TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HÓA BIẾN DƯỠNG

Trước khi đến phòng thí nghiệm, sinh viên phải đọc và tìm hiểu trước nội dung và ý nghĩa của bài thực tập, tránh làm thí nghiệm một cách máy móc, thụ động.. Khi chưa được sự hướng dẫn củ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

TÀI LIỆU THỰC TẬP SINH HÓA BIẾN DƯỠNG

Biên soạn: BSTY Trần Thanh Tiến

MỤC LỤC

trang

Nội quy phòng thí nghiệm 3

An toàn phòng thí nghiệm 4

Nội dung 1: Gây bệnh thực nghiệm 7

Nội dung 2: Định tính & định lượng protein trong huyết thanh 8

Nội dung 3: Định lượng vitamin C trong huyết thanh 12

Nội dung 4: Định lượng nitrogen amine 14

Nội dung 5: Xác định hoạt lực emzyme amylase trong huyết thanh 15

Nội dung 6: Xác định hoạt lực emzyme urease trong bột đậu nành 17

NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM

1 Sinh viên phải có mặt tại phòng thí nghiệm đúng giờ ấn định Những sinh viên đến trễ 15 phút coi như vắng mặt (không thực tập bù) Sinh viên phải hoàn thành tất cả các bài thực tập và đạt yêu cầu phần thực tập mới được dự thi phần lý thuyết

2 Trong mỗi buổi thực tập, sinh viên được chia ra thành 4 tiểu nhóm (6 sinh viên), thực hiện theo nhóm khi thực tập Trước khi đến phòng thí nghiệm, sinh viên phải đọc và tìm hiểu trước nội dung và ý nghĩa của bài thực tập, tránh làm thí nghiệm một cách máy móc, thụ động

3 Mỗi tiểu nhóm được sử dụng và chịu trách nhiệm về những dụng cụ và hóa chất của bào thực tập đang làm Cuối buổi thực tập, sinh viên phải rửa dụng cụ, làm vệ sinh, xếp đặt chỗ thực tập gọn gàng và bàn giao dụng cụ, hóa chất cho giảng viên phụ trách trước khi ra về

4 Trong khi làm thực tập, sinh viên phải giữ trật tự, không đùa giỡn trong phòng thí nghiệm Khi chưa được sự hướng dẫn của giảng viên, sinh viên tuyệt đối không được tò mò sử dụng các hóa chất, dụng cụ điện, máy móc, thiết bị trong phòng thí nghiệm Sinh viên nào vi phạm sẽ phải chịu toàn bộ trách nhiệm về các thiệt hại do mình gây ra

5 Nộp bài tường trình/ báo cáo vào cuối buổi thực tập

6 Phải mặc áo blouse khi vào phòng thực tập

AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

I Nguyên tắc chung:

- Phải giữ cho bàn làm việc sạch sẽ, gọn gàng, ngăn nắp

- Tránh làm nhiễm tạp hóa chất, chỉ sử dụng các dụng cụ sạch, đánh dấu các dụng

cụ đang sử dụng

- Phải tập trung trong quá trình làm thí nghiệm

- Sinh viên phải luôn nhận thức rằng các hóa chất được sử dụng trong phòng thí nghiệm luôn tiềm ẩn nguy cơ ngộ độc, kích ứng và có khả năng gây cháy nổ

- Sinh viên khi thực hành cần phải nắm chắc quy trình tiến hành các thí nghiệm và phải biết tất cả tính chất vật lý và tính chất hóa học của các hóa chất và các thuốc thử sử dụng

- Sinh viên phải biết sử dụng các thiết bị an toàn và có thể xử lý các tình huống khẩn cấp

*** Lưu ý: Đôi khi sự bất cẩn của một sinh viên có thể là nguyên nhân dẫn đến

tổn thương cho những sinh viên khác Như vậy mỗi một sinh viên có một sự liên quan đặt biệt đến sự an toàn của các bạn cùng lớp

II Quy định an toàn chung:

- Không làm việc một mình trong phòng thí nghiệm

- Không tự ý làm các thí nghiệm nếu không được sự cho phép

- Nghiêm cấm ăn, uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm

- Phải biết rõ vị trí và cách dùng các thiết bị an toàn tiêu chuẩn Phòng thí nghiệm phải được trang bị bình cứu hỏa, vòi rửa mắt, vòi tắm khẩn cấp, tủ hút, dụng cụ sơ cứu

- Đeo kính bảo hộ khi làm việc trong phòng thí nghiệm Không đeo kính sát tròng

kể cả trường hợp đã dùng kính bảo hộ) vì những tai nạn xảy ra khi hoá chất ở dưới kính sát tròng gây tổn thương nặng hơn

- Các thí nghiệm với các chất độc, chất bay hơi phải tiến hành trong tủ hút

- Cần tuân thủ nghiêm các quy định sử dụng hóa chất, chú ý các ký hiệu vật tư ghi trên các chai lọ đựng hóa chất

- Không được nếm bất cứ loại hóa chất trong phòng, không ngửi trực tiếp bất cứ khí hay chất có mùi, mà phải tuân theo phương pháp chuẩn để định mùi với bàn tay

- Đi giày kín mũi và quần dài hạn chế tổn thương ở phần chân, không đi sandals hay quần shorts vào phòng thí nghiệm

- Tóc dài cần cột gọn lại (nhất là khi dùng lửa ngoài, không phải là trong lò kín)

- Cặp, túi để trên kệ riêng

- Rửa tay trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm

III Một số qui định đặc biệt:

- Trong khi đun nóng dung dịch phải chắc chắn rằng không đun quá nhiệt do đó cần lắc hoặc khuấy đều dung dịch trong suốt quá trình đun Miệng của dụng cụ chứa dung dịch đun nên hướng về phía không có người

- Khi lấy acid hoặc base mạnh cần phải hết sức chú ý Vd: khi pha loãng acid đậm

đặc, phải rót từ từ acid vào nước, tránh làm ngược lại

- Phải sử dụng pipette tự động hoặc bơm pipette để hút các chất độc, chất lỏng sinh học, acid mạnh, base mạnh

- Các chất, dung môi độc khi pha chế và sử dụng cần tiến hành trong tủ hút và phải hết sức cẩn thận

- Các chất, dung môi dễ cháy như ether, alcohols, benzene không được để gần lửa, không đun trên ngọn lửa trần

- Không được cho đột ngột nước nóng vào dụng cụ thủy tinh đang lạnh hoặc ở nhiệt

độ thường

- Trước khi sử dụng các thiết bị điện cần phải chắc chắn rằng nó đã được tiếp đất

- Các hóa chất, dung môi đã sử dụng nên thu gom riêng vào các can, thùng chứa riêng để xử lý, tuyệt đối không nên xả vào nguồn nước thải

- Trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm phải tắt tất hết các thiết bị điện và khí gas (tuy nhiên không nên khóa nguồn nước)

IV Cách xử lý tình huống khẩn cấp trong trường hợp tai nạn hay tổn thương

a Hóa chất dính vào mắt:

- Dùng ngón tay cái và ngón trỏ mở rộng mí mắt sau đó rửa bằng vời rửa mắt khẩn cấp, mắt cần được rửa bằng một lượng lớn nước

- Khi dung dịch acid dính vào mắt, thì nên rửa mắt bằng NaHCO3 1% còn nếu dung dịch alkaline dính vào mắt thì rửa bằng acid boric 1%

b Bỏng:

- Khi bị bỏng trên da không nên rửa bằng nước mà nên sử dụng các loại băng chuyên dụng

- Khám bác sĩ nếu cần thiết

c Ngộ độc:

- Đưa đến bệnh viện càng sớm càng tốt

*** LƯU Ý: Tất cả các tai nạn và tổn thương đều phải báo cáo lại với người quản

lý phòng thí nghiệm

NỘI DUNG 1:

GÂY BỆNH THỰC NGHIỆM

- Lớp được tổ chức thành nhóm (25 bạn/nhóm)

- Mỗi nhóm được nhận 1 con thỏ (trọng lượng khoảng 2 kg) và lồng nuôi

- Thỏ được gây độc bằng CCl4

- Lấy mẫu máu và kiểm tra nồng độ AST, ALT tại Trung tâm chẩn đoán và điều trị, Chi cục thú y TP HCM

- Mổ khám và ghi nhận bệnh tích đại thể

- Đọc kết quả xét nghiệm

- Thảo luận

- Báo cáo kết quả thảo luận

NỘI DUNG 2:

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

TRONG HUYẾT THANH

I Định tính:

1 Khảo sát tính chất sa lắng và biến tính của protein

 Nguyên tắc

Protein hòa tan trong nước tạo thành dung dịch keo bền vững Sự bền vững này do hai yếu tố:

- Sức đẩy tĩnh điện giữa các hạt keo protein mang điện tích cùng dấu

- Lớp vỏ thủy hóa

Nếu mất một trong hai yếu tố hoặc cả hai thì hạt keo sẽ kết dính lại và sa lắng Có nhiều cách làm sa lắng protein như:

- Sa lắng bởi muối kiềm

- Sa lắng bởi các dung môi hữu cơ: acetone, alcohol, ether…

- Sa lắng bởi các kim loại nặng: Hg, Ag, Pb…

- Sa lắng bởi các acid mạnh: acid trichloracetic, nitric…

 Hóa chất

- Dung dịch lòng trắng trứng 1%

- Dung dịch ammonium sulfate bão hòa

- Acetone

- Acetate chì 5%

- Acid trichloracetic 10%

 Cách làm

Lấy 4 ống nghiệm đánh số theo thứ tự và cho vào các hóa chất theo thứ tự sau:

Lòng trắng trứng 3ml 3ml 3ml 3ml Ammonium sulfate 3ml - - -

Acetate chì - - 3ml - Trichloracetic - - - 3ml Quan sát và so sánh sự sa lắng, biến tính của protein ở 4 phương pháp Ghi nhận kết quả

2 Phản ứng Biurette

 Nguyên tắc

Phản ứng Biurette là một phản ứng định tính xác định liên kết peptide (CO-NH) trong mẫu xét nghiệm, (định tính protein, polypeptide) Trong môi trường kiềm, dung dịch sulfate đồng sẽ phản ứng với liên kết peptide thành lập phức hợp muối đồng nhị màu tím theo phản ứng:

Phức hợp muối đồng nhị (màu tím)

 Hóa chất

- Thuốc thử Biurette

- Huyết thanh

- Dung dịch amino acid 1%: glycine

 Cách làm

Dùng pipette hút:

- 1 ml huyết thanh cho vào ống nghiệm

- 2ml thuốc thử Biurette, lắc đều

- Quan sát màu tím

Lặp lại phản ứng với dung dịch glycine Ghi nhận kết quả

II Định lượng

1 Định hàm lượng protein tổng số trong huyết thanh bằng khúc xạ kế

 Nguyên tắc

Dựa vào sự khác biệt về độ chiết xuất n giữa các dung dịch huyết thanh, ánh sáng đi qua dung dịch sẽ bị khúc xạ và tia ló qua lăng kính được định lại qua thị trường làm ranh giới hai vùng sáng tối, chỉ lượng protein tổng số trên thước chuẩn

 Hóa chất

- Huyết thanh

- Acetone

- Nước cất

 Cách làm

Dùng bông gòn tẩm acetone lau sạch mặt kính, sau đó rửa lại nhiều lần bằng nước cất và lau lại bằng bông gòn khô Đậy nắp nhựa trên mặt kính và nhỏ một giọt huyết thanh vào rãnh đậy Nhìn qua thị kính sẽ có được thị trường với hai vùng: vùng tối ở trên và vùng sáng ở dưới Ranh giới giữa hai vùng xác định hàm lượng protein tổng số trong mẫu huyết thanh khảo sát trên thước chuẩn, đơn vị đo là g% (số gram protein có trong 100ml huyết thanh)

2 Định lượng Albumin và Globulin huyết thanh (bằng phương pháp Reinhold)

 Nguyên tắc

Tiểu phần globulin huyết thanh được loại bỏ bằng dung dịch muối ammoni sulfate qua sự sa lắng và ly tâm tách lấy phần nước trong Sau đó dùng dung dịch sulfate đồng trong thuốc thử biurette sẽ làm hiện màu do các liên kết peptide trong phân tử Độ đậm nhạt của màu do số liên kết peptide hiện diện và được xác định bằng mật độ quang học (A) ở độ dài sóng λ = 550 nm của quang kế

 Hóa chất

- Huyết thanh

- Thuốc thử Biurette

- Dung dịch ammonium sulfate ((NH4)2SO4) 23% hoặc sodium sulfate (Na2SO4) 23%

- Sodium chloride (NaCl) 0.9%

 Cách làm

- Loại bỏ globulin: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết thanh, thêm 7.5ml

Na2SO4 23% lắc đều, để yên 5 phút, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cặn bằng cách lọc qua giấy lọc Đây là nước lọc 1, trong đó chỉ còn albumin

- Tìm protein tổng số: cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết thanh, thêm 7.5ml

NaCl 0.9% Ly tâm bỏ cặn (nếu có) Đây là nước lọc 2

- Dùng 3 ống nghiệm đánh số theo thứ tự và thêm hóa chất vào như sau:

Na2SO4 23% hoặc ((NH4)2SO4) 23% - - 3ml Thuốc thử Biurette 3ml 3ml 3ml

- Lắc đều, để yên 30 phút, đọc độ hấp thu (A) trên quang phổ kế với bước sóng

λ = 550 nm

o Ống 3: để chỉnh máy với độ hấp thu bằng 0

o Ống 1: độ hấp thu A1 của albumin

o Ống 2: độ hấp thu A2 của protein tổng số

- Sau đó dùng khúc xạ kế đo hàm lượng protein tổng số trong huyết thanh

- Cách tính: dựa vào quy tắc tam suất:

Protein tổng số: Độ hấp thu A2 X (g%) Albumin : Độ hấp thu A1 ? Y (g%) Globulin = Protein tổng số (g%) - Albumin (g%)

NỘI DUNG 3:

ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG HUYẾT THANH

 Nguyên tắc

Vitamin C khơng bền, dễ bị oxy hĩa bởi khơng khí, trong mơi trường acid

và yếm khí vitamin C bền vững 2,6 dichlorophenol indophenolcol màu xanh dương, khi nhận cặp hydrogen từ acid ascorbic sẽ trở thành khơng màu và trong mơi trường acid yếu thì biến thành màu hồng, acid ascorbic biến thành acid dehydroascorbic

C C C C C

CH OH2

-OH

H-

HO OH O -H

O C C C C C

CH OH2

-OH

H-

HO OH O -H

O C C C C C

CH OH2

-OH

H-

HO OH O

O

+ O= = N - -OH

Cl Cl

-OH Cl

Cl

N

-H

HO

-C C C C C

CH OH

O

=

=OO -H

H-

HO-O

A.Dehydroascorbic

2,6 dichlorophenol indophenol

dạng hoàn nguyên (không màu)

2

+

 Hĩa chất

- Huyết thanh

- Thuốc thử 2,6 dichlorophenol indophenolcol

- Acid metaphosphoric 5%, điều chỉnh pH = 2,5 – 3 bằng HCl 0.1N

 Cách làm

Cho vào ống nghiệm ly tâm

- 3 ml nước cất

- 1ml huyết thanh

- 1ml dung dịch acid metaphosphoric

Lập ống đối chứng cĩ chứa:

X =

- 1ml dung dịch acid metaphosphoric

Ly tâm cả 2 ống 3000 vòng/ phút trong 5 phút Lấy 3ml nước trong mỗi ống đem chuẩn độ bằng 2,6 dichlorophenol indophenolcol đến khi có màu hồng nhạt bền trong 1 phút Ghi số ml thuốc thử đã dùng chuẩn độ cho mỗi ống

 Tính kết quả

(A-B) x 0.088 x 5x 10 (mg%)

3

Trong đó: X= số mg vitamin C trong 100ml huyết thanh A= số ml thuốc thử đã dùng chuẩn độ ống huyết thanh B= số ml thuốc thử đã dùng chuẩn độ ống nước cất

NỘI DUNG 4:

ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITROGEN AMINE

 Nguyên tắc

Nitrogen amine là nitrogen của nhóm amine tự do trong các dung dịch amino acid, peptide, và protein Định hàm lượng nitrogen amine có ý nghĩa trong việc đánh giá quá trình trao đổi protein trong cơ thể động vật

Nhóm amine tự do trong dung dịch thường xuyên tạo liên kết nội phân tử với nhóm carboxyl nên muốn định lượng dùng formaldehyde phong bế nhóm amine để giải phóng nhóm carboxyl tự do, nhóm này được chuẩn độ định lượng bằng dung dịch NaOH Số nhóm amine của và carboxyl của phần lớn các amino acid tương đương nhau nên gián tiếp suy ra lượng amine

Phản ứng xảy ra trong khoảng pH 9 – 9.5, nên với chỉ thị màu, phenolphthalein phải chuẩn độ màu đến màu đỏ tía Chỉ thị màu thích hợp nhất

là thymolphtalein

 Hóa chất

- Dung dịch glycine

- Formaldehyde trung tính

- NaOH 0.2N

 Cách làm

Lấy hai bình nón ghi thứ tự:

Glycine 10 ml - Nước cất - 10 ml Formaldehyde 5 ml 5 ml Phenolphtalein 2 giọt 2 giọt

Lắc nhẹ, đem chuẩn độ với NaOH 0.2N từ burette đến khi có màu đỏ tía Ghi số ml NaOH 0.2N đã dùng để định chuẩn cho mỗi bình và tính kết quả theo công thức:

X = (V A – V B ) x 2.8 mg

Trong đó:

X: số mg nitrogen amine chứa trong 10ml dung dịch glycine

VA: số ml NaOH định chuẩn bình A

VB: số ml NaOH định chuẩn bình B

amylase maltase

NỘI DUNG 5:

XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC EMZYME AMYLASE

TRONG HUYẾT THANH

 Nguyên tắc

Dưới tác dụng của amylase tinh bột bị thủy phân thành các cấu tử nhỏ hơn

là các dextrin hoặc thủy phân đến sản phẩm cuối cùng là maltose hay glucose Phản ứng màu đặc trưng giữa iod với tinh bột và dextrin cũng khác nhau Dựa vào nguyên tắc này xác định hoạt lực của amylase

Phản ứng:

Tinh bột Dextrin Maltose Glucose +I 2 + I 2 + I 2 + I 2

Màu xanh chàm Màu nâu Không màu Không màu

 Hóa chất

- Huyết thanh

- Dung dịch NaCl 0.9%

- Dung dịch iod 0.5% trong alcohol

- Dung dịch tinh bột 1%

 Cách làm

- Dùng 9 ống nghiệm lớn ghi số thứ tự từ 1 đến 9, cho vào mỗi ống 1ml

NaCl 0.9% Pha loãng nồng độ huyết thanh (amylase) bằng cách dùng pipette hút chính xác 1ml huyết thanh cho vào ống 1, lắc đều (ống 1 có huyết thanh pha loãng nồng độ ½) Hút chính xác 1 ml hỗn hợp ở ống 1 cho vào ống 2, lắc đều (huyết thanh pha loãng nồng độ ¼) Hút chính xác 1ml hỗn hợp ống 2 cho vào ống 3…tiếp tục pha loãng đến ống 9 Hút chính xác 1ml hỗn hợp trong ống 9

bỏ đi Sau đó cho vào mỗi ống 2ml tinh bột 1% và lắc đều các ống

- Nhỏ một giọt dung dịch iod vào mỗi ống, lắc đều

- Quan sát sự thay đổi màu (chú ý thứ tự của các ống)

- Đọc kết quả bằng cách chọn số thứ tự của ống có màu nâu cạnh ống có

màu xanh Tra bảng để suy ra hoạt lực amylase trong huyết thanh xét nghiệm

- Hoạt lực amylase:

Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9

NỘI DUNG 6:

XÁC ĐỊNH HOẠT LỰC EMZYME UREASE

TRONG BỘT ĐẬU NÀNH

Urease là enzyme có thể thủy giải urease theo phản ứng sau:

(NH2)2CO + H2O → (NH4)2CO3

Nếu thêm formol vào môi trường, sẽ có phản ứng tạo thành hexamethylene tetramine và acid carbonic theo phản ứng sau:

2 (NH4)2CO3 + 6 HCHO → (CH2)6N4 + 6 H2O + H2CO3

Acid tạo thành có thể được định phân bằng kiềm và xác định lượng urea bị thủy giải, từ đó suy ra hoạt tính của enzyme urease

 Hóa chất

- Dung dịch NaOH 0.05N

- Dung dịch urea 2% (w/v)

- Formol trung tính

- Dung dịch urease: Khuấy 3 gam bột đậu nành trong 100 mL nước cất Để

yên trong 15 phút Dịch trong ở trên chứa nhiều urease Đem lọc thu lấy dịch lọc

- Dung dịch phenolphtalein 1% trong cồn

- Chuẩn bị 2 bình nón theo bảng sau:

Thể tích dung dịch urea 2% (ml) 5 5 Thể tích dung dịch enzyme urease (ml) 5 0 Thể tích dd enzyme urease đã đun sôi (ml) 0 5

- Cho vào mỗi bình nón 5ml formol đã được trung tinh

- Lắc đều trong vài phút

thị màu là phenolphtalein 1%