Với cây lúa, các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu đối với sự sinh trưởng và phát triển là: Cacbon, hydro, oxy (trong tự nhiên) và các chất khoáng: nito (N), lân (P), kali (K), canxi, sắt, kẽm, đồng, magie, mangan, môlípđen, bo, silic, lưu huỳnh, trong đó 3 chất dinh dưỡng cây lúa cần lượng lớn là: nito, photpho, kali. Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định trong sự biến đổi vật chất và năng lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosine triphosphate (ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống. Ngoài ra lân còn đóng vai trò khác nhau như tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây. Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sụt nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin et al., 1999). Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải). Theo Murphy et al, 2013, cây trồng chỉ có thể hấp thu 525% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi.
Trang 1VI N CÔNG NGH SINH H C- TH C PH M ỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ ỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ ỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ ỰC PHẨM ẨM
TI U LU N ỂU LUẬN ẬN
SINH
PHÂN L P CH NG VI SINH ẬN ỦNG VI SINH
V T PHÂN GI I LÂN KHÓ ẬN ẢI LÂN KHÓ TAN T Đ T TR NG LÚA Ừ ĐẤT TRỒNG LÚA ẤT TRỒNG LÚA Ồ CHÍ
Gi ng viên h ảng viên hướng dẫn: ướng dẫn: ng d n: ẫn:
L p: ớng dẫn:
Nhóm thuy t trình: ết trình:
Trang 2H Chí Minh, ngày 08 tháng 04 năm 2019 ồ Chí Minh, ngày 08 tháng 04 năm 2019
MỤC LỤC
Danh sách bảng
Danh sach chữ viết tắt
1 Mở đầu 4
1.1 Tổng quan 4
1.2 Vsv phân giải lân khó tan 4
1.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân của vsv 5
2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 5
2.1 Thiết bị 5
2.2 Phương pháp nghiên cứu 6
2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất 6
2.2.2 Phương pháp phân tích chỉ tiêu đất 6
2.2.3 Phương pháp phân tích chỉ tiêu vsv 6
2.2.3.1 Phương pháp xác định mật độ VKTS, XKTS, NTS 6
2.2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật và tế bào 6
2.2.3.3 Phương pháp phân tích trên môi trường thạch 7
3 Quy trình 9
3.1 Quy trình 9
3.2 Thuyết minh quy trình 10
3.2.1 Lấy mẫu đất 10
3.2.2 Đồng nhất mẫu 10
3.2.3 Pha loãng mẫu thập phân 10
3.2.4 Đếm khuẩn lạc 10
3.2.5 Đánh giá hoạt tính phân giải lân của vsv 11
3.2.6 Đánh giá hoạt tính tổng hợp IAA 11
4 Kết luận và một số giải pháp phát triển hệ vsv phân giải lân và nâng cao hiệu quả dinh dưỡng lân (tham khảo từ “ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HỆ
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN TRONG ĐẤT PHÙ SA GLÂY TRỒNG
Trang 3LÚA TẠI MỘT SỐ XÃ THUỘC HUYỆN TIÊN LỮ, TỈNH HƯNG YÊN”)
12
Tài liệu tham khảo 14 Phụ lục
DANH MỤC BẢNG
Số bảng
Tran g
Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập vsv phân giải lân
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Giải thích
PSM Phosphate Solubilizing Microorganisms
NBRIP National Botanical Research Institute of Phosphate
solubilizing bacteria
Trang 4PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN KHÓ TAN TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA
1 Mở đầu
1.1 Tổng quan
Với cây lúa, các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu đối với sự sinh trưởng và phát triển là: Cacbon, hydro, oxy (trong tự nhiên) và các chất khoáng: nito (N), lân (P), kali (K), canxi, sắt, kẽm, đồng, magie, mangan, mô-líp-đen, bo, silic, lưu huỳnh, trong đó 3 chất dinh dưỡng cây lúa cần lượng lớn là: nito, photpho, kali
Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định trong sự biến đổi vật chất và năng lượng Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosine triphosphate (ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống Ngoài ra lân còn đóng vai trò khác nhau như tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị
giảm sụt nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin et al.,
1999) Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải) Theo
Murphy et al, 2013, cây trồng chỉ có thể hấp thu 5-25% lượng lân được bón, số
còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi
1.2 Vsv phân giải lân khó tan
VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSMs) là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Vsv phân giải lân chia thành 2 nhóm: vsv phân giải lân hữu cơ và vsv phân giải lân vô cơ
Trang 5Các nghiên cứu trước đây đã ghi nhận nhiều nhóm vsv: Pseudomonas,
Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Selerotium, Aspergillus
và nấm rễ (Mycorrhira) có khả năng tiết một số enzyme từ đó phân giải và
chuyển hóa phosphate canxi mà cả phosphate nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng thành dạng dễ tan, giúp rễ cây hấp thụ VSV không chỉ chuyển hóa photpho vô cơ, mà còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có thể hấp thu được (Gaur, A C., 1992; Richardson, 2001) Bên cạnh đó, một số nhóm vsv còn có khả năng sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật, như Indole-3-acetic acid (IAA)
Vì thế, bổ sung nguồn vsv phân giải P khó tan trong đất được xem là một giải pháp hữu hiệu và thân thiện với môi trường, đồng thời làm tăng hiệu quả sử dụng phân bón
Bởi vì những lý do trên mà chúng em tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập
chủng vi sinh vật phân giải lân khó tan từ đất trồng lúa” với mục tiêu:
- Phân lập thành công chủng vsv có khả năng phân giải lân khó tan
- Đánh giá được hoạt tính phân giả lân của các chủng vsv tìm được
- Đánh giá được chủng vsv có khả năng tổng hợp IAA
1.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân của vsv
Khả năng phân giải lân của vi sinh vật ảnh hưởng bởi một số yếu tố sau:
- pH: nhìn chung độ pH ít ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân Tuy nhiên pH trong khoảng 7,5-8 là phù hợp nhất cho hệ vi sinh vật phân giải lân
- Nhiệt độ: các chủng vi sinh vật khác nhau có nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng phân giải lân là khác nhau Nhìn chung, nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 20-400C (Phạm Thanh Hà và cộng sự., 2003)
- Độ ẩm: độ ẩm cao giúp hoạt động của vi sinh vật mạnh tạo ra nhiều acid hữu cơ làm tăng hiệu quả phân giải lân
- Hệ rễ: hệ rễ cây trồng kích thích sự sinh trưởng của vi sinh vật Do đó, phân giải lân cũng được tăng cường Tuy nhiên một số loài cây có thể tiết ra các chất độc ngăn cản sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
- Tỉ lệ N và C trong môi trường: N, C trong môi trường cao sẽ thúc đẩy khả năng phân giải lân (Vũ Hữu Yêm., 1995)
- Hợp chất hữu cơ: Theo Tardieux – Roche (1996), hàm lượng chất hữu
cơ mùn hóa không làm ảnh hưởng đến quá trình phân giải lân Hợp chất hữu cơ tươi làm tăng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật, từ đó dẫn đến quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan
Trang 62 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1 Thiết bị
Đĩa petri, ống nghiệm, falcon, bình tam giác, ống đong
Que cấy, que trải thủy tinh, cốc thủy tinh, đèn cồn
Kính hiển vi, lame, lamelle
Cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy li tâm, máy li tâm lạnh
Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc mẫu, microwave, máy đo OD, máy khuấy từ
Micropipet, đầu tip, eppendorf và 1 số dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất
Loại đất: đất phù sa không được bồi, trồng chuyên lúa
Cách lấy và xử lý mẫu: lấy mẫu sát rễ lúa, đo lại nhiệt độ đất, tại mỗi ruộng lấy 5 vị trí, mỗi vị trí 200g Mẫu được bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển Các chỉ tiêu vsv được phân tích ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh (khoảng 50C) không quá 1 tuần
2.2.2 Phương pháp phân tích chỉ tiêu đất
pH: máy đo pH
N (%): phương pháp Kjeldhal
P2O5 (%): phương pháp so màu
K2O (%): phương pháp quang kế
P2O5 dễ tiêu (mg/100g đất): phương pháp Oniani
K2O dễ tiêu (mg/100g đất): phương pháp Maxlova
OC (%): Phương pháp Walkley – Black
2.2.3 Phương pháp phân tích chỉ tiêu vsv
2.2.3.1 Phương pháp xác định mật độ VKTS, XKTS, NTS
Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu
Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch: dùng phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm
- Phương pháp trải đĩa: trải 0,1ml mẫu lên đĩa chứa môi trường, ủ ngửa đĩa
và đếm khuẩn lạc
Trang 7- Phương pháp đổ đĩa: chọn nồng độ pha loãng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng Rót vào mỗi đĩa petri 10-15ml môi trường đã làm nguội 450C-500C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ngửa đĩa Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 khuẩn lạc để đếm
2.2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật và tế bào
Tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch Sau đó ủ ở 370C trong 72h
Quan sát hình thái và mô tả các đặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, màu sắc, cấu trúc
Làm tiêu bản tế bào bằng thuốc nhuộm (Crystal Violet, liugol, Safranin O)
và quan sát bằng kính hiển vi quang học
2.2.3.3 Phương pháp phân tích trên môi trường thạch
Hoạt tính phân giải lân được xác định thông qua đường kính vòng phân giải (định tính) hoặc thông qua nồng độ lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy (NBRIP và PVK) theo tỷ lệ % hoặc ppm (định lượng)
Hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) được xác định theo phương pháp nuôi cấy VSV trong môi trường Salkowski1 cải tiến có bổ sung 0,1% Tryptophan
Khả năng đối kháng vi khuẩn/nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng được đánh giá theo phương pháp khuếch tán hoạt chất ức chế VSV trong môi trường thạch
2.2.3.4 Phương pháp phân tích trên môi trường lỏng
Để định tính khả năng phân giải lân trên môi trường lỏng, dịch nuôi cấy được cho vào ống chứa 10 ml môi trường NBRIP, PVK lỏng Ủ ở 300C trong
10 ngày Hỗn hợp ly tâm ở 3000 rpm ở 20 phút Lượng lân phân giải trong dịch nổi được xác định bởi phương pháp đo màu của Olsen và Sommers (1982) để đánh giá hoạt tính phân giải lân khó tan và khả năng sinh IAA
2.3 Các môi trường sử dụng
1 Phụ lục A trang 14
Trang 8 Môi trường phân lập vsv phân giải lân vô cơ khó tan (NBRIP)
Bảng 2.1 Công thức môi trường NBRIP (Nautiya et al., 1999)
Ca3(PO4)2 (tri-calcium phosphate) 0,5
Bromothylmol Blue 0,5% trong KOH 0,2N 6 ml
Môi trường phân lập vsv phân giải lân hữu cơ:
Bảng 2.2 Công thức môi trường phân lập vsv phân giải lân hữu cơ
Môi trường nấm tổng số: bảng 2.3 trang 14
Môi trường vsv hiếu khí tổng số: bảng 2.4 trang 15
Môi trường vsv kị khí tổng số: bảng 2.5 trang 15
Môi trường xạ khuẩn tổng số: bảng 2.6 trang 15
Trang 93 Quy trình
3.1 Quy trình
Đếm số lượng vi khuẩn
Hút 0,1ml mẫu cấy trải trên môi trường NBRIP (National Botanical Research Institute of Phosphate
solubilizing bacteria)
Pha loãng mẫu thập
phân
Đồng nhất mẫu
Lấy mẫu đất
Giữ giống
Làm thuần bằng phương pháp cấy ria Định tính vsv có khả năng phân giải lân trên môi trường PVK (Pikovskaya’s)
Trang 103.2 Thuyết minh quy trình
3.2.1 Lấy mẫu đất
Vsv phân giải lân được lấy từ các mẫu đất, rễ cây trồng theo TCVN
7538-2005 Đất được nghiền nhỏ
3.2.2 Đồng nhất mẫu
Cân 1g đất pha trong 9ml nước muối sinh lý 0,9% vô trùng Hỗn hợp đã được pha loãng với nồng độ 10-1, lắc 10 phút để đồng nhất mẫu
3.2.3 Pha loãng mẫu thập phân
Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-6 theo TCVN 6168:2002
Chuẩn bị 5 ống chứa 9ml muối sinh lý 0,9% đã vô trùng
Pha loãng nồng độ 10-2: dùng 1ml từ ống ban đầu đã pha loãng 10-1 vào ống chứa 9ml nước muối Làm tiếp tục đến nồng độ pha loãng 10-5,10-6, 10-7,…
3.2.4 Đếm khuẩn lạc
Đem đĩa chứa môi trường NBRIP ủ ở 300C nuôi 2-3 ngày Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250
để tính toán kết quả Mật độ vi sinh vật phân giải lân tổng số được xác định theo công thức:
n 1Vf 1+n 2Vf 2+…+niVfi
Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn /1g mẫu
N: tổng số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại một độ pha loãng
Đánh giá hoạt tính phân
giải lân
Dùng làm các thử nghiệm để
định danh vsv
Đánh giá khả năng tổng hợp IAA
Trang 11V: thể tích dịch cấy vào petri
fi: độ pha loãng tương ứng Bên cạnh đó, vi sinh vật đã phân lập được đánh giá khả năng phân giải lân thông qua chỉ số phân giải khi nuôi cấy trên môi trường PVK2 ở 300C trong 7 ngày (Singh et al., 2013; Rani et al., 2013)
Công thức đánh giá khả năng phân giải lân thông qua vòng phân giải trên môi trường PVK:
3.2.5 Đánh giá hoạt tính phân giải lân của vsv
Chuẩn bị bình tam giác chứa 50ml môi trường NBRIP lỏng đã được khử trùng Cấy các chủng vi sinh vật đã phân lập được vào và ủ 5 ngày Sau đó lấy 1,5ml dịch nuôi cấy đem ly tâm ở 10000 rpm trong 10 phút Hút 1ml dịch phía trên bổ sung 0,2 ml (NH4)6Mo7O24 2,5% và SnCl2 2,5% làm phản ứng xanh molypdate rồi đo OD và xác định nồng độ PO43-
Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của vi sinh vật được đánh giá dựa trên nồng độ PO43-có trong dịch nuôi cấy Nồng độ PO43- càngcao chứng tỏ lượng phosphate khó tan phân giải càng nhiều
Nguyên tắc của phương pháp: nồng độ PO43-được xác định dựa trên
phương pháp xanh molypdatevới nguyên tắc là ion PO4 3- sẽ phản ứng với (NH4)2SO4 tạo ra phức chất (NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng Trong điều kiện acid và có ion Sn₂₊ phức màu vàng sẽ chuyển thành phức màu xanh
(NH4)3(4MoO2.2MoO3):
PO₄3- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O (NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2++16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại ở 690nm Sử dụng máy UV-VIS đo ở bước sóng 690nm để xác định độ hấp thụ màu của phức chất Độ hấp thụ càng lớn thì nồng độ ion PO4 càng cao
3.2.6 Đánh giá hoạt tính tổng hợp IAA
Vsv được nuôi trong 100ml môi trường NBRIP lỏng đã khử trùng chứa 1ml tryptophan 0,2% nuôi cấy trong 72h, lắc liên tục ở 300C Dịch được đưa vào ống ly tâm và ly tâm trong 10 phút 12000 rpm Lấy 1ml dịch nổi trong suốt
2 Phụ lục F trang 15
Trang 12được trộn với 4ml môi trường Salkowski ‘s (50ml HClO4 và 1 ml FeCl3 0,05M) Hỗn hợp được ủ trong tối 37°C trong vòng 30 phút
IAA tạo ra được xác định bằng phương pháp của Gutierrez et al., (2009)
Sự có mặt của IAA được xác định nếu môi trường chuyển sang màu đỏ sau khi thử với dung dịch Salkowski Định lượng tương đối IAA được xác định và phân tích bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 530 nm trên máy quang phổ với thuốc thử Salkowski
3.3 Lưu ý
Quy trình trên dành cho phân lập chủng vi sinh vật phân gỉai lân vô cơ trong môi trường NBRIP và PVK Khả năng phân giải lân được đánh giá dựa trên vòng trong suốt hình thành xung quanh khuẩn lạc
PVK và NBRIP có thành phần môi trường cơ bản giống nhau nhưng ở môi trường PVK chứa nhiều nguyên tố vi lượng hơn Ban đầu nuôi cấy trên môi trường NBRIP để chọn lọc các chủng vsv có khả năng sử dụng đạm như nguồn dinh dưỡng, sau đó nuôi cấy trong môi trường PVK để đấnh giá và so sánh hoạt tính phân giải lân thông qua vòng phân giải
Để phân lập các chủng vsv phân giải lân hữu cơ khó tan cần cấy trải, đếm
và đánh giá vòng phân giải trên môi trường có nguồn phosphate hữu cơ không tan là lecithine
4 Kết luận và một số giải pháp phát triển hệ vsv phân giải lân và nâng cao hiệu quả dinh dưỡng lân (tham khảo từ “ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HỆ
VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN TRONG ĐẤT PHÙ SA GLÂY TRỒNG LÚA TẠI MỘT SỐ XÃ THUỘC HUYỆN TIÊN LỮ, TỈNH HƯNG YÊN”)
Qua quá trình tìm hiểu và nghiên cứu tài liệu, chúng em rút ra các kết luận: Đất là môi trường thích hợp nhất đối với vi sinh vật, bởi vậy nó là nơi cư trú rộng rãi nhất của vi sinh vật, cả về thành phần cũng như số lượng so với các môi trường khác Sở dĩ như vậy vì trong đất nói chung và trong đất trồng trọt nói riêng có một khối lượng lớn chất hữu cơ Đó là nguồn thức ăn cho các nhóm vi sinh vật dị dưỡng, ví dụ như nhóm vi sinh vật phân hủy các hợp chất cacbon hữu cơ, nhóm vi sinh vật phân huỷ các hợp chất Nitơ hữu cơ Các chất vô cơ có trong đất cũng là nguồn dinh dưỡng cho các nhóm vi sinh vật tự dưỡng Đó là các nhóm phân huỷ các chất vô cơ, chuyển hoá các chất hợp chất
P, S, Fe, Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và pháp triển của hệ
vi sinh vật đất như: các biện pháp canh tác, tưới tiêu, bón phân, Vì vậy, để phát triển hệ sinh vật đất trong đó có vi sinh vật phân giải lân cần có các biện pháp canh tác phù hợp với tính chất và hệ vi sinh vật bản địa trong đất
- Cày bừa xới đất hoặc cày sâu
