Báo cáo thực hành thí nghiệm vi sinh thực phẩm HCMUTE

Dùng phương pháp MPN (most probable number) để đánh giá số lượng Coliforms có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu, rồi sau đó rút ra kết luận về mức độ vệ sinh của mẫu, nguy cơ hư hỏng của thực phẩm và khả năng gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người ở mức độ vi sinh vật này.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KĨ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM

_

BÁO CÁO THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

16116101

16116033

16116078

16116069

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

DANH MỤC HÌNH 5

Bài 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFROM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN 6

1 Mục đích 6

2 Vật liệu và phương pháp 6

3 Cách tiến hành 6

3.1 Chuẩn bị môi trường LTB: Môi trường LTB (Lauryl Tryptose Broth): 6

3.2 Chuẩn bị môi trường BGBL: 6

3.3 Quy trình tiến hành 6

4 Kết quả 7

5 Nhận xét 13

Bài 2 ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 14

1 Mục đích 14

2 Vật liệu và phương pháp 14

3 Cách tiến hành 14

3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA): 14

3.2 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích : 15

3.3 Đổ hộp 15

4 Kết quả 15

5 Nhận xét 17

Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC 18

1 Mục đích 18

2 Vật liệu và phương pháp 18

3 Cách tiến hành 18

3.1 Chuẩn bị môi trường sử dụng (Potato dextrose agar) 18

3.2 Hấp tiệt trùng 18

3.3 Pha loãng mẫu 19

3.4 Trải đĩa 19

4 Kết quả 20

5 Nhận xét 21

BÀI 4: KĨ THUẬT CẤY RIA VÀ MÔI TRƯỜNG CHUYÊN BIỆT 22

1 Mục đích 22

2 Vật liệu 22

3 Cách tiến hành 22

3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA): 22

3.2 Hấp tiệt trùng 23

3.3 Cấy ria 23

4 Kết quả 24

5 Nhận xét 25

Bài 5 – TIÊU BẢN GIỌT TREO – TIÊU BẢN GIỌT ÉP 26

QUAN SÁT SỰ DI ĐỘNG CỦA VI KHUẨN 26

1 Mục đích 26

2 Vật liệu và phương pháp 26

3 Cách tiến hành 26

3.1 Tiêu bản giọt treo 26

3.2 Tiêu bản giọt ép 26

3.3 Quan sát dưới kính hiển vi: 27

4 Kết quả 27

5 Nhận xét và giải thích 27

Bài 6 – TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN 28

1 Mục đích 28

2 Vật liệu và phương pháp 28

3 Cách tiến hành 28

3.1 Tạo vết bôi 28

3.2 Nhuộm đơn 28

4 Kết quả 29

5 Nhận xét kết quả 30

BÀI 7: NHUỘM BÀO TỬ 32

1 Mục đích 32

2 Vật liệu và phương pháp 32

3 Cách tiến hành 32

4 Kết quả 33

5 Nhận xét và giải thích 33

BÀI 8: NHUỘM GRAM 34

3 Cách tiến hành 35

4 Kết quả 35

5 Nhận xét và giải thích 35

BÀI 9: QUAN SÁT NẤM SỢI 37

1 Mục đích 37

2 Vật liệu và phương pháp 37

3 Cách tiến hành 37

3.1 Quy trình quan sát hình thái nấm mốc 37

3.2 Quy trình chuẩn bị tiêu bản phòng ẩm 37

4 Kết quả 38

5 Nhận xét 40

DANH MỤC HÌNH

nh 1.1 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-1 7

nh 1.2 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-2 8

nh 1.3 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-3 8

nh 1.4 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-4……… 9

nh 1.5 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-5……… 9

nh 1.6 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-1……… 10

nh 1.7 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-2 10

nh 1.8 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-3 11

nh 1.9 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-4 11

nh 1.10 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-5……… 12

nh 2.1 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-1……… 16

nh 2.2 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-2……… 16

nh 2.3 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-3 16

nh 3.1 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-2 20

nh 3.2 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-3 20

nh 3.3 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-4 21

nh 4.1 Kết quả cấy ria lần 1 24

nh 4.2 Kết quả cấy ria lần 2 25

nh 4.3 Kết quả cấy ria lần 3 25

nh 6.1 Nấm men nhộm bằng Alkaline methylene blue 29

nh 6.2 Nấm men nhuộm bằng Crystal violet 29

nh 6.3 Nấm men nhuộm bằng Cacbolfuchsin 30

nh 6.4 Vi khuẩn Lactic nhuộm bằng Crystal violet 30

nh 7.1 Nhuộm bào tử 33

nh 8.1 Nhuộm gram vi khuẩn E.coli 35

nh 9.1 Nấm sợi quan sát bằng vật kính x4 39

nh 9.2 Nấm sợi quan sát bằng vật kính x10 39

nh 9.3Tiêu bản phòng ầm 39

nh 9.4 Tiêu bản nấm sợi quan sát bằng vật kính x10 40

nh 9.5 Tiêu bản nấm sợi quan sát bằng vật kính x40 40

Bài 1: ĐỊNH LƯỢNG COLIFROM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

1 Mục đích

Dùng phương pháp MPN (most probable number) để đánh giá số lượng Coliforms

có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu, rồi sau đó rút ra kết luận

về mức độ vệ sinh của mẫu, nguy cơ hư hỏng của thực phẩm và khả năng gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người ở mức độ vi sinh vật này

2 Vật liệu và phương pháp

 Vật liệu :

- Môi trường LSB (Lauryl Sulfate Broth – dạng bột pha sẵn), BGBL (Billiant Green Bile

Lactose Broth – dạng bột pha sẵn)

- Nước cất pha loãng mẫu

- Ống nghiệm, pipette tips, micropipette và bộ dụng cụ thí nghiệm ( giấy , nước cất, đèn cồn,

que cấy, bút lông…), 7 ống eppendorf cho 7 độ pha loãng mẫu (mỗi độ pha loãng 1 ống)

- Mẫu: nước trong hồ

Hấp tiệt trùng môi trường LSB, nước cất, các dụng cụ thí nghiệm (được bao lại bằng giấy bạc hoặc giấy báo để tránh vi sinh vật bên ngoài gây nhiễm) ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút Phương pháp MPN

-1 sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng thứ 2 Trộn mẫu thật kỹ Dung dịch này có độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành tương tự đến độ pha loãng 10-7

a Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml môi trường LSB và ống durham úp ngược Thực hiện tương tự với dịch mẫu

4 Kết quả

Kết quả LTB

n 1.1 Kết quả LTB với độ pha loãng 10 -1

n 1.2 Kết quả LTB với độ pha loãng 10 -2

n 1.3 Kết quả LTB với độ pha loãng 10 -3

n 1.4 Kết quả LTB với độ pha loãng 10 -4

n 1.5 Kết quả LTB với độ pha loãng 10 -5

n 1.6 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10 -1

n 1.7 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10 -2

n 1.8 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10 -3

n 1.9 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10 -4

n 1.10 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10 -5

Các ống nghiệm có bọt khí trong ống durham và môi trường bị đục (so với ống đối chứng bên phải) là ống dương tính

5 Nhận xét

Theo QCVN 01: 2009/BYT về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước sinh hoạt:

Với kết quả MPN/ml cho thấy nguồn nước từ mẫu có số lượng Coliforms khá cao

(1100.103 MPN/ml), vượt quá giới hạn tối đa cho phép, điều này chứng minh nguồn nước không đảm bảo vệ sinh, không được phép sử dụng trong sinh hoạt

Bài 2 ĐỊNH LƢỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

1 Mục đích

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một chỉ tiêu vi sinh cơ bản của thực phẩm

Dựa vào chỉ tiêu này, người ta có thể đánh giá khái quát về tình trạng vệ sinh của thực phẩm cũng như dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm Số khuẩn lạc nhóm vi khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml thực phẩm càng cao chứng tỏ điều kiện vệ sinh sản xuất kém và thời gian sản phẩm sẽ càng ngắn Tùy thuộc vào loại thực phẩm mà giá trị tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép có mặt trong sản phẩm có thể thay đổi

- Bình tam giác chứa nước cất

- Các bình cầu chứa môi trường

- Các ống đầu tuýp, hộp đựng đầu tuýp

- Cốc đựng rác trong quá tr nh đổ hộp

- Micro pipet, pipet tip

- Đèn cồn

- Mẫu: nước dưa chua

Dụng cụ phải được vô trùng bằng autoclave ở 121OC trong 30 phút: Đĩa petri, bình tam giác, bình cầu chứa môi trường, ống đầu tuýp, hộp đựng đầu tuýp

 Phương pháp đếm khuẩn lạc

3 Cách tiến hành

3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA):

Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút Lấy phần dịch trong rồi thêm nước cho đủ 1000 ml Bổ sung thêm 50g glucose (5% w/v); 1g pepton (0,1% w/v) và 22g agar (2,2% w/v)

Môi trường được pha chế, phân phối vào 2 bình thủy tinh được đậy kín bằng bông

gòn không thấm nước ở miệng b nh Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh

miệng bình cho kín Không nên phân phối môi trường vào đĩa petri trước rồi mới hấp vì

sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất và sau

quá trình nuôi cấy sẽ khó quan sát và làm ảnh hưởng đến kết quả

 Vai trò của mỗi thành phần trong môi trường:

_Giá đỗ cung cấp nguồn dinh dưỡng gồm các chất khoáng vitamin…

_Glucose cung cấp nguồn năng lượng

_Pepton cung cấp nguồn nitơ

_Agar có tác dụng làm đông cứng bề mặt thạch để cố định và dễ dàng quan sát khuẩn

lạc

Phải pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng gồm hỗn hợp các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu, cân bằng ion của tế bào và sự ổn định pH của môi trường để vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tối ưu nhất

3.2 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích :

Pha loãng mẫu theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứ 9 ml nước vô trùng, trộn thật kỹ Dung dịch này có độ pha loãng 10-1 Tiếp tục chuyển 1 ml mẫu từ độ pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng thứ 2, trộn thật kỹ Dung dịch này có độ pha loãng 10-2 Tiếp tục làm tương tự đến độ pha loãng 10-3

3.3 Đổ hộp

- Dùng bút lông ghi chú lên đĩa petri ( tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng, nhóm nghiên

cứu )

- Dùng pipet vô trùng chuyển 2 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri Tương ứng với mỗi

độ pha loãng 3 đĩa

- Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở

45-50˚C

- Trộn đều mẫu bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều

3-5 lần ngày sau khi đổ môi trường

- Đặt các đĩa petri trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn

- ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30˚C trong 24-48 giờ, 24h kiểm tra kết quả sơ bộ, 48h kiểm tra

kết quả chính thức

Lưu ý: Khi ủ phải để hộp petri ở trạng thái lật úp (phần môi trường ở trên, phần nắp

nằm bên dưới)

4 Kết quả

Hình 2.1 Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -1

Hình 2.2 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -2

Hình 2.3 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -3

5 Nhận xét

Kết quả được quan sát sau 48h

Đặc điểm của các khuẩn lạc : Các khuẩn lạc trải đều ra bề mặt thạch

Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng sữa

Hình dạng : chủ yếu là chấm điểm có đường kính khoảng 0.1 mm, viền khuẩn lạc trơn láng, nhiều nhất ở 2 đĩa 10-1

Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC

1 Mục đích

Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc từ đó thông qua số lượng nấm men nấm mốc đếm được để xác định, đánh giá chất lượng của mẫu, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản và mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực , đồng thời quan sát được hình thái, cấu trúc của nấm men và nấm mốc

2 Vật liệu và phương pháp

 Vật liệu :

_Môi trường sử dụng là môi trường M5 – môi trường Potato dextrose agar

_Nước cất dùng để pha loãng mẫu

_12 đĩa petri cho 4 độ pha loãng mẫu (mỗi độ pha loãng 3 đĩa)

_5 ống eppendorf cho 5 độ pha loãng mẫu - Micropipette và hộp pipette tips

3.1 Chuẩn bị môi trường sử dụng (Potato dextrose agar)

Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 100g khoai tây cắt lát, không gọt vỏ với 500ml nước trong 30 phút Lọc qua giấy lọc, giữ lại phần dịch, đó là chất chiết khoai tây Lấy 50ml (20% v/v) dịch chiết khoai tây, thêm 200ml nước cất, 6g glucose (2%), 6g agar (2%)

3.2 Hấp tiệt trùng

Hấp tiệt trùng trong Autoclave ở 121°C trong 15 phút, gồm:

- Môi trường được pha chế, phân phối vào 2 bình thủy tinh được đậy kín bằng bông

gòn không thấm nước ở miệng b nh Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh

miệng bình cho kín

- Nước cất khoảng 70ml được chứa trong erlen, được đậy kín bằng bông gòn không

thấm nước ở miệng b nh Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh miệng bình

cho kín

- 12 cặp đĩa petri đã rửa sạch bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo

- 6 ống eppendorf

- Hộp pipette tips bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo

3.3 Pha loãng mẫu

Dùng micro pipette pha loãng mẫu theo dãy thập phân từ 10-1 đến 10-5

3.4 Trải đĩa

Sử dụng kỹ thuật trãi đĩa để tiến hành xác định chỉ tiêu tổng số nấm men, nấm mốc trong mẫu

- Ghi nhãn lên đĩa petri ( tên mẫu, tên kỹ thuật viên, ngày, )

- Đổ môi trường vào trong đĩa petri khoảng 15 ml Chờ môi trường đông đặc hoàn toàn

- Dùng pipette cho 2 ml mẫu vào chính giữa đĩa thạch

- Nhúng que thủy tinh hình L vào một cốc chưa ethanol Sau đó gõ nhẹ que thủy tinh vào thành cốc để loại bớt ethanol thừa

- Khẽ đưa que thủy tinh gần ngọn lửa đèn ethanol để làm bốc cháy que thủy tinh Làm nguội bằng cách chạm que thủy tinh vào phần nắp bên trong đĩa thạch

- Trãi mẫu vi sinh vật sao cho dàn đều khắp bề mặt môi trường thạch

- Nhúng que thủy tinh vào ethanol, gõ nhẹ vào cốc và đốt cháy que thủy tinh

- Lặp lại thao tác với đĩa thạch kế tiếp Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 lần

- Tiến hành nuôi cấy trong tủ ủ vi sinh ở 30˚C trong 16-48h

- Tiến hành quan sát h nh thái đại thể của khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc nấm men/ nấm mốc

và ghi nhận lại kết quả

Lưu ý: Trong thời gian ủ, nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi

trường nuối cấy, tạo thành khuẩn lạc mới Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt

thời gian ủ, hạn chế chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả Mặt

khác khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để tránh sự phát tán của

bào tử và không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác Khi ủ phải

để hộp petri ở trạng thái lật úp (phần môi trường ở trên, phần nắp nằm bên dưới)

4 Kết quả

Hình 3.1: Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -2

Hình 3.2 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -3

Hình 3.3: Mẫu có nồng độ pha loãng 10 -4

)

BÀI 4: KĨ THUẬT CẤY RIA VÀ MÔI TRƯỜNG CHUYÊN BIỆT

1 Mục đích

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu

và đưa về dạng thuần khiết Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc

nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật

Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ một tế bào ban

đầu Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở

dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá

hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó th cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết

Kỹ thuật cấy ria (streak-plate technique) có thể tạo ra được các khuẩn lạc thuần

_Nước cất dùng để pha loãng mẫu

_Micropipette và hộp pipette tips

_Đèn cồn và hột quẹt

_Đĩa petri

_Que cấy vòng

_Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí ( lấy từ bài định lượng vi khuẩn hiếu khí)

Môi trường được pha chế, phân phối vào các b nh thủy tinh, nước cất và các dụng cụ được hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút Các b nh chứa môi trường chưa được sử dụng phải

được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 °C Trước khi sử dụng phải được đun chảy và làm nguội khoảng 45 - 50°C

3 Cách tiến hành

3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA):

Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 500ml nước Đun sôi 30 phút Lấy phần dịch trong

rồi thêm nước cho đủ 250 ml Bổ sung thêm 12,5g glucose (5% w/v); 0,25g pepton (0,1%

w/v) và 5.5g agar (2,2% w/v)