Mục đích của nghiên cứu tìm ra quy luật chung về ảnh hưởng của hàmlượng muối bổ sung trong môi trường lên động học sinh trưởng của nấm men(Saccharomyces cerevisiae) trong quá trình nuôi cấy mẻ. Quá trình lên men đượcthực hiện trong phòng thí nghiệm với việc bổ sung hàm lượng muối 1%, 5%, 10%và 20% vào môi trường nuôi cấy. Dựa vào các thông số động học được tính toán,nhận thấy hàm lượng muối 1% bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng lớn nhất, hàm lượng 5% và 10% có tốc độ tăng trưởng thấp hơn nhưngnấm men vẫn còn phát triển và ở 20% thì nấm men bị ức chế không có sự phát triển
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
-BÁO CÁO THÍ NGHIỆM CÔNG NGHỆ LÊN MEN ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN ĐỘNG HỌC SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN
TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ
GVHD: TS Trịnh Khánh Sơn Lớp: Thứ 7, tiết 1-11 Nhóm thực hiện: Nhóm 3
Tp Hồ Chí Minh, tháng 10 năm 2019
Trang 2Họ và tên sinh viên thực hiện
1 Lê Thị Phương Hoa 16116132
2 Lương Thị Diễm My 16116150
3 Nguyễn Thành Nghĩa 16116155
4 Nguyễn Thị Mai Nương 16116164
5 Lê Hồng Phương 16116166
5 Trần Lê Tri 16116186
Giảng viên hướng dẫn: TS Trịnh Khánh Sơn Điểm:
Nhận xét của giảng viên:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN ĐỘNG HỌC SINH
TRƯỞNG CỦA NẤM MEN SACCHAROSEMYCES CEREVISIAE
TRONG QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MẺ L.T.P Hoa, L.T.D My, N.T Nghĩa, N.T.M Nương,
L.H Phương, T.L Tri
Khoa Công nghệ Hóa Học và Thực Phẩm Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật thành phố Hồ Chí Minh
Số 1, đường Võ Văn Ngân, quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh
TÓM TẮT
Mục đích của nghiên cứu tìm ra quy luật chung về ảnh hưởng của hàm lượng muối bổ sung trong môi trường lên động học sinh trưởng của nấm men
(Saccharomyces cerevisiae) trong quá trình nuôi cấy mẻ Quá trình lên men được
thực hiện trong phòng thí nghiệm với việc bổ sung hàm lượng muối 1%, 5%, 10%
và 20% vào môi trường nuôi cấy Dựa vào các thông số động học được tính toán, nhận thấy hàm lượng muối 1% bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tốc độ tăng
Trang 3trưởng lớn nhất, hàm lượng 5% và 10% có tốc độ tăng trưởng thấp hơn nhưng nấm men vẫn còn phát triển và ở 20% thì nấm men bị ức chế không có sự phát triển
GIỚI THIỆU
Saccharomyces cerevisiae là một loại nấm men đơn bào, có khả năng phân
chia nhanh Tế bào S cerevisiae có hình tròn hay hình trứng, đường kính từ 5 –
10 µm Thành tế bào S cerevisiae chủ yếu được cấu tạo bởi một lớp bên trong
gồm b-glucan và chitin, một lớp bên ngoài là những sợi được cấu tạo từ a-manan (highly glycosylated) liên kết với protein (mannoproteins) Nó sinh trưởng bằng cách nảy chồi và sinh bào tử mới Nguồn dinh dưỡng chủ yếu là cacbon từ đường, nguồn nito từ các acid amine
Nấm men S cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất bánh mì, lên men bia, rượu,… Và nhiều nghiên cứu cho thấy S cerevisiae là loài sinh vật thí nghiệm dễ sử dụng nhất hiện nay Thứ nhất, S cerevisiae rất dễ nuôi
cấy ở quy mô lớn, dễ dàng phát triển bằng cách sử dụng các kỹ thuật lên men đơn giản và môi trường phát triển rẻ tiền, đồng thời sinh khối cao (Kapoor and
Viraraghava 1995) Thứ hai, S serevisiae dễ dàng lấy được từ các ngành công nghiệp khác so với các loại khác Thứ ba, S cerevisiae an toàn Thứ tư, S.
cerevisiae có thể dễ dàng cho thao tác về mặt di truyền và hình thái Vì vậy, nhóm
nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng muối NaCl bổ sung
trong môi trường nuôi cấy lên động học sinh trưởng của nấm men Saccharomyces
serevisiae trong quá trình nuôi cấy mẻ
Natri clorua là một chất có ảnh hưởng nhiều đến Saccharomyces cerevisiae
Cụ thể là nó làm thay đổi tốc độ sinh trưởng , hiệu suất tạo ra sinh khối , ảnh hưởng đến lag phase trong đường cong sinh trưởng và thành phần của tế bào nấm men
Khi có mặt của NaCl thì tốc độ sinh trưởng của nấm men Saccharomyces
cerevisiae sẽ bị giảm đi Nguyên nhân có thể là do nó cần nguồn cơ chất và năng
lượng cao hơn và khi có mặt của muối thì nấm men sẽ thực hiện cơ chế để tự bảo
vệ nó NaCl có thể gây ra sự kìm hãm tăng trưởng và ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tồn tại của tế bào nấm men Ở nồng độ NaCl 10% w/v thì gây ngừng tăng trưởng ở nấm men Đồng thời nồng độ của NaCl tăng lên thì tổng số lượng tế bào sẽ giảm xuống Các tế bào nấm men tiếp xúc với nồng độ NaCl cao hơn thì thì
có mức tăng trưởng thấp nhất nhưng khả năng sống sót thường cao hơn nấm men trong điều kiện muối thấp hơn
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Vi sinh vật: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae dạng đông khô
(thuộc thương hiệu Mauripan loại 10g/gói) được sử dụng trong suốt quá trình nghiên cứu Cà chua được mua ở chợ Đường cát Biên Hòa gói 1kg
Hóa chất: Peptone và các hóa chất khác như NaOH, H2SO4, Methylen
blue, cồn, có sẳn tại phòng thí nghiệm
Thiết bị: Kính hiển vi điện tử, buồn đếm hồng cầu, máy lắc, máy khuấy từ,
mycropipet, máy ly tâm, bếp hồng ngoại,
Trang 4Môi trường nhân giống
Chuẩn bị 100g cà chua đã rửa sạch, thêm 1000ml nước cất Đun sôi 30 phút Thu nhận phần dịch chiếc trong Bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Sau đó
bổ sung vào hỗn hợp 200g đường saccharose và 1g peptone thu được môi trường M1d Môi trường M1d được điều chỉnh pH bằng dung dịch 0.1N H2SO4 hoặc 0,1N NaOH, được phân phối ở bình nuôi cấy và được tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút
Nấm men (0.1g) được hoạt hóa và nhân giống trong 100 ml môi trường M1d ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 rpm (hoặc trên thiết bị có khuấy từ)
Điều kiện nuôi cấy nấm men
Sau quá trình nhân giống, lấy 10ml nấm men cho vào 190ml môi trường M1d có bổ sung NaCl đã được tiệt trùng Quá trình nuôi cấy mẻ được tiến hành ở nhiệt độ phòng lắc 120 rpm trên thiết bị có khuấy từ Trong suốt quá trình nuôi cấy, bắt đầu từ giờ thứ 0, cứ mỗi 1 giờ các chỉ tiêu: (a) mật độ tế bào/ml, (b) tỉ lệ tế bào sống, (c) tỉ lệ tế bào nảy chồi, % sucrose bằng Brix kế sẽ được kiểm tra và ghi nhận và biểu diễn thành bảng và đồ thị Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men và rút ra kết luận
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men trong môi trường nuôi cấy mẻ
Xác định mật độ tế bào vi sinh vật, tỷ lệ tế bào sống, tỷ lệ tế bào nảy chồi bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Tiến hành nhuộm xanh bởi methylene blue để đếm được số lượng tế bào chết (các tế bào chết sẽ bắt màu với methylen blue), tổng số tế bào, số tế bào nảy chồi, và số tế bào sống
Cách tiến hành:
1 Pha loãng huyền phù nấm men
2 Trộn đều 1ml huyền phù (đã pha loãng) với 50 µl dung dịch 0.2% methylen blue (pha trong D.W) trong 30 giây Lắc đều dung dịch trên máy lắc
3 Đậy buồng đếm bằng 1 tấm phiến kính vuông
4 Nhẹ nhàng dùng đầu pipette đặt một giọt huyền phù nấm men và cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính vuông) Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa buồng đếm và phiến kinh vuông được trám đầy bởi huyền phù nấm men, còn các rãnh xung quanh thì không bị dính ướt
5 Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x4 để tìm buồng đếm
và vật kính x10 và x40 để quan sát Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa trập
để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ Ta chọn năm ô lớn theo đường chéo (các ô đánh dấu x) để đếm Sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp hình buồng đếm ở vật kính x10 (hoặc x40) để sau này sử dụng đếm số lượng tế bào nấm men trên máy tính
6 Kết quả đếm mật độ tế bào chỉ có giá trị trong vòng 3 – 5 phút sau khi cho mẫu vào buồng đếm; phải đếm cả các tế bào nằm trong ô vuông và trên hai
Trang 5đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô (thường chọn cạnh bên trái và trên của ô vuông)
7 Ở mỗi độ pha loãng, sau khi đếm ta được số tế bào trên năm ô lớn là a (mỗi độ pha loãng nên cùng lúc đặt ở cả 2 vị trí để có được hai lần quan sát với cùng một mẫu)
Số tế bào nấm men (N) trên 1.0 ml mẫu:
N = (a/b×400/0.1)×103×10n
Trong đó:
N: số tế bào trên 1.0 ml mẫu cho vào buồng đếm
a: số tế bào trên 5 ô vuông lớn
b: số ô vuông nhỏ trên 5 ô vuông lớn (16×5=80)
400: tổng số ô vuông nhỏ trong 25 ô vuông lớn
0.1: thể tích (mm2) mẫu chứa trên ô trung tâm
103: số chuyển mm2 thành ml (103 mm2 = 1 ml)
10n: độ pha loãng mẫu (lưu ý khi tính độ pha loãng phải bao gồm lượng methylene blue cho vào mẫu)
Đo % sucrose bằng brix kế
Lấy 1ml dung dịch huyền phù nấm men sau khi đã pha loãng cho vào ống ly tâm Đun cách thủy ở 1000C trong 10 phút Sau đó đem đi ly tâm 3000 vòng trong
10 phút Cho 1 giọt đã ly tâm vào bề mặt của brix kế và đọc số đo của brix kế Ghi nhận % sucrose tại thời điểm đó
Tính toán các thông số động học sinh trưởng của nấm men
n = t
t(d)
Nt = N (0)
2n = N0×2
t
t (d )
lnN (t )−ln N (0)
t =¿
0.693
t (d )
µ¿0.693
t (d ) (tính giữa hai thời điểm)
YN/S ¿N (t )−N (0)
S (t )−S (0)
Với:
n: số thế hệ
td: thời gian số tế bào nhân đôi (thời gian thế hệ)
Nt: số tế bào ở thời điểm t
N0: số tế bào ở thời điểm bắt đầu (giờ thứ 0)
µ: hằng số tốc độ sinh trưởng (ở đây được xem là tốc độ gia tăng số lượng
tế bào trên một đơn vị số lượng tế bào)
YN/S : hiệu suất tạo thành tế bào (tính theo cơ chất là đường)
St: nồng độ cơ chất (đường) ở thời điểm t
S0: nồng độ cơ chất (đường) ở thời điểm 0 giờ
Các số liệu đo đạc và các thông số động học sinh trưởng sẽ được biểu diễn bằng các bảng và đồ thị bao gồm: (1) bảng số liệu của quá trình lên men, (2) đồ
Trang 6thị diễn tả đường cong sinh trưởng của nấm men, (3) xác định thời gian thế hệ ở log phase, (4) hằng số tốc độ sinh trưởng (µ) ở log phase và (5) YN/S tại các giai đoạn của quá trình lên men
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN (i) Đường cong sinh trưởng của nấm men
Theo hình 1, ở nồng độ 1% NaCl, tốc độ sinh trưởng của nấm men là cao nhất trong bài nghiên cứu này Vì ở nồng độ này còn thấp nên không ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng của nấm men Tại nồng độ 5% NaCl và 10% NaCl, thời gian thích nghi (pha lag) khá dài khoảng 4 - 5 giờ Bởi vì nồng độ muối cao tác động đến màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men nên tốc độ sinh trưởng chậm Còn trường hợp 20% NaCl thì nấm men bị tiêu diệt hoàn toàn
Tốc độ sinh trưởng của nấm men bị ảnh hưởng trong môi trường nuôi cấy
có bổ sung NaCl, nghĩa là nồng độ muối càng cao tốc độ sinh trưởng càng giảm Đúng với nghiên cứu của Chin cho thấy rằng số lượng nấm men cao hơn trong môi trường có chứa 5% NaCl so với môi trường chứa 10% NaCl Nguyên nhân có
Hình 1: Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của Saccharomyces
cerevisiae trong môi trường nuôi cấy có bổ sung NaCl
Trang 7thể là do nó cần nguồn cơ chất và năng lượng cao hơn và khi có mặt của muối thì
nấm men sẽ thực hiện cơ chế để tự bảo vệ nó Theo J Bautista nấm men S.
cerevisiae sẽ bị tiêu diệt nếu nồng độ NaCl trên 12,2%, trong khoảng 8,5% - 12,2%
không có sự tăng trưởng và theo W Praphailong, nồng độ NaCl tối đa để nấm
men phát triển là 7.5%
Tại nồng độ NaCl 1% và 5% đường cong sinh trưởng kéo dài Đúng với
khảo sát của Ross và Morris, khi nồng độ muối tăng lên 8% thì tăng thời gian pha
lag và giảm thời gian pha log
(ii) Đồ thị pha log
Hình 2: Cơ chế tác động của NaCl đến tế bào nấm men
Hình 3: Đồ thị biểu diễn động học sinh trưởng pha log của S cerevisiae trong môi trường
nuôi cấy bổ sung NaCl
Trang 8Bảng 1: Thông số động học sinh trưởng của nấm men S cerevisiae trong
môi trường có bổ sung NaCl Thí nghiệm Chiều dài
pha Log (L)
Thời gian thế hệ (T d )
Tốc độ sinh trưởng thực tế (µ tt )
Tốc độ sinh trưởng theo đồ thị pha Log (µ L )
-Theo kết quả thực nghiệm ta thấy, ở nồng độ 1% và 5% NaCl thì thời gian pha log diễn ra là như nhau (7 giờ) nhưng thời gian bắt đầu pha log ở nồng độ 1% NaCl thì nhanh hơn và tốc độ sinh trưởng cao hơn Tại 10% NaCl, thời gian bắt đầu pha log chậm và chiều dài pha log ngắn hơn 5% NaCl Còn 20% NaCl, nấm men đã bị tiêu diệt nên không xuất hiện pha log Thời gian thế hệ tăng dần khi tăng nồng độ NaCl
(iii) Hàm lượng đường
Hình 4: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường còn lại trong môi trường nuôi cấy nấm
men S cerevisiae có bổ sung NaCl
Trang 9Bảng 2: Thông số hiệu xuất thu được sinh khối nấm men
Thí nghiệm Hiệu suất Y X/S
(tế bào.ml -1 S -1 )
1%-NaCl 15x105 5%-NaCl 9x105 10%-NaCl 4.6x105
-Theo kết quả thí nghiệm, mức độ sử dụng cơ chất của nấm men ở nồng độ 1% NaCl lớn nhất và hiệu suất thu sinh khối cao nhất (15x105 (tế bào.ml-1.S-1)) Còn ở trường hợp 10% NaCl thì mức độ sử dụng cơ chất chậm, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp (4.6x105(tế bào.ml-1.S-1)) Khi nồng độ muối tăng lên thì oxy hòa tan vào trong dung dịch sẽ giảm làm cho lượng oxy cần thiết cho những hoạt động sống của nấm men sẽ bị thiếu từ đó giảm năng suất của quá trình lên men
Sự hiện diện của NaCl trong môi trường nuôi cấy có thể gây ra áp suất thẩm
thấu Nấm men Saccharomyces có một số cơ chế khác nhau để chống lại áp suất
thẩm thấu, hầu như cần nguồn năng lượng carbon để thực hiện Nhu cầu bổ sung nguồn năng lượng carbon này có thể giải thích chính là hàm lượng glucose tiêu thụ tăng lên khi nồng độ muối thấp Đồng thời khi nồng độ muối cao hơn, hàm lượng glucose tiêu thụ đã được báo cáo là giảm
(iv) Phần trăm tế bào nấm men sống
Hình 5: Đồ thị biểu diễn phần trăm tế bào nấm mem S cerevisiae sống trong
môi trường nuôi cấy có bổ sung NaCl
Trang 10Nhìn chung, phần trăm tế bào sống của nấm men ở các nồng độ muối khác nhau đều cao trong pha log, ngoại trừ 20% NaCl và hầu như ở cùng thời điểm nghiên cứu phần trăm tế bào sống có xu hướng giảm xuống khi nồng đồ NaCl tăng lên Tại điều kiện môi trường 5% NaCl thời gian tế bào sống dài nhất tính từ thời điểm bắt đầu đến khi kết thúc pha log Với 1% NaCl phần trăm tế bào sống ở pha log có giá trị cao nhất Còn trường hợp 20% NaCl, nấm men bị tiêu diệt nên phần trăm tế bào sống giảm theo thời gian
(v) Phần trăm tế bào nấm men nảy chồi
Dựa vào đồ thị ta nhận thấy rằng, ở nồng độ 1% NaCl phần trăm tế bào nảy chồi cao, tại 5% và 10% NaCl phần trăm tế bào nảy chồi thấp Vậy khi tăng nồng
độ NaCl thì phần trăm tế bào nảy chồi giảm dần
KẾT LUẬN
Từ kết quả thực nghiệm trên thì chúng tôi nhận thấy rằng, ở môi trường nuôi cấy có sử dụng 1% NaCl thì hiệu suất thu sinh khối cao, quá trình sinh trưởng của nấm men diễn ra mạnh và nhanh Còn những môi trường có nồng độ 5% NaCl
Hình 6: Đồ thị biểu diễn phần trăm tế bào nấm mem S cerevisiae nảy chồi
trong môi trường nuôi cấy có bổ sung NaCl
Trang 11và 10% NaCl thì tốc độ sinh trưởng diễn ra chậm, hiệu suất sinh khối thấp Do đó trường hợp này thường dùng để làm chậm quá trình sinh khí CO2 trong quá trình sản xuất bánh mì Tóm lại khi nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy càng tăng
đến 10% thì sẽ ức chế sự sinh trưởng của nấm men Saccharosemyces
cerevisiae, giảm hiệu suất thu hồi sinh khối và CO2
Trang 12TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] H Feldmann, Yeast: Molecular and Cell Biology, John Wiley & Sons, 2011
[2] Soares, E V., "Flocculation in Saccharomyces cerevisiae: a review," Journal
of applied microbiology, pp 110(1), 1-18, 2011
[3] Wang, J and Chen, C , "Biosorption of heavy metals by Saccharomyces
cerevisiae: a review," Biotechnology advances, pp 24(5), 427-451, 2006
[4] Watson, T G., "Effects of sodium chloride on steady-state growth and
metabolism of Saccharomyces cerevisiae," Microbiology, pp 64(1), 91-99,
1970
[5] B Norkrans, "Studies on marine occurring yeasts: Growth related to pH, NaCl
concentration and temperature," Archiv Fur Mikrobiologie, pp 54(4), 374–392,
1966
[6] Ross, S S and Morris, E 0 , "Effect of sodium chloride on the growth of
certain yeasts of marine origin," Journal of the Science of Food and
Agriculture, pp 13 (9), 467-475, 1962
[7] Combs, T J., Guarneri, J.J and Pisano, M A., "The effect of sodium chloride
on the lipid content and fatty acid composition of Candida albicam,"
Mycologia , pp 60, 1232-1239, 1968
[8] Logothetis, S., Nerantzis, E T., Gioulioti, A., Kanelis, T., Panagiotis, T and Walker, G., "Influence of sodium chloride on wine yeast fermentation
performance," International Journal of Wine Research, pp 2, 35, 2010
[9] K T Sơn, Giáo trình thực tập công nghệ lên men, Tp Hồ Chí Minh, 2019 [10] Shokoohi, S., Tsigounis, K., Urmaza, L M and Perez, A Z., "The effect of stress due to sodium chloride exposure on the growth of Saccharomyces
cerevisiae," The Expedition, p 5, 2016
[11] Chin, K D H and Koehler, P E , "Effect of salt concentration and incubation temperature on formation of histamine, phenethylamine, tryptamine and
tyramine during miso fermentation," Journal of food protection, pp 49(6),
423-427, 1986
[12] Praphailong, W and Fleet, G H., "The effect of pH, sodium chloride, sucrose,
sorbate and benzoate on the growth of food spoilage yeasts," Food
Microbiology, pp 14(5), 459-468, 1997
[13] Casey, E, Mosier, N S., Adamec, J., Stockdale, Z., Ho, N and Sedlak, M.,
"Effect of salts on the co-fermentation of glucose and xylose by a genetically
engineered strain of Saccharomyces cerevisiae," Biotechnology for biofuels,
pp 6(1), 83, 2013
[14] Bautista-Gallego, J., Arroyo-Lopez, F N., Durán-Quintana, M C and Garrido-Fernandez, A., "Individual effects of sodium, potassium, calcium, and magnesium chloride salts on Lactobacillus pentosus and Saccharomyces
cerevisiae growth," Journal of Food Protection, pp 71(7), 1412-1421, 2008