THÍ NGHIỆM HÓA SINH THỰC PHẨM

Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến dextrin. Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa. #HOÁINHTHUCPHAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

M c L c ục Lục ục Lục ĐIỂM Nhóm 4 1 Hoàng Ngọc Thương 2 Hà Thị Trinh 3 Trần Lê Tri

4 Đỗ Duy Tùng 5 Nguyễn Thị Yến 6 Trương Thị Thu

16116179 16116187 16116186 16116191 16116200 16116176

Bài thí nghiệm số 1 3

Bài thí nghiệm số 2 13

Bài thí nghiệm số 3 17

Bài thí nghiệm số 4 22

Tài liệu tham khảo Danh mục hình Hình 1: Kết quả khảo sát ở 37oC trong 30 phút Error! Bookmark not defined Hình 2: Kết quả khảo sát ở 37oC trong 30 phút Error! Bookmark not defined Hình 3: Kết quả sau khi chuẩn độ Error! Bookmark not defined. Hình 4: Dung dịch sau khi chuẩn độ 15

Hình 5: Màu của 2 dung dịch trước và sau chuẩn độ 15

Hình 6: Kết quả chuẩn độ I2 dư bằng Na2S2O3 trong thí nghiệm xác địn hoạt độ enzyme invertase 19

Hình 7: Kết quả chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0.05N 24

Danh mục bảng

Bảng 1: Kết quả thu được ở 370c Error! Bookmark not defined.

Bảng 2: Kết quả thu được ở 470c Error! Bookmark not defined Bảng 3: Kết quả thu được sau khi chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0.1N Error! Bookmark not defined.

Bảng 4: Chuẩn bị các ống nghiệm như sau Error! Bookmark not defined.

Bảng 5: Kết quả dùng Na2S2O3 dùng để chuẩn độ I2 dư trong thí nghiệm xác định hoạt độ

của dung dịch invertase Error! Bookmark not defined Bảng 6: Chuẩn bị các ống nghiệm như sau Error! Bookmark not defined Bảng 7: Thành phần cho vào mỗi ống nghiệm Error! Bookmark not defined.

Bảng 8: Kết quả lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch ở thí nghiệm khảo sát

động học(ml) Error! Bookmark not defined.

Bảng 9: Kết quả xác định vận tốc thủy phân urease đậu nành Error! Bookmark not defined.

Bảng 10: Từ kết quả số liệu thu được nhận thấy cách thông số động học của đậu nành

như sau Error! Bookmark not defined.

Bảng 11: Kết quả lượng NaOH cần dùng để chuẩn độ dung dịch ở thí nghiệm khảo sáthoạt độ enzym

Error! Bookmark not defined.

Bài thí nghiệm số 1

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME AMYLASE THEO

PHƯƠNG PHÁP WOLHGEMUTH 1.Tóm tắt thí nghiệm

1.1 Nguuyên tắc

Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đếndextrin Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 1 mg tinhbột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa

Ngâm 15 phút, lắc đều

Dịch chiết enzyme amylase

Lọc 2 lần bằng giấy

lọc

1.3.2 Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase

1.3.2 Giải thích mục đích các bước thực hiện

• Chuẩn bị môi trường hoạt hoá: Ion Cl- là chất hoạt hoá của enzyme amylase.Khi hoà tan NaCl vào nước sẽ phân li ra ion Cl- Cl- làm thay đổi trung tâm hoạtđộng cho phù hợp với cơ chất gắn vào dễ dàng hơn

• Pha loãng dịch chiết enzyme: Tìm nồng độ pha loãng enzyme mà tại đó enzyme

không thuỷ phân được hoàn toàn tinh bột

• Bất hoạt enzyme, iodine chỉ thị màu: Thay đổi pH của môi trường làm cho

enzyme Amylase bị biến tính bất thuận nghịch Giúp quá trình quan sát kết quả

Chuẩn bị môi trường chứa chất hoạt hoá Cho mào mỗi ống nghiệm 1ml NaCl-đã pha

Cl-Pha loãng dung dịch enzyme Amylase Cho vào ống nghiệm số 1 1ml, lắc đều Chuyển 1ml dung dịch ống nghiệm 1 sang

ống nghiệm 2, lắc đều tương tự tới ống nghiệm số 10 bỏ đi 1 ml.

Cho cơ chất tác dụng với enzyme

Ở mỗi ống nghiệm từ 110 cho 1ml tinh bột đem ủ ở 37oC trong 30 phút

Bất hoạt enzyme, cho Iodine làm chỉ thị màu

Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml H 2 SO 4 10%, hai giọt Iodine trong KI, lắc đều

Kết quả Quan sát, ghi nhận kết quả, tiến hành tính toán

chính xác hơn Iodine được thêm vào để xác nhận trong dung dịch có còn tinh bộthay không.

m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (10000mg)

2.1 Khảo sát hoạt độ enzyme ở 37 oC trong 30 phút.

Hình 1: Kết quả khảo sát ở 37oC trong 30 phút

Bảng 1: Kết quả thu được ở 370c

1004

1008

10016

10032

10064

100128

100256

100512

1001024

F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm số 4 có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

♦ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):

V 1×W=

100

1 ×3,2=31,25

♦Nhận xét kết quả thu được:

- Ở ống nghiệm số 1,2,3,4 thì xuất hiện màu vàng là do tinh bột đã bị enzymeamylase thuỷ phân, nên khi ta thêm dung dịch Iodine vào thì chỉ thấy màu vàng củadung dịch Iodine trong KI

- Ống nghiệm số 5,6,7,8,9,10 xuất hiện màu xanh đen do trong dung dịch còntinh bột, bao lấy Iodine tạo phức xanh đen Điều đó chứng tỏ khi pha loãng tới nồng độn/32 thì enzyme đã không còn thuỷ phân hoàn toàn được tinh bột

- Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) thì ta thấy màu sắc củaống kiểm chứng trùng với màu của ống nghiệm số 4

2.2 Khảo sát hoạt độ enzyme Amylase ở 47 o C trong 30 phút

Bảng 2: Kết quả thu được ở 470c

1008

10016

10032

10064

100128

100256

100512

1001024

♦ Một đơn vị Wohlgemuth

Hình 2: Kết quả khảo sát ở 47Hình 2: Kết quả khảo sát ở 47oC trong 30 phútoC trong 30 phút

F- Độ pha loãng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hoàn toàn tinhbột (ống nghiệm số 4 có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)

♦ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW):

Ống nghiệm số 5 có màu nâu đỏ là vì lượng tinh bột còn lại ít Do vậy enzyme đãthuỷ phân tinh bột và còn lại một phân chưa thuỷ phân

Ống nghiệm số 6,7,8,9,10 xuất hiện màu xanh đen do trong dung dịch còn tinhbột, bao lấy Iodine nên tạo phức xanh đen Điều đó chứng tỏ khi pha loãng tới nồng độn/32 thì enzyme đã không còn thuỷ phân hoàn toàn được tinh bột

Khi so sánh với ống nghiệm thứ 11( ống kiểm chứng) thì ta thấy màu sắc của ốngkiểm chứng trùng với màu của ống nghiệm số 4

3 Bàn luận và câu hỏi mở rộng

3.1 Bàn luận về kết quả

Theo kết quả thực hiện hai thí nghiệm thì ta nhận thấy rằng khi ở nhiệt độ 47oCthì enzyme Amylase hoạt động mạnh hơn ở 37oC điều này có thể giải thích bởi cácnguyên nhân sau:

- Khi nằm trong khoảng nhiệt độ tối ưu của enzyme Amylase thì hoạt độ củaenzyme tăng theo nhiệt độ, tới một giới hạn thì enzyme Amylase không tăng được nữa

và nếu cứ tăng nhiệt độ enzyme sẽ bị biến tính và không phục hồi được( biến tính bấtthuận nghịch).

- Nguyên nhân thứ 2 có thể do khi ta dùng acid H2SO4 để thay đổi pH nhằm bấthoạt enzyme, có thể acid cũng làm tinh bột thuỷ phân khi có xúc tác nhiệt độ Do vậykết quả thu được ở thí nghiệm sau không đáng tin cậy

3.1.1 Các nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả

- Quá trình pha hoá chất ( cân, đong, tính lượng chất tan) làm kết quả không chínhxác, có thể mắc sai số

- Do thao tác thực hiện sai sót dẫn đến kết qảu mắc sai số

- Do thiết bị phòng thí nghiệm có thể quá cũ dẫn đến sai số ví dụ như không đảmbảo đủ nhiệt độ 37oC hay 47oC trong thời gian 30 phút Gây nên sai số

2 Nêu tất cả sản phẩm thủy phân thu được khi thủy phân tinh bột bằng enzyme các loại amylase sau:

Beta Amylase thủy phân tinh bột tạo maltose và β-dextrin

Gamma Amylase thủy phân tinh bột tạo glucose

3 Nêu những loại enzyme có trong malt, cơ chất và hàm lượng của chúng.

Malt là các loại hạt ngũ cốc nảy mầm: malt đại mạch, malt thóc, malt ngô…Enzyme trong malt phần lớn là alpha-amylases, beta-amylases, proteases Ngoài ra cònmột số enzyme như beta-glucanases, hemicellulases và lipases

- Amylases: cơ chất là tinh bột, hàm lượng amylase trong malt là

- beta-glucanases: cơ chất cơ chất là beta-glucan

- Proteases: cơ chất là protein, hàm lượng amylase trong malt là

- Hemicellulases: cơ chất là Hemicellulose

- Lipase: cơ chất là lipide

4 Nêu các giai đoạn của quá trình dextrin hóa.

Tinh bột alpha-amylase dextrin phân tử lượng thấp

Bài thí nghiệm số 2

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ENZYME LIPASE

1 Tóm tắt thí nghiệm

1.1 Nguyên tắc

Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo Hàm lượngacid được chuẩn độ bằng kiềm Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hòaacid mới được hình thành Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng mộtđối tượng enzyme

-Toluen là dung môi để hòa tan cơ chất

-Ether ethylic là dung môi để phân tán chất chuẩn độ để chuẩn độ được hiệu quảhơn

-NaOH 0,1N là chất chuẩn độ để trung hòa acid

-Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 mlnước cất Là chất chỉ thị để nhận biết NaOH dư

-Dầu đậu nành tinh khiết là cơ chất cho enzyme thủy phân

1.3 Trình tự thí nghiệm

-Cân 5.0 g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ Chuyển vào erlen,thêm 10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30oC

-Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọttoluene, lắc đều hỗn hợp ở 30oC trong 24 giờ

-Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96o và 15ml ether, lắcđều và để yên 2 phút Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein1%

-Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải đượcđun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào

2 Kết quả và giải thích

-Sau khi đem bình dung dịch và bình kiểm chứng ra khỏi máy lắc Thêm 25mlcồn 96° và 15ml ether lắc đều để trong 2 phút quan sát : màu của 2 bình đều giống nhau

và có màu trắng đục Lúc này trong bình thí nghiệm acid béo tự do đã được sinh ra

Hình 3: kết quả sau khi chuẩn độ

phản ứng với acid để trung hòa dung dịch Sau đó NaOH dư tác dụng với chỉ thị làm

dung dịch chuyển sang màu hồng

Bảng 3: Kết quả thu được sau khi chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0.1N

Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm 17,1ml

Thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ bình kiểm chứng 8,4ml

 Bình kiểm chứng có lượng NaOH thấp hơn là do dịch chiết enzyme đãđược đun cách thủy nên bị bất hoạt do đó lượng acid béo được sinh ra từ quá trình thủyphân rất ít nên cần ít lượng kiềm để trung hòa, dung dịch dễ chuyển sang màu hồngnhanh hơn

-Hoạt độ của lipase (X) được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ

lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ:

Hình 4: Dung dịch sau khi chuẩn độ Hình 5: Màu của 2 dung dịch trước và sau

chuẩn độ

X ¿(a−b)×10 ×k

m

với a: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình thí nghiệm

b: số ml NaOH để chuẩn độ trong bình kiểm chứng

k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1N (k=1)

m: khối lượng hạt sử dụng

X =(17,1−8,4 )10 1

5 =17,4

Vậy hoạt độ của enzyme lipase là 17,4.

=>Ta thấy được hoạt độ enzyme lipase là khá cao, qua đó thấy được rằng khảnăng xúc tác(cường độ xúc tác) để phân giải chất béo của enzyme lipase cũng cao, caohơn nhiều loại enzyme khác

- Kết quả của thí nghiệm cũng dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố như:

+ Qúa trình nghiền đậu nành không được mịn

+Dầu đậu nành làm cơ chất không tinh khiết do mua ở ngoài cũng ảnhhưởng đến việc xúc tác của enzyme

+Do hệ thống cân có thể bị sai lệch trong quá trình cân làm thí nghiệm chưachính xác dẫn đến nồng độ pha có thể bị xê dịch

+Do thao tác của người tiến hành thí nghiệm chưa chuẩn xác, gây sai số

+Do chuẩn bị chưa kĩ càng nên chỉ để dịch chiết có enzyme thủy phân cơchất trong vòng khoảng 7 tiếng, gây ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm

+Hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH chỉ lấy tương đối chưa hoàn toàn chínhxác

 H2SO4 1N: hòa tan 2.27 ml H2SO4 96% cho đủ 100ml bằng nước cất;

 Hồ tinh bột 1%: hòa tan 1g tinh bột với 100ml nước cất Đun cách thủy trong 15phút

 Dung dịch Na2S2O3 0.05N: cân 12.5g Na2S2O3.5H2O cho đủ trong nước cất cho đủ1000ml

1.3 Trình tự thí nghiệm

a Điều chế dung dịch invertase: Cân 1g men bánh mì, hòa tan với 50ml nước cất,cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút Để lắng, lọc lấydịch lọc

b Chuẩn bị 3 ống nghiệm:

Bảng 4: Chuẩn bị các ống nghiệm như sau.

Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phòng trong chính xác 30 phút sau đó đem đicách thủy 10 phút Sau đó Ở từng ống nghiệm, hút ra 1ml hỗn hợp dung dịch cho vàomột bình tam giác 100ml để xác định hàm lượng glucose

Xác định glucose: cho vào mỗi bình tam giác 2 ml dung dịch iodine 0,1N và nhỏchậm 3 ml NaOH 0,1N sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút Để yên trong bóngtối 20 phút Lấy ra cho thêm 1ml H2SO4 1N Định phân lượng iodine thêm thừa bằng

Na2S2O3 0.05N có hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị

Lặp lại các bước thí nghiệm 3 lần

2 Kết quả thí nghiệm và giải thích

Bảng 5: Kết quả dùng Na2S2O3 dùng để chuẩn độ I2 dư trong thí nghiệm xác định hoạt độ của dung dịch invertase

Số ml dung dịch

V1: số ml dung dịch dùng để định phân trong ống nghiệm 1

V2: là số ml dung dịch dùng để định phân trong ống nghiệm 2

A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm

B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m(g) men bánh mì (ml)

a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)

b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml)

t: thời gian thủy phân (phút)

Như vậy, hoạt độ của enzyme invertase được xác định trong thí nghiệm này là

a = (7−3.5+ 3.8+3.65

3 )  4  100/(1000  20  2 1  2  30  1) =5.58  10 -4

Vậy hoạt độ của enzyme invertase là 5.58  10-4 mol saccarose bị thủy phân bởi

100ml enzyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phòng

Giải thích kết quả

Thí nghiệm được thực hiện dựa trên những phản ứng hóa học sau:

Saccharose -glucose + - fructose

Trong môi trường kiềm, Iodine tác dụng với NaOH tạo thành NaOI và NaI NaOI

sẽ tác dụng với glucose (tạo thành do quá trình thủy phân bằng invertase) tạo thành acidgluconic và NaI

I2 + NaOH = NaOI + NaI + H2O

NaOI + CH2OH-(CHOH)4-CHO = NaI + CH2OH-(CHOH)4-COOH

(Glucose) (Acid gluconic)

Sau đó, cho dung dịch H2SO4 vào ta thu hồi được lượng I2 dư sau khi đã xảy raquá trình oxi hóa glucose

2NaOI + 2NaI + 2H2SO4 = I2 + 2Na2SO4 +2H2O

Lúc này, hỗn hợp dung dịch trong bình tam giác có màu vàng của I2 dư Sau khicho hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị, dung dịch trong bình tam giác có màu xanh đen củaphức iodine- hồ tinh bột

invertase

Dung dịch Na2S2O3 được dùng để chuẩn độ lượng I2 dư đến khi màu xanh đentrở thành không màu

2Na2S2O3 + I2 = Na2S4O6 +2 NaI

Trong ống nghiệm 1 chỉ chứa nước cất và dịch enzyme nên toàn bộ lượng Iodinecho vào sẽ được Na2S2O3 chuẩn độ Vì vậy, số ml Na2S2O3 dùng để chuẩn độ là nhiềunhất Tỉ lệ chuyển hóa của saccharose nhờ enzyme invertase tăng khi tăng nhiệt độ,nhưng để tránh biến tính, nhiệt độ được cố định từ 500c đến 550c (Monsan và cộng sự.1984) nên trong thí nghiệm này ta đun cách thủy 10 phút làm bất hoạt enzyme Vì vậy,trong ống nghiệm số 3 saccharose 10% hầu như không bị thủy phân bởi dịch enzymeđược đun cách thủy 10 phút nên glucose cũng không được tạo ra

Ở ống nghiệm số 2, enzyme invertase hoạt động giúp thủy phân saccharose tạothành glucose và fructose và xảy ra đầy đủ các phản ứng nên lượng Na2S2O3 dùng địnhphân là ít nhất

- Cân 10g đậu nành đã xay thành bột khuấy vào 150ml nước sau đó cho vào bìnhđịnh mức 250ml, định mức tới vạch bằng nước cất Lọc và thu dịch.

1.2 Khảo sát động học.

-Chuẩn bị 2 dãy óng nghiệm mỗi dãy 6 ống Cho dung dịch vào từng dãy như sau:

Bảng 6: Thành phần cho vào mỗi ống nghiệm

- Đặt dãy thứ nhấ vào bể ổn nhiệt 40°C, dãy thứ hai vào tủ ấm 30°C trong 20 phút

- Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 ml formol trung tính, lắc đều trong 2 phút

- Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước cất,thêm 2 giọt phenolphtalein 1%

- Cho dung dịch NaOH 0,05 N lên burret bắt đầu định phân tới khi dung dịch chuyểnsang màu hồng thì dừng lại và ghi nhận kết quả

1.3 Khảo sát hoạt độ enzyme.

Bảng 7: Thành phần cho vào mỗi ống nghiệm