Phương pháp xác định trình tự ADN

Phương pháp xác định trình tự ADN

•Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp

xếp các nucleotides trong một chuỗi hoặc 1 đoạn DNA.

•Sử dụng các phương pháp :

Maxam-Gilbert (1977)

Sanger (1977)

Xác định trình tự tự động

Phương pháp xác định

trình tự ADN

I.Phương phỏp Maxam-Gilbert

1.Nguyờn lý

•Là phương phỏp phõn giải húa học (do Allan Maxam và

Walter Gilbert ở đại học Haward đã đề xuất năm1977).

•Sử dụng húa chất để phõn hủy ADN ở cỏc vị trớ base

đặc hiệu tạo ra cỏc đoạn cú chiều dài khỏc nhau 1 nucleotid

•Điện di các đoạn ADN này và nhận biết vị trí của

chúng nhờ đánh dấu phóng xạ Dựa vào đó để đọc đ ợc trình tự của ADN

2 Các b ớc tiến hành

 Chuỗi ADN kép đ ợc đánh dấu phóng xạ với 32 P tại đầu cuối 5’

nhờ enzym polynucleotit kinase và 32 P - dATP

 Dùng dimethyl sunphoxit đun nóng đến 90 0 C để tách ADN thành 2 sợi đơn và điện di tách dời từng loại sơi đơn

 Các sợi đơn đ ợc chia thành 4 mẫu riêng rẽ và đ ợc xử lý với

các hoá chất đặc hiệu để phá hỏng 1 hay 2 trong 4 bazơ nitơ:

 Dimethylsun phat phá hỏng G

 Glicosidic phá hỏng A+G

 Hydrazin phá hỏng C+T

 hydrazin + NaCl phá hỏng C

I.Phương phỏp Maxam-Gilbert

Phương phỏp Maxam-Gilbert

 Xử lý tiếp các mẫu này với piperidin để bẻ gẫy ADN tại vị

trí bazơ nitơ đã bị phá hỏng

 Điện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim phóng xạ tự ghi v đọc vị trí của các nucleotit lần l ợt à đọc vị trí của các nucleotit lần lượt trên

4 mẫu từ cực d ơng của gel lên cực âm theo nguyên tắc:

đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ

Ví dụ

• Đoạn mạch đơn ADN đánh dấu đầu 5‘ ở nucleotid A có trình tự:

- Xử lý G: tạo 3 đoạn

- Xử lý A+G: tạo 5 đoạn

- Xử lý T+C: tạo 5 đoạn

- Xử lý C: tạo 2 đoạn

II.Phương phỏp Sanger

1.Nguyờn lý

• Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase trong quỏ trỡnh tổng hợp ADN Enzym này xỳc tỏc gắn cỏc nucleotid vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trớ 3'OH, khi gặp nucleotid khụng cú nhúm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại và tạo ra cỏc đoạn AND chờnh lệch nhau 1 nucleotid

•Điện di các đoạn ADN này và nhận biết vị trí của chúng nhờ

đánh dấu phóng xạ Dựa vào đó để đọc đ ợc trình tự của ADN

• Nhõn tố kết thỳc đặc hiệu được sử dụng là cỏc

dideoxynucleotit (phương phỏp dideoxynucleotid)

Phương phỏp Sanger

2.Cỏch tiến hành:

• Cắt ADN bằng enzym cắt giới hạn, tách các đoạn ADN đã cắt thành sợi

đơn và nhân dòng ( cloning ) chúng ( l ợng ADN > g ) bằng vetơ mạch

đơn: phage M13 để tạo đủ ADN làm nguyên liệu nghiên cứu

• Tiến hành đồng thời 4 phản ứng tổng hợp riêng rẽ cho đoạn ADN nghiên

cứu bằng ph ơng pháp tổng hợp nhờ enzym AND-polymerase và trong mỗi phản ứng có sự tham gia của l ợng nhỏ (1% ) 1 loại ddNTP và các đoạn mồi đã đ ợc đánh dấu phóng xạ 32 P hay 35 S

• Chạy điện di để tách các đoạn ADN đã tổng hợp đ ợc trong mỗi phản ứng

Điện di riêng rẽ kết quả của 4 phản ứng trên cùng 1 bản gel.

• Làm phim phóng xạ tự ghi cho bản gel điện di và đọc trình tự của

nucleotit trên điện di đồ lần l ợt trên cả 4 mẫu từ cực âm bản gel lên cực d

ơng theo nguyên tắc: đoạn ADN càng ngắn càng dịch chuyển xa so với

điểm xuất phát ban đầu trên bản điện di đồ

Bất lợi của phương pháp đánh dấu phóng xạ

• Đánh dấu 32P:chu kì bán rã ngắn (15 ngày) nên phải

sử dụng nhanh, do năng lương cao của tia xạ nên tín hiệu không nét

• Đánh dấu 35S: chu kì bán rã dài (2-3 tháng), năng

lượng của tia xạ thấp nên làm giảm độ nhạy của các phân tích

Manual sequencing method

III.Xỏc định trỡnh tự bằng

phương phỏp tự động

Nguyên tắc chung của giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ sở của ph ơng pháp Sanger Nh ng :

 Quá trình tổng hợp AND thực hiện nhờ kỳ thuật PCR

 Mỗi ddNTP đ ợc đánh dấu bằng một loại

fluochrom có màu khác nhau nên có thể tiến hành cả 4 phản ứng tổng hợp trong cùng một ống

nghiệm và điện di trên 1 băng

 Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số liệu

Figures taken from http://www.escience.ws/b572/L8/L8.htm