enzyme pro

Trường Đại học Nha Trang Viện công nghệ sinh học và môi trường : Thu nhận enzyme Protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng trong chế biến nước tương Semina GVHD: TS.. Ngoài ra

Trường Đại học Nha Trang

Viện công nghệ sinh học và môi trường

: Thu nhận enzyme Protease từ nấm

mốc Aspergillus oryzae và ứng dụng

trong chế biến nước tương

Semina

GVHD: TS Vũ Ngọc BộiSVTH: 1 Lê Thị Vân

NỘI DUNG

dụng trong sản xuất nước tương

A Thu nhận enzyme Protease

I Tổng quan enzyme Protease

1.Giới thiệu chung

2.Phân loại protease

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este (bromelin) và vận chuyển amino acid

- Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid

1 Giới thiệu chung

Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử

Cấu trúc không gian của protease

các tiểu phần dưới đơn vị có

cấu trúc bậc 3 liên hợp lại bằng

các liên kết hydro, tương tác

tĩnh điện, tương tác kị nước …

Trung tâm hoạt động của protease

 Trung tâm hoạt động của

protease thường bao gồm một

tổ chức các nhóm định chức

của amino aicd không tham gia

tạo thành trục chính của sợi

polypeptide

Vd : nhóm – SH của Cys, -OH của

Ser, Tys, ε- NH2 của Lys,

-COOH của Asp,Glu, …

 Trung tâm hoạt động của

protease hai cấu tử bao gồm

các nhóm ngoại ( vitamin, ion,

kim loại)

II Quy trình thu nhận enzyme Protease

từ nấm mốc

1 Sơ lược về nấm mốc A.oryzae.

2 Quy trình thu nhận enzyme.

1.Sơ lược về nấm mốc A.oryzae

Phân loại: A.oryzae thuộc.

 Sinh sản bằng bào tử.

 Giàu enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào: amylase,

protease Có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside,

endo-β-1,4-glucanase

Nấm mốc A.oryzae

2 Quy trình thu nhận Protease

2.1 Phân lập chủng nấm A.oryzae

đất

 Nguồn phân lập thức ăn

trung tâm cung cấp nấm giống

phân lập trong điều kiện tự nhiên

Phương pháp phân lập trong điều kiện sản xuất

phân lập từ mẫu giống đã hỏng

Quy trình tạo mốc giống :

- Mẫu được say nhuyễn , thêm nước cất, pha loãng ở các nồng độ thích hợp và nhân giống chọn lọc trên môi trường tổng hợp: MT

Czapek bằng kĩ thuật cấy trang

- Giống sau khi phân lập sẽ được cấy truyền sang bình tam giác

Môi trường nuôi nấm :

.Cám, ngô đã xay nhỏ, có thêt bố sung thêm trấu cho xốp Độ dày khoảng 1- 2cm

Đem hấp chín, để nguội 30 - 35 C̊

Cấy truyền giống từ ống nghiệm sang bình tam giác và nuôi 36 – 48 giờ nhiệt 30 - 35 C̊

Giống nhân thành công có thể sử dụng ngay hoặc

đem đi bảo quản và dự trữ.

2.2 Lên men tạo Protease ( sử dụng phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn )

 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng

hợp enzyme của vi sinh vật, thành phần môi trường phải đảm bảo

đủ chất dinh dưỡng cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật

a Nguồn cacbon

 Thường là các hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu pà glucid, có

nhiều hợp chất là nguồn cacbon cho A oryzae sinh enzyme

protease có hoạt lực cao

Vd: đối với A oryzae sinh tổng hợp proteinase tác dụng của nguồn cơ

chất có thể theo thứ tự:

fructose→saccharose→maltose→ glucose → arabinose → glactose

b Nguồn nito

 Nguồn nito sử dụng bao gồm hai nhóm: nito vô cơ và nito hữu cơ

 Đối với A oryzae trên môi trường có chứa nguồn nito hữu cơ thì

khả năng sinh tổng hợp protease acid cao

 Môi trường bổ sung cả hai nguồn nito trên thì hoạt lực sinh enzyme tăng cao

Vd : môi trường có cám mì , bột đậu tương đã tách chất béo, có cả hai

nguồn nito khả năng sinh protease của A oryzae tăng 22-74%

c Nguồn nguyên tố khoáng và các chất khác.

 Muối khoáng rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của vi sinh vật và

sự sinh tổng hợp enzyme

Vd: ion Mg(2+) có tác dụng trong quá trình sinh tổng hợp và ổn định các

enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao

Quy trình:

1. Chuẩn bị môi trường làm mốc trên khay:

- Nguyên liệu chính được sử dụng là cám và ngô đã được xay

và bổ sung thêm trấu hoặc mạt cưa để tăng độ xốp giúp cho hệ sợi nấm phát triển tốt, tận dụng tối đa nguồn cơ chất

- Trộn với nước theo tỉ lệ 80 – 90 trọng lượng so với nguyên

liệu, sau khi trộn để khoảng 3-4 giờ cho ngô thấm đều nước, đem hấp khử trùng ( P=1-1,5 atm ở nhiệt độ 121°C trong 45-60 phút )

- Nguyên liệu sau khi hấp phải chín đều, độ ẩm còn lại 45-50%

là vừa

2. Trộn giống vi sinh vật :

- Nguyên liệu được rỡ ra và làm nguội nhanh đến khoảng 26 -

28°C thì tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường ủ

thành đống vài giờ

- Tỉ lệ giống đưa vào nuôi cấy thường vào khoảng 0,5 – 2% so

với khối lượng của môi trường hoặc cao hơn

3. Kĩ thuật nuôi cấy:

- Sau thời gian ủ bào tử đã nảy mầm nhưng chưa thành sợi

cần rải môi trường thành từng lớp mỏng 2- 3cm, và giữ cho nhiệt

độ không quá 36 độ C

- Đưa các khay vào phòng nuôi cấy đặt trên các giá đỡ được

thiết kế sao cho không khí được lưu thông thường xuyên

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sợi nấm phát triển là 28

-32°C

- Thời gian nuôi cấy khoảng 60 giờ, nếu bào tử hình thành

chậm thì có thể 70 – 72 giờ

 Các giai đoạn phát triển của nấm mốc:

- Gđ 1:

Sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc sữa

Khối môi trường còn rời rạc

Enzyme mới bắt đầu hình thành

- Gđ 2:

Kéo dài 14-18 giờ, toàn bộ bào tử đã phát triển thành hệ sợi

Môi trường kết chặt lại, độ ẩm giảm dần, nhiệt độ môi trường tăng nhanh, quá trình đồng hóa diễn ra mạnh, lượng cơ chất giảm nhiều

Enzyme protease được tổng hợp mạnh

- Gđ 3:

Kéo dài 10 – 20 giờ

Quá trình trao đổi chất yếu dần

Bào tử được hình thành nhiều lượng enzyme tao ra ít

-Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

 Độ ẩm của môi trường:

- Độ ẩm ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của nấm

mốc, thiếu nước thì các quá trình thủy phân cơ chất của môi trường

và sự sinh tổng hợp các hợp chất cần thiết không thể thực hiên

- Độ ẩm tốt nhất cho sự hình thành enzyme của A oryzae là 55– 60%

độ ẩm thích hợp cho sự hình thành bào tử là 45%

 Ảnh hưởng của không khí:

- A oryzae là vi sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình

thường khi có đầy đủ oxy Vì vậy môi trường phải xốp và thoáng khí

- Theo thực nghiệm trong quá trình nuôi cấy A oryzae cứ cách 1 giờ

môi trường cần 1,7 m3 không khí, nồng độ CO2 là 8%

 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy:

- Hầu hết các chủng A oryzae có cực đại sinh enzyme protease ở

giờ thứ 36 – 42 của quá trình nuôi cấy.Thời gian nuôi cấy để thu

được lượng protease cực đại thường được xác định bằng thục

nghiệm

- Thời gian nuôi cấy phải phù hợp tránh hiện tượng nấm sinh bào tử

vì nó thường làm giảm hoạt lực của enzyme, với A oryzae hoạt lực

sinh enzyme thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh bào tử

Nuôi cấy nấm mốc

2 vì ở giai đoạn này protease được tổng hợp

mạnh

Sang đến giai đoạn 3 thì lượng bào tử tạo ra nhiều, lượng enzyme tạo ra ít

 Sấy: để đảm bảo cho enzyme Protease không bị mất hoạt tính nhanh

 Độ ẩm sau khi kết thúc quá trình sấy: 10%

 Sấy ở nhiệt độ: 38oC – 40oC

 Sấy ở nhiệt độ 60oC – 70oC sẽ làm bất

hoạt enzyme protease của A.oryzae

Chế phẩm enzyme Protease thô gồm:

- Enzyme Protease và các loại enzyme khác

- Sinh khối tế bào nấm mốc, thành phần môi trường

- Nước có trong môi trường

Sấy:

Tinh sạch enzyme Protease

Nghiền nhỏ:

Mục đích:

- phá vỡ thành tế bào

- Làm nhỏ thành phần của chế phẩm enzyme thô

- Tạo điều kiện cho enzyme nội bào thoát ra ngoài

- Giúp các enzyme ngoại bào thoát ra khỏi thành phần tế bào

Kết tủa Protease

Dung dịch enzyme

thô

Kết tủa enzyme

Dùng tác nhân kết tủa là ethanol hoặc sunfat amon.

Tỉ lệ: 1 phần dd enzyme thô + 2-2,5 ethanol nồng độ 97%

3 Xác định hoạt đô của enzyme Protease

a Nguyên tắc chung:

đi hay lượng sản phẩm tạo thành của phản ứng trong một thời gian nhất định.

một thời gian

nhất định ứng

với [E]=const

Xác định thời gian cần thiết

để thu được lượng biến thiên nhất định của

cơ chất hay sản phẩm ứng với

[E]=const

Xác định [E] thích hợp để trong một thời gian không đổi thu được lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm

3 cách xác định

b Xác định hoạt độ Protease theo phương pháp Gross và Fuld

 Nguên tắc chung:

- Trong môi trường kiềm yếu casein hòa tan và bị kết tủa khi

thêm dung dịch acid acetic trong ethanol, nhưng sản phẩm thủy

phân của casein lại không bị kết tủa

- Một đơn vị hoạt độ là lượng enzyme của 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1mg casein ở 38 độ C trong thời gian 30 phút

- Mục đích là xác định lượng enzyme tối thiểu để phân giải 2mg casein đến mức không bị kết tủa trong điều kiên trên

 Hóa chất

- Chuẩn bị dung dịch casein 0,1% : 2 cách chuẩn bị

Cân 0,1g casein hòa tan trong100ml dung dịch cacbonat natri đun ấm cho đến khi hòa tan hết.

Cân 0,1g casein, trộn lẫn với 5ml dung dịch NaOH 0,1N, 25ml nước cất, đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn Làm lạnh dùng dung dịch HCl 0,1N điều chỉnh pH=8 thêm nước cất cho đủ 100ml.

- Dung dịch acid acetic 1% ( 1ml acid đặc hòa tan với 49ml nước cất và 50ml ethanol 90% )

- Dung dịch enzyme cần xác định hoạt độ: chế phẩm enzyme thu được: lấy 1g chế phẩm đem hòa tan trong 100ml nước cất và giữ ở 38 độ C, lấy ra 1ml để xác định hoạt độ.

 Tiến hành:

- Lấy 12 ống nghiệm đánh số thứ tự, cho vào các ống 1ml nước cất trừ ống số 1

- Cho vào ống số thứ nhất 2ml dịch enzyme

- Tiến hành pha loãng: lấy 1ml từ ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 và lần lượt lấy 1ml từ ống thứ 2 cho vào ống thứ 3, cho đến ống thứ

12, hút bỏ 1ml ở ống 12, tức là mỗi ống chứa 1ml dịch enzyme

- Cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dịch casein đã chuẩn bị ở trên, và giữ

ở 38°C trong khoảng 30 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá để

dừng xúc tác của enzyme

- Nhanh chóng nhỏ vài giọt acid acetic 1% trong cồn rồi xem kết quả

 Tính kết quả:

- Quan sát các ống nghiệm, tìm ra ống có kết tủa ít nhất

- Tính hệ số pha loãng của ống dựa vào số thứ tự của ống rồi sau đó tính ra hoạt độ của enzyme

- Từ số liệu này ta tính được số đơn vị có trong 1 gam chế phẩm theo phương pháp này

 Ưu điểm:

- phương pháp này đơn giản có thể sử dụng rộng rãi khi nghên cứu các loại chế phẩm khác nhau

 Ví dụ:

Mẫu ban đầu lấy là 1g chế phẩm hòa tan trong 100ml nước cất

Sau khi cho casein quan sát kết quả, giả sử ta thấy ở ống nghiệm thứ nhất đến ống nghiệm thứ 4 hoàn toàn không có kết tủa

→ kết luận rằng lượng enzyme trong ống thứ 4 là lượng enzyme tối thiểu có khả năng phân giải hòa toàn 1mg casein trong điều kiện tiêu chuẩn

Ở ống nghiệm thứ 4 dung dịch enzyme bị pha loãng 8 lần tương ứng với 0,125ml dung dịch ban đầu Nhu vậy 1ml dich ban đầu có có hoạt độ là : 2/0,125= 16

Vậy 1g chế phẩm enzyme ban đầu có hoạt độ là 1600 đơn vị

c Xác định hoạt độ của protease theo phương

 Hóa chất:

- Chuẩn bị dung dịch đệm: chuẩn bị dung dịch Na2HPO4 ( cân 11,876g hòa tan thành 1lit)) KH2PO4 ( cân 9,078g hòa tan thành 1 lit)

Đệm pH = 7,38 lấy 8 thể tích Na2HPO4 và 2 phần thẻ tích

KH2PO4

Đệm có pH= 4,49 lấy một thể tích Na2HPO4 và 8 thể tích

KH2PO4

- Dung dịch gelatin5%: cân 5g gelatin và làm trương với 15ml trong

15 phút Thêm 20-25ml dung dịch đệm có pH thích hợp đun tới

80độ C khuấy cho tan, rót vào bình định mức 100ml để nguội tới 20

độ thêm đệm vào cho đủ

- Dung dịch NaOH 0,1N

a, ao : số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu hoa trong thí

nghiệm trước và sau phản ứng enzyme

B Ứng dụng của Protease trong

sản xuất nước

tương

1 Giới thiệu về nước tương

Sự thủy phân protein là cơ sở của các phương pháp công nghệ chế biến nước tương

Công nghệ:

Bản chất của sự thủy phân protein là sự thủy phân liên kết peptide.

Do liên kết peptide là một liên kết mạnh, sự thủy phân xảy ra trong điều kiện có

xúc tác.

Tác nhân xúc tác hóa học là axit hoặc kiềm và tác nhân xúc tác hoá sinh học là

nhóm enzym thủy phân protein có tên chung là protease.

Có 3 phương pháp công nghệ: công nghệ vi sinh, công nghệ hóa học và công

nghệ enzym

Phương pháp công nghệ enzyme

Theo đề nghị của công ty Novo quy trình enzyme với 5 enzym được phối hợp

sử dụng gồm protease, cellulase, amylase Quy trình này có ưu điểm là điều kiện thủy phân ôn hòa, hoàn toàn không sử dụng hóa chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu, nhưng hiệu suất tối đa chỉ đat 70%.

Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên và bổ sung ưu điểm cho nhau, ta kết hợp thủy phân bằng axit với thủy phân bằng enzym

Việc sử dụng enzym protease kết hợp axit xúc tác quá trình thủy phân

có ưu điểm là giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất Có thể sản xuất trên

hệ thống thiết bị sẵn có

Công nghệ enzyme kết hợp axit

So sánh các phương pháp

Quy trình công nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men cải tiến

Nước muối 15-17%VSV gây mùi

sinh học

Sản xuất nước tương

- Mặc dầu so với phương pháp lên men bình thường diện tích mặt bàng dùng cho sản xuất vẫn ít hơn nhưng so với phương pháp hóa giải chúng vẫn cần nhiều hơn.

- Mùi vị nước tương vẫn là của mùi lên men nên ít được người tiêu dùng VN ưa chuộng.