bằng nhiều con đường khác nhau Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật được tạo ra bằng 2 con đường cơ bản sau:

+ Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao trong thực phẩm, khi tế bào bị chết đi, độc tố được phóng thích vào thực phẩm Loại độc tố này được gọi là nội độc tố (endotoxin)

+ Tế bào vi sinh tổng hợp các protein có độc tính được tiết ra ngoài tế bào Loại độc tố này được gọi là ngoại độc tố (exotoxin)

Nội độc tố và ngoại độc tố khác nhau nhiều về bản chất hóa học, các đặc tính hóa học và phương thức hoạt động Bảng 1 so sánh một số đặc trưng của hai loại độc tố này

Bảng 1 So sánh một số đặc điểm của ngoại độc tố và nội độc tố của vi khuẩn [7, 26]

Ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố (endotoxin)

- Do vi khuẩn còn sống tiết ra

- Có ở vi khuẩn Gram dương và Gram

âm

- Bản chất là protein

- Không bền với nhiệt

- Độc lực cao

- Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không

gây sốt

- Do vi khuẩn chết phóng thích

- Có ở vi khuẩn Gram âm, ít ở vi khuẩn Gram dương

- Bản chất là lipopolysaccharide

- Tương đối bền với nhiệt

- Tương đối ít độc

- Triệu chứng bệnh không đặc hiệu, hay gây sốt, choáng

1.2 Những vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm thường gặp

- Coliform [10]: Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm các vi sinh vật

dùng để chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm Nhóm coliform gồm những vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy lỏng Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm này lại được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân của các loài động vật Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người và các động vật máu

nóng bao gồm các giống Escherichia, Klebsiella và Enterobacter Trong các thành viên của

nhóm coliform phân thì E coli là loài được sự quan tâm nhiều nhất về vệ sinh an toàn thực phẩm

- Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn hiện diện trong ruột người và động vật, được thải ra

ngoài thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp trong đất và nước Năm 1971 E coli được

xếp vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là một vi sinh vật chỉ thị nhiễm khuẩn thực phẩm Loài này là trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất cơ bản của vi khuẩn

đường ruột Khả năng gây bệnh của E coli rất đa dạng và tùy thuộc vào vị trí xâm nhập Đối với nhiễm khuẩn ngoài đường ruột, E coli gây nhiều bệnh khác nhau với các triệu chứng không

đặc trưng và được xem là những vi khuẩn gây bệnh cơ hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm

bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu) Ngoài ra E coli còn có thể gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E coli gây các bệnh

viêm ruột, tiêu chảy ở trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả

- Salmonella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động bằng

chu mao Vi khuẩn này chịu nhiệt kém nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate Người ta đãphân lập được 2324 chủng Salmonella khác nhau Ngoài nội độc tố Salmonella có thể tạo ra hai loại ngoại độc tố là độc tố ruột

(enterotoxin) và độc tố tế bào (cytotoxin) Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O và H, người ta chia

Salmonella gây bệnh ra thành 3 nhóm: nhóm chỉ gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động

vật và nhóm gây bệnh cho người và động vật Ở người Salmonella có thể gây sốt thương hàn (do S typhi hay S typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S typhimurinum, S enteritidis) Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường miệng qua thức ăn

Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu và các cơ quan khác gây viêm Ngộ độc

thực phẩm do nội độc tố của Salmonella gây ra các triệu chứng như nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh,

tiêu chảy Sốt xuất hiện vào 12 – 24 giờ sau khi ăn thức ăn có chứa 1 – 10 triệu tế bào

Salmonella/g thức ăn Bệnh kéo dài 2 – 3 ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi nhưng cũng có

trường hợp tử vong, đặc biệt là người già, trẻ sơ sinh và người suy yếu hệ miễn dịch

- Shigella [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý,

tăng trưởng ở nhiệt độ từ 10 – 40C, pH 6 – 8, có kháng nguyên O, một số có kháng nguyên K,

không có kháng nguyên H Shigella gồm có 4 loài: S dysenteriae, S flexneri, S boyalia, S

sonnei Trong đó S dysenteriae type 1 tạo độc tố thần kinh có độc lực rất cao, đã từng gây những

dịch lớn Tỉ lệ tử vong của bệnh do Shigella cao hơn bệnh do Salmonella Nhiễm khuẩn Shigella chỉ giới hạn ở đường tiêu hóa chỉ cần 10 – 100 tế bào cũng đủ gây bệnh Vi khuẩn này tạo hai

dạng độc tố Nội độc tố lipopolysaccharide có ở thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây các triệu chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ở ruột non, nếu tác động lên hệ thần kinh có thể gây tử vong Vi khuẩn sẽ tấn công niêm mạc ruột già tạo vết loét rồi hoại tử Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng quặn dữ dội, đi tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt và có máu được gọi là

hội chứng lỵ Shigella

- Vibrio [6,10]: là phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao ở một đầu, hiếu khí hoặc

yếm khí không bắt buộc Vibrio thường gặp trong thực phẩm, nhất là trong hải sản, gồm khoảng

28 loài, trong đo có 4 loài gây bệnh là V parahaemolyticus, V cholerae,V vulnificus và V

alginolyticus

+ V cholerae là loài vi khuẩn phổ biến trong thiên nhiên gây dịch tả ở người sử dụng nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm Bệnh tả xuất hiện khi V cholerae xâm nhập vào đường tiêu

hóa, qua được hàng rào axit của dịch vị, kết dính vào màng nhầy biểu mô của ruột và tiết ra độc

tố ruột Độc tố ruột V cholerae là một protein không bền nhiệt, cấu tạo bởi đơn vị A và B Phần

B giúp độc tố gắn vào thụ thể trên bề mặt tế bào ruột là GM1 Tiểu đơn vị A vào ruột tăng hoạt động của adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP quá nhiều làm tăng tiết ồ ạt nước và chất

điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy Virio còn có thể tạo hemolysin (chủng

Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận độc tố

+ V parahaemolyticus đa số gây độc trong thức ăn làm viêm ruột

+ V vulnificus hiện diện rộng rãi ở nước biển, hải sản, có khả năng tổng hợp độc tố cytotoxin, hemolysin, cytolysin Tỉ lệ tử vong bởi độc tố của vibrio thường rất cao

+ V alginolyticus ít gặp và được phát hiện gây bệnh lần đầu tiên vào năm 1971 Vi

khuẩn này có khả năng tạo độc tố ruột Khi vào cơ thể, chúng phát triển rất nhanh trong máu và gây bệnh

- Yersinia [7,10]: là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột

chịu nhiệt Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm

mạc hầu trong, đường hô hấp) Khi vào cơ thể Yersinia sinh sản rất nhanh, biểu hiện lâm sàng là

các hạch trên cơ thể Vi khuẩn đi vào máu và xâm nhập vào các phủ tạng gây xuất huyết Thời gian ủ bệnh là 2 – 7 ngày Sau đó có thể sốt cao và đột ngột, hạch to dần gây đau đớn Trường hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm thấy bứt rứt, lo âu Trường hợp nhiễm trùng máu sớm có thể kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nếu nhiễm muộn thì đông máu nội hạch, hạ huyết áp, người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim

- Proteus [8,10]: là vi khuẩn có trong tự nhiên, trong đường tiêu hóa của người và động

vật Thực phẩm bị nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từdụng cụ vật liệu chế biến thực

phẩm không được xử lý tốt Proteus chỉ gây độc khi lượng tế bào trong cơ thể đủ lớn Độc tố chỉ

đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả năng thẩm thấu của niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm nhập vào máu nhanh và nhiều hơn Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng 3 giờ, đôi khi kéo dài 16 giờ) Khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh bị nôn mữa, tiêu chảy cấp, viêm dạ dày, ruột Nhiệt độ cơ thể tăng Bệnh xuất hiện rất nhanh nhưng cũng khỏi nhanh Cơ thể sẽ phục hồi sau

1 – 3 ngày và không gây tử vong

- Staphylococcus [6,10]: là cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với nhau

hình thành chùm, thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật

Staphylococcus tạo 9 loại độc tố chịu nhiệt (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) và các enzyme có khả năng hỗ trợ cho độc tố gây độc ở người Nếu bị ngộ độc chỉ sau 1- 8 giờ người bệnh sẽ buồn nôn, ói mữa, tiêu chảy dữ dội, không sốt và phục hồi Lượng độc tố có thể gây ngộ độc cho người là 2mg

- Clotridium [6,10]: là những trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát

triển tối ưu 43 – 47C Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là:

+ C botulium lần đầu tiên được ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 và có 6 người chết do nhiễm độc C botulium có khả năng tạo độc tố thần kinh và rất nhiều độc tố khác nhau

(A, B, F, G, G2, D và G) Độc tố thường có độc lực rất cao

+ C perfringens phát triển ở nhiệt độ từ 12 - 50C, bị ức chế ở nồng độ muối NaCl 6% Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm do C perfringens khi mật độ tế bào trên 106 tế bào/gam

thực phẩm Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ Triệu chứng là đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn Độc tố của C perfringens bị bất hoạt ở 60C trong 10 phút

- Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu là L monocytogenes, là vi khuẩn ưa lạnh, có thể

phát triển ở nhiệt độ 2,5 - 44C, thường hiện diện trong trong sữa, thịt, cá, rau và cả nước bề mặt Triệu chứng bệnh là tiêu chảy, sốt nhẹ Trường hợp nặng, chủng gây bệnh có thể sinh sản trong các đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt và có thể xâm nhập vào bào thai trong bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non hoặc nhiễm trùng thai nhi

Ngoài các vi khuẩn thường gặp kể trên còn có nhiều vi khuẩn khác có vai trò nhất định

trong việc gây bệnh cho người từ thực phẩm như Bacillus cereus, Campylobacter jejuni,

Corynebacterium, Aeromonas hydrophila

- Virus [6,10]: là nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm

Virus gây bệnh ở thực phẩm ít được nghiên cứu do khó nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy thông thường Có rất nhiều vụ dịch hay ca bệnh từ thực phẩm do virus gây ra nhưng trong nhiều trường hợp người ta không phát hiện được nguồn gốc gây bệnh Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan

truyền mầm bệnh Một số virus trong thực phẩm gây bệnh ở người đã biết là virus Fadeno serotype 40 và 41 gây loét dạ dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus

Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau

bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type 1 – 3 và Echo type 1 –

65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm)

- Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: một số loài có khả năng tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư

ở người và động vật Trong thực phẩm, một số loài có khả năng tạo ra các độc tố, thường gặp và

nguy hiểm nhất là aflatoxin do Aspergillus flavus và A parasiticus tạo ra Mức độ ngộ độc bởi

nấm mốc là khác nhau, biểu hiện như nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương ở gan, thận, túi mật và ống mật Một số độc tố còn gây u tuyến hoặc u gan, gây thoái hóa tế bào

nhu mô gan, xơ hóa Citrinin của Penicilium citrinum và P viridicatum có thể gây các bệnh tăng

urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận Một số độc tố của nấm mốc như tetronic acid, terestic acid, viridicatic acid tác động vào tim gây độc đối với chức năng của tim Độc tố của

Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus tác động

- Tảo sinh độc tố [7]: các tảo này làm ô nhiễm nguồn nước, thủy sản, gây ngộ độc cho động vật hoang dã, gia súc, gia cầm và con người Các loài tảo độc có thể chia ra thành 3 nhóm:

+ Tảo Dinoflabellates: có mặt trong hơn 75% trường hợp thủy triều đỏ nhưng chỉ có 9,5% có độc tính nói chung và 1,5% gây độc cho người Thường gặp là các giống Gymmodinium,

Pyrodinium, Dinophysic, Alexandrium, Gonyaulas

+ Tảo silic: thường sinh ra domoic, là một axit amin gây độc cho hệ thần kinh trong cơ thể

+ Tảo lam: có nhiều loại, tạo nhiều loại độc tố khác nhau, đặc biệt là các chất có hiệu

ứng gây độc cho hệ thần kinh như Aphanizomenonf aquae sinh ra các alkaloid gây độc cho hệ

thần kinh gây ảo giác

2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ BỆNH HỌC CỦA E COLI

2.1 Đặc điểm sinh học

- Phân loại và đặc điểm hình thái [8]

Escherichia coli còn có tên là Bacterium coli comme, Bacillus coli communis do Escherich

phân lập năm 1885 từ phân trẻ em Ngày nay, E coli được xếp vào họ Enterobacteria, giống

Escherichia, loài E coli Trong giống Escherichia, phản ứng sinh hóa để phân loại ít có giá trị,

việc phân chia thành các type thường phải căn cứ vào cấu tạo kháng nguyên E coli là trực

khuẩn hình gậy ngắn kích thước 2 – 3 x 6m, hai đầu tròn (Hình 1), tế bào đứng riêng lẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có tiên mao chung quanh thân nên có thể di động, không tạo bào tử, Gram âm, thỉnh thoảng có hiện tương bắt màu ở hai đầu

Hình 1 E coli dưới kính hiển vi điện tử quét SEM [10]

- Đặc điểm nuôi cấy [6,8]

E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ ý, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 - 44C

(tối ưu ở 37C), pH từ 5,5 – 8,5 (tối ưu ở 7,4) Khi tăng trưởng trên mặt thạch PCA ở 37C trong

24 giờø, E coli hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, trong, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3 mm Trong môi trường nước peptone E coli phát triển tốt, làm môi trường rất đục có

lắng cặn màu tro nhạt ở đáy dụng cụ nuôi cấy, đôi khi hình thành màng xám nhạt Canh trường

có mùi phân thối Trên môi trường Endo, E coli hình thành những khuẩn lạc màu đỏ ánh kim Trên môi trường DA (Desoxycholate Agar), E coli cho khuẩn lạc màu đỏ, dẹt tròn và khô Trên môi trường EMB( Eosine Methylene Blue), E coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen, đỏ tía

thường có ánh kim, bờ tròn đều Vi khuẩn này không phát triển ở môi trường Kauffmann và môi trường Wilson Blair

- Đặc điểm sinh hóa [10]

E coli lên men sinh hơi với nguồn cacbon là glucose, galactose, lactose, maltose,

arabinose, xylose, ramnose, mannitol, fructose; có thể lên men hay không lên men saccharose, rafinose, esculin, duncid, glycerol; ít khi lên men inulin, pectin, adonite; không lên men dextrin, amidon, glycogen, inositol, cellobiose Vi khuẩn thường sinh indol, không sinh urea và H2S, có sinh lysin decarboxylase, không sử dụng citrate Sự tăng trưởng của vi khuẩn bị ức chế bởi chlorine, các dẫn xuất của muối mật, brilliant green, sodium deoxycholate, sodium tetrathionate,

selenite Để phân biệt E coli với các vi khuẩn đường ruột khác, 4 tính chất sinh hoá thường

được dùng là Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và Citrate( còn được gọi là thử nghiệm IMViC)

+ Indol (I): trong môi trường có tryptophan, tryptophanase của E coli thuỷ phân

tryptophan thành indol Để phát hiện indol, dùng vài giọt thuốc thử Kovac,s có chứa chất dimethylaminobenzaldehyde Chất này sẽ kết hợp với indol tạo nên hợp chất muối dimethyl amonium có màu đỏ

p-+ Methyl Red (đỏ methyl, MR): khi được nuôi cấy trong môi trường có glucose, E coli

sẽ tạo ra một nồng độ H+ cao ( pH < 4,5) Khi bổ sung vào môi trường đã nuôi cấy 24 giờ ở 37C vài giọt thuốc thử Methyl Red, môi trường sẽ có màu đỏ

+ Voges Proskauer (VP): trong quá trình lên men glucose, vi sinh vật có thể cho những sản phẩm cuối khác nhau, một trong số đó là acetoin Khi bổ sung vào môi trường vài giọt potassium hydroxide (40%) và -naptol (5% trong cồn tuyệt đối), acetonin sẽ tạo ra một phức hợp màu đỏ

+ Citrate (C): trong môi trường Simons có nguồn C duy nhất là citrate, vi khuẩn nào sử dụng được citrate sẽ làm kiềm hoá môi trường và điều này được nhận diện bởi sự đổi màu của

môi trường (xanh lá cây thành xanh dương)

E coli có kết quả thử nghiệm IMViC là như sau : I (+), MR (+), VP (-) và C (-)

- Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên [22]

Từ năm 1930, Kauffmann đã đưa ra biểu đồ phân type huyết thanh của E coli dựa trên

kháng nguyên thân (O), kháng nguyên vỏ (K) và kháng nguyên lông ( H )

+ Kháng nguyên O được cấu tạo bởi phức hợp lipopolysacharide, có liên kết chéo về

đặc tính huyết thanh với vi khuẩn khác như Shigella, Samonlla

+ Kháng nguyên K có thành phần chính là polysaccharide có tính axit và được chia làm

3 nhóm A, B và L Tính ngưng kết của nhóm A không bị bất hoạt ở 121C trong khi L bị bất hoạt

ở 100C trong 1 giờ

+ Kháng nguyên H có tính đa dạng phụ thuộc vào sự hiện diện của tiên mao ở từng

chủng Nhiều E coli ban đầu khi phân lập thì không di động hoặc chuyển động chậm nhưng khi

được chuyển qua môi trường thạch bán rắn thì di động tích cực Chỉ những chủng di động mới có kháng nguyên H

- Phân bố

E coli hiện diện ở phần sau của ruột, nhiều nhất là ở ruột già, ít khi ở dạ dày hay phần

trước ruột động vật (trâu, bò, heo, chó, mèo, gia cầm và người) Các loài động vật ăn thịt và loài

hỗn thực bài tiết nhiều E coli hơn loài ăn cỏ Vi khuẩn này được thải theo phân người và động vật ra ngoài và nhiễm vào đất và nước Việc phát hiện E coli trong nguồn nước là một thử nghiệm chính nhằm xác định nước có bị nhiễm phân hay không Trước đây, E coli được xem là

một vi khuẩn bình thường trong ruột Hiện nay có nhiều chủng được xem như một trong những tác nhân gây tiêu chảy, đặc biệt ở trẻ em

2.2 Đặc tính gây bệnh [1,7]

E coli sống cộng sinh trong ruột người Bình thường vi khuẩn này không gây bệnh và ức

chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác, tổng hợp vitamin C và K rất cần thiết cho con

người Khi tỉ lệ E coli giảm xuống dưới 20% so với tổng số vi sinh vật đường ruột thì mới xuất

hiện các triệu chứng rối loạn tiêu hóa do loạn khuẩn

Một số chủng E coli có khả năng gây bệnh Bệnh gây ra bởi E coli thay đổi theo vị trí

xâm nhập và chủng gây bệnh Một số biểu hiện lâm sàng thường gặp là:

- Nhiễm khuẩn đường tiểu: E coli có thể gây bệnh nhiễm khuẩn đường tiểu với các

triệu chứng như tiểu nhiều lần, tiểu lắt nhắt, tiểu đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ Có trường hợp biến chứng thành nhiễm khuẩn tử cung, đường niệu, ống dẫn trứng, thận và nhiễm khuẩn máu

- Nhiễm khuẩn máu: khi sức đề kháng của cơ thể người giảm, vi khuẩn có thể vào máu và gây nhiễm khuẩn Thường gặp ở trẻ sơ sinh và sau khi nhiễm khuẩn đường tiểu

- Viêm màng não: E coli và streptococci nhóm B là những nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não ở trẻ em E coli chiếm khoảng 40 trường hợp gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh, trong đó 75% E coli có kháng nguyên K1

- Tiêu chảy và các bệnh đường ruột: trước đây, vai trò gây tiêu chảy của E coli ít được

đề cặp đến Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của kĩ thuật xét nghiệm, người ta ngày càng phát

hiện được nhiều chủng E coli gây tiêu chảy và các bệnh đường ruột khác E coli được xem là

nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy, đặc biệt là trẻ em Bệnh gặp khắp nơi trên thế giới,

ở các nước phát triển lẫn các nước đang phát triển Nhiều nơi phát sinh thành dịch do khả năng lây lan rất nhanh và gây hiệu quả nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng

Người ta chia các chủng E coli gây bệnh đường ruột ra thành các nhóm sau:

- EPEC (Enterophathogenic E coli): là các chủng E coli đầu tiên được xác định gây

bệnh tiêu chảy ở người Nhóm này gồm một số typ huyết thanh cổ điển gây viêm ruột và tiêu chảy dạng nước hoặc lẫn máu ở trẻ em cũng như người lớn

- EIEC (Enteroinvavise E coli): gây tiêu chảy với triệu chứng lâm sàng dạng lỵ giống

Shigella Bệnh thường gặp ở trẻ em lẫn người lớn và được xác định khi thấy có máu và đờm

xuất hiện trong phân

- ETEC (Enteroxigenic E coli): gây tiêu chảy cho trẻ em và 20 – 65% khách du lịch

đến những nước đang phát triển hoặc những vùng mà điều kiện vệ sinh còn kém ETEC xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa từ nước và thức ăn Khả năng gây bệnh của ETEC tùy thuộc vào khả năng bám dính vào thành ruột và tạo ra một hay nhiều độc tố Độc tố ETEC gồm 2 loại

ST và LT Độc tố ST (Heat stable toxin) là độc tố bền nhiệt gồm 2 loại là STI (STa) và STII (STb) Độc tố LT (Heat labile toxin) là độc tố không bền với nhiệt, có cấu trúc và chức năng

tương đương như độc tố của Vibrio cholerae là một protein được cấu tạo bởi một tiểu đơn vị A

(30k Da) và 5 tiểu đơn vị B Độc tố LT gồm 2 loại LT1 và LT2

- EHEC (Enterohemorrhagic E coli): gây xuất huyết ruột, còn có tên là VTEC (Verocytocin - producing E coli), do có khả năng sản xuất độc tố verocytocin có độc tính đối với

tế bào vero VTEC không những là nguyên nhân gây tiêu chảy mà còn là nguyên nhân gây hai biến chứng có thể dẫn tới tử vong là viêm đại tràng xuất huyết và hội chứng tan máu urê huyết

(50% ca bệnh dẫn tới tử vong) E coli O157:H7 là đại diện của nhóm này, tạo ra một loại độc tố mạnh Nguồn thức ăn dễ nhiễm E coli O157: H7 là xúc xích, sữa không qua khử trùng pasteur,

nước trái cây, nước uống… Vi khuẩn trong phân của người bị tiêu chảy có thể được lây lan sang

người khác nếu thói quen rửa tay hoặc vệ sinh không tốt Triệu chứng gây bệnh bởi E coli

O157: H7 là tiêu chảy nặng và chuột rút bụng, ít khi bị sốt Bệnh sẽ khỏi sau 5 - 10 ngày Ở một số người, đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi và người già, bệnh có thể biến chứng thành hội chứng tan máu urê huyết, khoảng 2 - 7 trường hợp lây nhiễm dẫn đến biến chứng trên

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E COLI TRONG THỰC PHẨM

3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống [6,10]

Phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát hiện E coli gồm ba bước: (1) tăng sinh chọn

lọc trên môi trường phù hợp như BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) hoặc canh Lauryl Sulphate Tryptose; (2) phân lập trên một các môi trường như Endo, EMB (Eosine Methylene Blue Agar), DA (Desoxycholate agar) và (3) thử sinh hóa trên các môi trường MRVP (Methyl Red Voges Proskauer) và Simons citrate agar

- Tăng sinh chọn lọc: mục tiêu của bước này là làm tăng số lượng E coli có trong mẫu,

ức chế một số lượng lớn các sinh vật khác Môi trường dùng để tăng sinh chọn lọc là BGBL vì

trong thành phần của môi trường này có chứa mật bò chọn lọc vi khuẩn Gram âm, ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương

- Phân lập: bước này nhằm tách biệt và nhận dạng E coli từ tập hợp các quần thể vi sinh

vật khác nhau trong mẫu sau bước tăng sinh chọn lọc Có nhiều môi trường rắn khác nhau được

sử dụng để phân lập E coli, mỗi môi trường nhận dạng một vài đặc tính chung nhất của E coli Mức độ chọn lọc, tính đặc trưng và hình thái biểu hiện khuẩn lạc của E coli trên từng môi

trường cũng khác nhau Vì vậy các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích cùng một lúc sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau để tăng cường khả năng phát

hiện E coli, trong đó môi trường EMB được khuyến khích sử dụng Các biểu hiện của E coli

trên các môi trường khác nhau như sau:

+ Trên môi trường Endo khuẩn lạc E coli thường có màu đỏ ánh kim tròn, bờ đều,

- Thử phản ứng sinh hóa: chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là E coli từ môi trường phân

lập để thử nghiệm IMViC (trang 13, 14)

Mẫu kiểm được kết luận là có E coli khi làm đổi màu và sinh hơi trên môi trường tăng sinh, tạo

khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập và cho kết quả sinh hóa là: I (+), MR (+), VP (-),

Ci (-)

Phương pháp này cho kết quả sau 4 - 6 ngày kể từ ngày phân tích Mặc dù tiêu tốn nhiều thời gian và công sức, song phương pháp truyền thống vẫn được áp dụng tại nhiều nước trên thế giới, vẫn được xem là phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá các phương pháp thay thế khác

3.2 Các phương pháp cải tiến

Do phương pháp truyền thống tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức, tốn kém nên nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được phát triển và thương mại hóa [10] Một số phương pháp không truyền thống đang được phát triển và sử dụng là:

- Phương pháp ELISA ( Enzyme - Linked Immunosorbent Assay) [4, 10]

Phương pháp ELISA (hấp thụ miễn dịch dùng enzym) được quan tâm nhiều do đơn giản và hiệu quả cao Phương pháp này được dựa trên nguyên tắc là sử dụng kháng thể phủ bên ngoài những đĩa giếng (microplate) Kháng nguyên (nếu có) trong mẫu sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxidase hoặc alkaline phosphatase Khi bổ sung một cơ chất đặc hiệu vào giếng, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm có màu hoặc phát sáng Theo dõi sự đổi màu có thể phát hiện và định lượng được kháng nguyên trong mẫu Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao ELISA đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng

các bộ hóa chất (kit) thương mại (phát hiện Samonella, E coli gây bệnh, Listeria…) và có thể

được cải tiến để tự động hóa ELISA có thể sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh Kỹ thuật này có độ nhạy phát hiện khoảng

106 CFU/ml Tuy nhiên trong phương pháp này vẫn cần thực hiện bước tăng sinh và tăng sinh chọn lọc trước khi thực hiện các phản ứng miễn dịch

- Phương pháp lai phân tử [4,10]

Phương pháp lai phân tử để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật Cơ sở của phương pháp này là sự bắt cặp của hai sợi nucleic acid mạch đơn (DNA, RNA) nếu có hai trình tự bổ sung ngược chiều nhau ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tách mạch Tm của hai phân tử nucleic acid mạch đơn Một trong hai mạch DNA bổ sung (thường là DNA mục tiêu) được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô Sự lai phân tử xãy ra khi đoạn mẫu dò có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ Sự lai phân tử còn có thể xãy ra giữa DNA và RNA [10] ETEC là một trong những vi sinh vật gây bệnh đầu tiên được phát hiện bằng phương pháp lai phân tử Năm 1982, người ta đã sử dụng có hiệu quả các mẫu dò DNA để phát hiện gen mã hóa ST và

LT trong mẫu phân và mẫu môi trường bằng phương pháp lai phân tử Hiện nay đã có một số bộ

kit thương mại dựa trên kĩ thuật phân tích nucleic acid dùng trong phát hiện E coli gây bệnh

trong thực phẩm

4 PHƯƠNG PHÁP PCR PHÁT HIỆN E COLI TRONG PHẨM [4, 10]

Dựa trên sự hiểu biết về nguyên tắc nhân bản DNA trong tế bào, năm 1985 Karl Mullis và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp cho phép nhân bản sao của DNA trong ống nghiệm gọi là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Đây là một trong những phương pháp nhân bản DNA in vitro được sử dụng rộng rãi nhất

4.1 Nguyên tắc

Tất cả DNA polymerase đều cần mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen Mồi là đoạn oligonucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, phản ứng PCR cho phép nhân bản đoạn DNA nằm giữa hai mồi thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide Như vậy để khuếch đại (nhân bản sao) một trình tự DNA xác định, cần có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA để tạo cặp mồi bổ sung chuyên biệt Cặp mồi này gồm mồi xuôi (sense primer) và mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gen

Phương pháp PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước là:

- Bước biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan (tách mạch) Tm của phân tử DNA (thường là 94 - 95C) trong vòng 30 - 60 giây Mạch đôi DNA tách

ra thành dạng mạch đơn để làm khuôn cho phản ứng PCR

- Bước bắt cặp (anealation): trong bước này, nhiệt độ phản ứng được hạ thấp hơn Tm của mồi và DNA, cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70C tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài 30 - 60 giây

- Bước kéo dài (elongation): được xúc tác bởi DNA polymerase các deoxynucleoside triphosphate lần lượt gắn vào đầu 3’-OH mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Mạch mới được tạo thành từ mồi được nối dài Nhiệt độ phản ứng khoảng 72C

Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần (mỗi chu kỳ) lại làm tăng gấp đôi số lượng bản sao của lần trước (Hình 2, 3) Đây là sự khuếch đại bản sao theo cấp số nhân Trong thực tế sau 30 - 40 chu kỳ, phản ứng sẽ tạo ra khoảng 106 bản sao Sau phản ứng PCR, sản phẩm phản ứng được điện di trên gel agarose và vạch của sản phẩm khuếch đại được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể thấy được dưới hộp đèn soi UV bước sóng 312nm

Hình 2 Các bước trong phản ứng PCR

Hình 3 Số lượng bản sao DNA qua các chu kỳ khuếch đại của phản ứng PCR

4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

- DNA khuôn: về lý thuyết DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng trên thực tế kĩ thuật này cũng cho phép khuếch đại trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt Lượng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR ở mức 1pg Lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là vạch kí sinh Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người đã chết

- Enzyme: thông thường DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải chịu được nhiệt độ biến tính DNA để có khả năng xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối của quá trình phản ứng Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối

nước nóng Thermus aquaticus Ngày nay, nhiều loại enzyme polymerase chịu nhiệt khác đã

được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện và chuyên biệt hơn Enzyme Tth

polymerase được tách từ Thermus thermophilus vừa có thể hoạt động như một enzyme phiên mã

> 20 chu kỳ

ngöôïc ñeớ hình thaønh cDNA trong tröôøng hôïp khuođn laø RNA, vöøa coù khạ naíng xuùc taùc phạn öùng khueâch ñái DNA

- Moăi vaø nhieôt ñoô lai: moăi laø moôt trong nhöõng yeâu toâ quan tróng ñeơ ñát ñöôïc söï khueâch ñái ñaịc tröng Vieôc thieât keâ vaø chón moăi phại ñát caùc yeđu caău sau:

+ Trình töï cụa moăi ñöôïc chón sao cho khođng coù söï baĩt caịp boơ sung giöõa moăi “xuođi” vaø moăi “ngöôïc”, khođng coù nhöõng caâu truùc “kép toùc” do söï baĩt caịp boơ sung giöõa caùc phaăn khaùc nhau cụa moôt moăi

+ “Nhieôt ñoô noùng chạy” (Tm) cụa moăi xuođi vaø moăi ngöôïc khođng caùch bieôt quaù xa Thaønh phaăn nucleotide cụa caùc moăi cađn baỉng traùnh chöùa nhieău GC

+ Moăi phại daịc tröng cho trình töï DNA caăn khueâch ñái, khođng truøng vôùi trình töï laịp lái tređn gen

+ Trình töï naỉm giöõa hai moăi xuođi vaø ngöôïc khođng quaù lôùn, phạn öùng PCR toât nhaât cho nhöõng trình töï nhoû hôn 1kb

- Caùc thaønh phaăn khaùc trong phạn öùng PCR: boân loái nucleotide (dNTP) thöôøng ñöôïc söû dúng ôû noăng ñoô laø 200M cho moêi loái nucleotide Noăng ñoô dNTP cao hôn deê daên ñeân söï khueâch ñái kyù sinh Söï maât cađn baỉng trong thaønh phaăn caùc nucleotide laøm taíng caùc loêi sao cheùp cụa polymerase Noăng ñoô Mg2+ cuõng laø moôt nhađn toâ ạnh höôûng ñeân quaù trình khueâch ñái Noăng ñoô toâi öu cụa ion naøy khođng tuađn theo moôt quy luaôt chung, thođng thöôøng phại ñöôïc xaùc ñònh cho töøng phạn öùng

- Soâ löôïng chu kyø phạn öùng: Soâ löôïng chu kyø trong moôt phạn öùng PCR thođng thöôøng khođng vöôït quaù 40 chu kyø Do phạn öùng PCR dieên tieân qua 2 giai ñoán, trong giai ñoán ñaău soâ löôïng bạn sao taíng theo caâp soâ nhađn tư leô vôùi löôïng maêu ban ñaău Sau ñoù, ôû caùc chu kyø tieâp theo hieôu quạ khueâch ñái giạm haún vì nhieău nguyeđn nhađn nhö söï phađn hụy vaø cán kieôt caùc thaønh phaăn cụa phạn öùng; söï xuaât hieôn nhöõng sạn phaơm phú öùc cheâ phạn öùng khueâch ñái, caùc bạn sao vöøa ñöôïc toơng hôïp khođng baĩt caịp vôùi moăi maø chuùng töï baĩt caịp vôùi nhau Ngoaøi ra, soâ chu kyø cho moôt phạn öùng coøn phú thuoôc vaøo soâ löôïng bạn maêu ban ñaău

4.3 Öu nhöôïc ñieơm cụa phöông phaùp PCR ñeơ phaùt hieôn vi sinh vaôt trong thöïc phaơm [10,18]

Phương pháp PCR giúp phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm một cách nhanh chóng và tin cậy Ưu điểm của phương pháp này là thời gian cho kết quả nhanh, ít tốn kém về mặt nhân sự, có thể nhận diện được những sinh vật khó nuôi cấy, việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết Ngoài ra, hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học và không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như:

- Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần phức tạp của mẫu thực phẩm Mặc dù vậy việc tách chiết và tinh chế DNA từ thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế

- Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR

- Phương pháp PCR không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết Do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc

Một giải pháp chung đối với các nhược điểm trên là kết hợp một bước tăng sinh ngắn và một bước ly tâm loại bỏ thành phần môi trường nuôi cấy và rửa tế bào trước khi tiến hành phản ứng PCR

4.4 Các nghiên cứu ứng dụng PCR trong phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm [10] Hiện nay, có nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những loài khó nuôi cấy Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bằng phương pháp PCR cần phải qua bước nuôi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR Sau khi nuôi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào từ dịch tăng sinh để tách chiết DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu ứng dụng

kĩ thuật PCR trong việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM đã thiết lập

được một số bộ kit phát hiện một số loài gây bệnh khác trong thực phẩm như Samonella,

- Xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation): bước này do phòng thí nghiệm đề xuất phương pháp mới tiến hành nhằm đưa ra các thông số kĩ thuật của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp này có tính năng tương đương hay có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tiêu chuẩn

- Xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation): bước này nhằm thẩm tra các thông số

kĩ thuật trong bước xác nhận hiệu lực sơ cấp đồng thời xác nhận độ lặp lại (repeatability), độ tái lập (reproducibility), độ lệch chuẩn (standard deviation) của phương pháp thay thế Bước này được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau dưới sự chủ trì của một cơ quan có chức năng Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ được trình lên hội đồng quốc gia hay các tổ chức quốc tế có thẩm quyền ban hành phương pháp để xem xét, đánh giá và ban hành phương pháp trở thành một phương pháp chính thức

5.2 Các thông số kĩ thuật trong xác nhận hiệu lực phương pháp

Độ chính xác (accuracy): là thông số đánh giá khả năng cho kết quả chính xác của phương pháp thay thế so với phương pháp tham chiếu Độ chính xác của phương pháp thay thế biểu thị bằng tỉ lệ cho kết quả dương hay âm tính trên các mẫu có kết quả dương tính hay âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

- Độ đúng (precision): là mức độ thống nhất giữa những kết quả kiểm tra độc lập của những lần phân tích khác nhau từ một mẫu chung Độ chính xác bao gồm độ lặp lại và độ tái lặp

- Độ lặp lại (repeability): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ những lần khảo sát độc lập trên một mẫu xác định ở trong cùng một điều kiện thực hiện về qui trình, thiết bị, người thực hiện, tại cùng một thời điểm

- Độ tái lặp (reproducibility): là mức độ thống nhất giữa các kết quả từ nhiều lần phân tích khác nhau trên một mẫu xác định bằng phương pháp phân tích nhưng được thực hiện tại các phòng thí nghiệm khác nhau, thời gian, điều kiện thực hiện và người phân tích khác nhau

- Độ ổn định (robustness): là khả năng duy trì tính ổn định của kết quả phân tích khi các điều kiện thực hiện có sự thay đổi nhỏ Độ ổn định cho biết giới hạn thay đổi cho phép của các thành phần tham gia vào qui trình phân tích và cung cấp thông tin về độ tin cậy của phương pháp trong quá trình sử dụng

- Độ nhạy (sensitivity): là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có trong mẫu của phương pháp thay thế Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

- Độ đặc hiệu (specificity): là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu phân tích không chứa vi sinh vật mục tiêu (được kiểm chứng bằng phương pháp tham chiếu) Chỉ số này là tỉ lệ giữa số kết quả phát hiện dương tính so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

- Âm tính giảû (false negative): là kết quả âm tính khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa

vi sinh vật mục tiêu

- Dương tính giả (false positive): quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa

vi sinh vật mục tiêu

- Giới hạn phát hiện: là mật độ tế bào vi sinh vật thấp nhất mà một phương pháp phân tích có thể phát hiện được Tại giới hạn phát hiện, số lần phân tích cho kết quả dương tính phải trên 50%

Việc xác nhận hiệu lực phải chứng minh được rằng phương pháp thay thế có giới hạn phát hiện bằng hoặc thấp hơn giới hạn phát hiện cuả phương pháp tham chiếu Theo tiêu chuẩn AOAC, giới hạn phát hiện cuả phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ khác nhau Thấp nhất là 1 –5 tế bào/25g mẫu thực phẩm, cao nhất là 10 – 50 tế bào/25g mẫu thực

Các thông số kĩ thuật nêu trên cho phép ta đánh giá tính khả thi của phương pháp thay thế, đồng thời cũng cho biết độ tin cậy của kết quả khi phân tích bằng phương pháp này Các thông số kĩ thuật của phương pháp thay thế khi được công bố, sẽ cho phép các phòng thí nghiệm lựa chọn phương pháp phù hợp với yêu cầu và năng lực của mình

5.3 Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế

Một phương pháp mới phải được đánh giá so sánh với những phương pháp truyền thống đã được xem là đáng tin cậy, được sử dụng từ trước tới nay Việc đánh giá này giúp cho chúng ta nhận định một cách tương đối phương pháp nào là tối ưu hơn về các mặt như thời gian, tiền bạc Từ đó tùy vào điều kiện yêu cầu cụ thể phòng thí nghiệm và người phân tích sẽ lựa chọn phương pháp mang tính hiệu quả nhất đáp ứng cho công việc của mình Do đó việc xác nhận hiệu lực phải được thực hiện một cách khách quan và phải được kiểm định lại bởi các cơ quan tổ chức có thẩm quyền Xác nhận hiệu lực phương pháp thay thế giúp bổ sung những thiếu sót hạn chế của phương pháp để trở thành một phương pháp đáng tin cậy và được sử dụng rộng rãi

Trong bối cảnh vấn đề về an toàn vệ sinh thực phẩm đang rất được quan tâm như hiện nay, việc lựa chọn phương pháp phân tích nào để đánh giá chất lượng của các loại thực phẩm là vấn đề rất quan trọng Việc xác nhận hiệu lực để hoàn thiện phương pháp, giúp phương pháp thay thế được chấp nhận rộng rãi tạo sự thống nhất, sự hòa hợp mang tính quốc tế trong việc phân tích các chỉ tiêu vi sinh sẽ góp phần mang lại sự tiện lợi trong quá trình mua bán trao đổi các mặt hàng thực phẩm

PHẦN II

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 VẬT LIỆU

1.1 Thiết bị và dụng cụ

Các dụng cụ và thiết bị chính được sử dụng bao gồm:

- Máy dập mẫu STOMACHER 400 CIRCULATOR

- Máy ly tâm (Hettich Centrifuge)

- Máy luân nhiệt Mastercycler do hãng Eppendorf sản xuất

- Bộ điện di ngang Horizon 58 (Life technoogy)

- Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (Model No UVTM – 19 – 30V)

- Bể điều nhiệt

- Tủ ấm

- Tủ sấy

- Nồi hấp

- Máy chụp hình gel IMAGE MASTERS VDS (Amersham Pharmacia Biotech APB)

1.2 Hoá chất và môi trường:

- Hóa chất dùng cho PCR

+ Taq DNA polymerase do Amersham Pharmacia Biotech (APB) cung cấp có nồng độ 5U/ml Enzyme này được bảo quản trong dung dịch gồm 500mM Tris HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5mM DTT và 50% glycerol, được bảo quản ở - 20C

+ Đệm PCR 10X: được cung cấp kèm với Taq DNA polymerase Thành phần dung dịch đệm này gồm 500mM KCl, 15mM MgCl2,100mM Tris HCl pH 9,0, được bảo quản ở nhiệt độ phòng

+ dNTP được cung cấp bởi APB; mỗi dNTP có nồng độ 100mM trong nước, pH 7,5

+ Mồi: trình tự đích được chọn đối với E coli là một phần của gen uidA qui định sự tổng hợp enzym ß-D-glucuronidase hiện diện ở tất cả các chủng của loài E coli Cặp mồi EC tự thiết

kế để tạo sản phẩm khuếch đại dài 299bp

+ Thang DNA: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng thang DNA chuẩn 100bp do Promega cung cấp ; kích thước các vạch của thang chuẩn như Hình 4

Hình 4 Thang DNA chuẩn 100bp

- Hoá chất dùng cho điện di và quan sát kết quả

+ Gel agarose (Sigma): gel nồng độ 1,5% agarose được pha trong đệm TAE

+ Dung dịch nhuộm DNA trên gel: ethidium bromide 5mg/ml

+ Đệm TAE 1X chứa 4,48g Tris, 2ml Na2 EDTA 0,5M pH 8,0, 1,14ml glacial acetic acid và nước vừa đủ 1000ml

+ Dung dịch TE chứa10 mM Tris – HCl pH 8,0

+ Dung dịch nạp mẫu (Loading dye buffer) có thành phần 30% glycerol, 0,15%

bromophenol blue, 200mM Tris, 20mM EDTA

- Thuốc thử sinh hóa

+ Thuốc thử Kovac ,s: 5g p–ethylamino benzaldehyde trong 75ml amyl hoặc isoamyl alcohol chứa 25ml HCl đậm đặc

+ Thuốc thử Methyl red: hòa tan 0,1g đỏ methyl vào 300ml ethanol 95% Thêm nước cất vào cho đủ 500ml

+ Thuốc thử Voges Proskauer: 5% -napthol trong cồn tuyệt đối và dung dịch KOH 40%

- Dung dịch Saline pepton Water (SPW): dùng để đồng nhất mẫu thực phẩm có thành phần gồm 1g pepton; 5g NaCl, nước cất vừa đủ 1lít Hấp 121C trong 15 phút

- Môi trường Tryptic Soya Agar (TSA) dùng để phục hồi và giữ giống vi sinh vật thành phần gồm 1,5g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 15g agar nước cất vừa đủ 1 lít Đun để hoà tan môi trường, phân phối 5ml vào các ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút, pH cuối 7,3 ± 0,2

- Môi trường Tryptic Soya Broth (TSB): dùng để hoạt hóa giống vi sinh vật Thành phần môi trường gồm 17g Trypticase pepton, 3g Phytone pepton, 20g NaCl, 2,5g KH2PO4, 2,5g glucose, nước cất vừa đủ 1 lít Đun nóng, lắc nhẹ để hòa tan, phân phối vào erlen hoặc ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút, pH cuối cùng 7,3 ± 0,2

- Môi trường Plate Count Agar (PCA): dùng để kiểm tra mật độ vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Thành phần môi trường gồm 17g casein, 3g solbean meal, 5g NaCl, 2,5g

K2HPO4, 2,5g glucose, nước cất vừa đủ 1 lít, pH cuối cùng 7,3 ± 0,3

- Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL): dùng để tăng sinh chọn

lọc E coli Thành phần môi trường gồm 10g pepton, lactose10g, 20g mật bò, 0,0133g brilliant

green nước cất vừa đủ 1 lít Hòa tan pepton và lactose vào 500ml nước cất, mật bò vào trong khoảng 200ml và brilliant green trong khoảng 100ml nước cất Trộn đều 3 dung dịch đạt thể tích cuối cùng là 1 lít, chỉnh pH môi trường khoảng 7,4 và phân phối 10ml vào mỗi ống nghiệm có chứa ống Durham Hấp 110C trong 15 phút, pH 7,2 ± 0,2 ở 25C

- Môi trường EMB: dùng để phân lập E coli có thành phần gồm 10g peptone, 2g

K2HPO4, 5g lactose, 5g saccharose, 0,4g đỏ Eosin, 0,07g xanh methylen, 13,5g agar

- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

+ Simon citrate: dùng để thử nghiệm khả năng sử dụng citrate của vi sinh vật có thành phần gồm 2g sodium citrate, 5g NaCl,1g KH2PO4,1g NH4H2PO4, 0,2g MgSO4, 0,08g xanh Bromthymol, 15g agar, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 6,8 ± 0,2

+ Trypton water (nước trypton): dùng để thử nghiệm khả năng sinh Indol có thành phần gồm 20g tryptone hoặc trypticase, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7,3 ± 0,2 Phân phối 4ml môi trường vào các ống nghiệm, hấp 121C trong 15 phút

+ Môi trường thử nghiệm MR – VP có thành phần gồm 7g buffered pepton powder, 5g glucose, 5g KH2PO4 nước cất vừa đủ 1 lít, pH cuối cùng 6,9 ± 0,2 Hoà tan môi trường trong nước nóng, phân phối 10 ml vào ống nghiệm hấp 121C trong 15 phút

1.3 Vật liệu thí nghiệm

- Mẫu thực phẩm: mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các chợ (Tân Phú, Thủ Đức, Bào Sen,ï Nancy, Trạm 2 Cầu Vượt và siêu thị ( Đầm Sen , Miền Đông) trong tháng 8 năm 2004 thuộc khu vực thành phố Hồ Chí Minh

- Chủng vi sinh vật: các chủng vi sinh vật dùng trong luận văn được nhận từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP

HCM, bao gồm: Salmonella typhimurinum, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Vibrio

parahaemolyticus, Bacillus cereus, Staphylococus aureus, Shigella sonnei, Clostridium botulinum

,Clostridium perfringgens và các chủng E coli có nguồn gốc từ Đại học RMIT (Úc) và Viện

Pasteur TP HCM

2 PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thu và chuẩn bị mẫu

Mẫu thực phẩm được chọn đại diện cho các loại thực phẩm theo hướng dẫn của qui trình đánh giá NordVal (Đan Mạch) Mẫu được thu mua từ các chợ, siêu thị và được bảo quản tạm thời trong các bao nilon vô trùng ở điều kiện lạnh và được đông lạnh ở - 20C tại phòng thí nghiệm Trước khi xử lý mẫu, rửa sạch tay bằng xà phòng, nước sạch và sát trùng bằng cồn 70 Thực hiện việc xử lý mẫu bên trong tủ cấy vô trùng Dùng cồn 70 sát trùng kéo, nhíp và miệng bao nylon Ghi chú chi tiết như tên mẫu, ngày lấy mẫu, ký hiệu mẫu trên bao nilon Dùng kéo, nhíp thu chính xác 10g mẫu một cách ngẫu nhiên ở nhiều điểm khác nhau trên khối mẫu vào bao dập mẫu, đồng nhất và tiến hành phân tích

2.2 Đồng nhất mẫu

Thêm 90g môi trừơng Saline Pepton Water (SPW) vào bao dập mẫu chứa 10g mẫu Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu ở tốc độ 230 vòng/phút trong 30 giây

2.3 Phương pháp pha loãng bậc 10

Dịch tế bào sau khi tăng sinh được pha loãng bậc 10 liên tiếp trước khi tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Chuẩn bị các eppendorf chứa 0,9ml nước muối sinh lý 0,85% vô trùng Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển 0,1ml dịch tế bào vi khuẩn vào eppendorf Vortex để được dung dịch có độ pha loãng là 10–1 Hút 0,1ml dung dịch có độ

pha loãng 10 –1 cho vào ống nghiệm khác và thực hiện như trên để có độ pha loãng 10–2 Lặp lại việc pha loãng một cách tương tự để có các dịch pha loãng 10 –3 đến 10–9

2.4 Định lượng E coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Dùng pipetman và đầu tip vô trùng chuyển vô trùng 0,1ml mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào giữa đĩa petri vô trùng; sử dụng mỗi đầu tip riêng cho một độ pha loãng và mỗi độ pha loãng thực hiện từ 2 – 4 đĩa Đỗ 15 - 20ml môi trường thạch PCA (đem đun chảy và để nguội

45oC) một cách vô trùng vào đĩa petri Xoay tròn hộp petri khoảng 5 lần xuôi và ngược chiều kim đồng hồ Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên Khi môi trường đã đông, lật úp đĩa và đặt vào tủ ấm ở 37 ± 1C trong 24 giờ Đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Chọn nồng độ pha loãng có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/petri

- Tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu như sau:

C = N/ n1x v1x f1+ + ni x vi x fi (CFU/ml) Trong đó, C: số lượng vi sinh vật trong 1ml mẫu (CFU/ml)

N: tất cả các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa

ni: số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng i

V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng

2.5 Phân lập chủng E coli từ mẫu thực phẩm

- Tăng sinh: cân chính xác 10g mẫu vào một bao PE, bổ sung 90g môi trường BGLB Đem đồng nhất mẫu và hút 1ml cho vào ống trường Durham, ủ ở 44C ± 0,5C trong 24 giờ

- Phân lập: sau khi tăng sinh 24 giờ dùng khuyên cấy ria dịch mẫu từ ống có phản ứng dương tính (có bọt khí trong ống Durham) lên môi trường EMB Ủ ở 37C trong 24 giờ Quan sát

đặc điểm hình thái đặc trưng của khuẩn lạc E Coli (màu đỏ tía, có ánh kim, bờ đều, đường kính 0,5mm)

- Khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá: các khuẩn lạc nghi ngờ là E coli trên môi

trường EMB được cấy sang ống nghiệm chứa môi trường TSA thạch nghiêng Ống nghiệm được

ủ ở 37C ± 0,5C trong 24 giờ Cấy các khuẩn lạc vào các ống môi trường thử nghiệm sinh hoá sau đây: 1 ống canh trypton; 2 ống MR-VP; 1 ống Simon citrate để thực hiện thử nghiệm IMViC (indol, methyl red, VP và citrate)

+ Thử nghiệm Indol: nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac,s vào canh khuẩn trong môi trường canh trypton Phản ứng indol là dương tính khi có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt, phản ứng là âm tính khi không có vòng đỏ trên

+ Thử nghiệm Methyl Red: nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn trong môi trường MR–VP, lắc đều Phản ứng MR là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng là âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu

+ Thử nghiệm Voges Proskauer: cho 0,2ml thuốc thử –napthol 5% vào canh khuẩn MR–VP, lắc mạnh; bổ sung thêm 0,2 – 0,3 ml KOH 40%, lắc mạnh,

quan sát 10 – 30 phút Phản ứng VP là dương tính khi canh khuẩn chuyển sang màu đỏ, phản ứng là âm tính khi canh khuẩn không chuyển màu

- Thử nghiệm Simon citrate: trong môi trường Simon citrate, phản ứng là dương tính khi môi trường có xuất hiện sinh khối vi khuẩn và màu môi trường chuyển sang xanh da trời, phản ứng là âm tính khi môi trường không có sinh khối và không chuyển màu

Qui trình phân lập, định danh E coli bằng phương pháp nuôi cấy và thử nghiệm sinh hóa

được tóm tắt trên Hình 5

Lấy 1g (1ml) mẫu vào 10ml môi trường BGBL

Ủ ở 44C  0,5C trong 24 – 48 giờ

Chọn các ống có sinh hơi cấy sang EMB agar Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính E coli

Ủ ở 37  0,5C trong 24 giờ

Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA

Ủ ở 37C  0,5C qua đêm

Thử nghiệm IMViC

E coli có biểu hiện sinh hoá: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrat (-) Một trong số các phản ứng

trên sai là không phải E coli

Kết luận: có hay không có E coli/g thực phẩm Hình 5 Quy trình phân lập, định danh E coli bằng phương pháp nuôi cấy và thử

nghiệm sinh hoá

2.6 Thu và xử lý khuôn DNA cho phản ứng PCR

Hút 1ml dịch tăng sinh cho vào eppdorrf sạch Ly tâm 800 vòng/phút trong 5 phút Chuyển phần dịch bên trên sang một eppendorf khác Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu nhận sinh khối Rửa sinh khối tế bào trong 1ml nước cất vô trùng Thu nhận sinh khối sau khi rửa bằng cách ly tâm 10000 vòng/ phút trong 5 phút Huyền phù hoá sinh khối trong 0,2ml TE Đun sôi cách thủy dịch huyền phù tế bào trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút Dịch nổi phía trên được sử dụng làm khuôn DNA cho phản ứng PCR

2.7 Điều kiện của phản ứng PCR phát hiện E coli

Phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 25l với các thành phần như sau: