Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương pháp hoá học của Maxam- Gilbert
Trang 1Họ và Tên : Phạm Thị Phụng
Lớp : K33C
Khoa : Sinh – KTNN
Trường : ĐHSP Hà Nội 2
Bài kiểm tra học phần: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Đề bài: Trình bày phương pháp xác định trinh tự axitnucleic bằng phương pháp hoá học của Maxam- Gilbert.
Trả lời:
Hiện nay có một số phương pháp giải trình tự AND khác nhau.Trong đó có phương pháp giải trình tự các nucleotit của A.Maxam và W.Gilbert ( còn được gọi là phương pháp hoá học)
1 Nguyên lí của phương pháp:
- Đây là phương pháp phân giải hoá học của A.Maxam và W.Gilbert
- Sử dụng hoá chất để phân huỷ AND ở các vị trí bazơ đặc hiệu, tạo ra các đoạn
có chiều dài khác nhau 1 nucleotit
Hoá chất tác dụng Bazơ bị đứt gãy
Dimethylsunphat G
Hyđrazin + NaCl C
- Điện di các đoạn AND này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng
xạ Dựa vào đó để đọc được trình tự của AND
2 Các bước tiến hành
- Chuỗi AND kép được đánh dấu phóng xạ với 32P tại đầu cuối 5’ nhờ enzim Poli nucleotit kinaz và 32P-dATP
- Dùng Dimethylsunphoxit đun nóng đến 900 và điện di để biến tính và tách dời
2 sợi đơn
- Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và được xử lí với các hoá chất đặc hiệu
để phá hỏng một hoặc hai trong bốn bazơ nitơ
- Sử lí tiếp các mẫu này với Piperidin để bẻ gãy AND tại vị trí bazơ đã phá
hỏng
- Điện di riêng rẽ 4 mẫu trên cùng 1 gel điện di, làm phim phóng xạ tự ghi và đọc vị trí của các nu lần lượt trên 4 mẫu từ cực dương lên cực âm của gel theo nguyên tắc: Đoạn AND càng ngăn càng chạy xa so với điểm xuất phát trên bản điện di đồ
3 Ví dụ:
Cho đoạn mạch đơn AND
5’ ATTGACTTAGCC 3’
↓Gắn 32P vào đầu 5’
1
Trang 2* ATTGACTTAGCC ↓xử lí hoá chất
G
* ATT
* ATTGACTTA
* ATTGACTTAGCC
A+ G
* ATT
* ATTG
* ATTGACTT
* ATTGACTTA
* ATTGACTTAGCC
C+T
* A
* AT
* ATTGA
* ATTGAC
* ATTGACT
* ATTGACTTAG
* ATTGACTTAGC
* ATTGACTTAGCC
C
* ATTGA
* ATTGACTTAG
* ATTGACTTAGC
* ATTGACTTAGCC ↓ điện di trên 1 gel + chụp phóng xạ
Trình tự AND: 5’ ATTGACTTAGCC 3’
2