MỘT SỐ LƯU Ý ĐỂ ĐẢM BẢO VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ

MỘT SỐ LƯU Ý ĐỂ ĐẢM BẢO VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ Nguyen Le Thanh MRes thanhnl@pnt.edu.vn 3 November 2018 BM HS-SHPT YH 1... Tầm soátChẩn đoán Tiên lượng Hướng đ

Trang 1

MỘT SỐ LƯU Ý ĐỂ ĐẢM BẢO VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM SINH

HỌC PHÂN TỬ

Nguyen Le Thanh (MRes) thanhnl@pnt.edu.vn

3 November 2018 BM HS-SHPT YH 1

Trang 2

1 GIỚI THIỆU CHUNG

Trang 3

– Tham khảo tài liệu (ISO?)

– Phải qua huấn luyện sử dụng máy móc

– Sai lầm loại 2 là kết quả nghiên cứu cho thấy không có mối quan

hệ giữa các yếu tố, nhưng thực tế thì có

Trang 4

3 Analysis

(Diagnostic tests)

4 Report & Diagnosis

Trang 6

(2) Xử lý bảo quản mẫu

• Tinh sạch loại bỏ tạp chất

• Di chuyển vận chuyển

• Chất chống đông?

Trang 7

Tầm soát

Chẩn đoán Tiên lượng

Hướng điều trị Theo dõi

Ví dụ

XN

SHPT

Kiểm tra dấu hiệu

xơ nang

Định tính hoặc định type HPV

Nhiễm

vi khuẩn lao

Phân loại ung thư vú vào các phân nhóm

sử dụng

(OncoType

Dx hay Mamma Print)

Xác định tình trạng đột biến gen như KRAS, BRAF, và Her2

Định lượng (đo tải lượng) siêu vi viêm gan C

Trang 8

• Định lượng tuyệt đối

• Real-time PCR Đường tiêu chuẩn

• Định lượng tương đối

• Real-time PCR gen tham chiếu

• Nghiên cứu di truyền học

• Giải trình tự DNA

Trang 10

(3) PP Phân tích: Đối chứng

• Nhóm kiểm tra và nhóm chứng:

– Nhóm kiểm tra: Xem phản ứng khi có thay đổi

– Nhóm chứng: Không tạo thay đổi

Trang 11

– Độ nhạy = số dương tính thật/(số dương tính thật + số âm tính giả)

– Độ nhạy 100% có ý nghĩa như thế nào?

– Độ nhạy cao ảnh hưởng gì đến sai lầm của XN?

• Độ đặc hiệu?

– Độ đặc hiệu của một xét nghiệm là tỷ lệ những trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp không bị bệnh

– Độ đặc hiệu = Số trường hợp âm tính thật/ (số trường hợp âm tính thật + số trường hợp dương tính giả)

– Độ đặc hiệu 100% có ý nghĩa như thế nào?

– Độ đặc hiệu cao ảnh hưởng gì đến sai lầm của XN?

Trang 12

Ví dụ:

Dùng PCR để phát hiện Mycobacterium tuberculosis trong máu bệnh nhân

• Đoạn trình tự IS1081 đặc thù cho Mtb

Trang 13

Ví dụ:

Dùng PCR để phát hiện Mycobacterium tuberculosis trong máu bệnh nhân

• Đoạn trình tự IS1081 đặc thù cho Mtb

• Primer có sẵn

• Thiết kế phản ứng PCR

Mẫu kiểm tra DNA từ máu bệnh nhân

Chứng dương Mẫu DNA Mtb

Chứng âm Nước, không DNA

khuôn

Trang 14

(+) (-)

Mẫu 1 Mẫu 2

Trang 15

Trang 16

Trang 17

Điện di

(-) (+)

• Chứng dương: thang DNA/RNA (marker/ladder)

• Chứng âm: nước

• Để làm gì?

3 November 2018

Trang 18

Xét Nghiệm:

Chạy điện di PCR của 01 mẫu máu để phát hiện trình tự 419kb

IS6110 của M tuberculosis

Trang 19

Xét Nghiệm:

Chạy điện di PCR của 01 mẫu máu để phát hiện trình tự 419kb

IS6110 của M tuberculosis

Thang

(+)

(-) PCR

Trang 20

Trường hợp 1: Không có band

Trang 21

Trường hợp 2:

Có thang, nước (chứng âm điện di) hoạt động/Không có band

H2O

Trang 22

Trường hợp 3

H2O (+)

Trang 23

Trường hợp 4

H2O

Trang 24

Trường hợp 5

H2O

Trang 25

Trường hợp 6

H2O

Trang 26

Ý chính

• Hạn chế ngoại nhiễm, nội nhiễm

• Hạn chế, kiểm soát, kiểm tra đối chiếu hiện

tượng dương giả âm giả

Trang 27

(4) Tổng hợp kết quả và đưa ra phân

tích chẩn đoán

• Kỹ thuật phân tích? Cần phải chú ý những gì?

• Tham khảo:

(a) Độ xác thực (b) Độ chính xác (c) Đường tuyến tính (d) Chất gây cản trở (e) Độ nhạy phân tích (f) Độ đặc hiệu phân tích (g) Giới hạn phát hiện (h) Giới hạn đo

Trang 28

tích chẩn đoán

• Xác nhận phân tích có mục tiêu là xác định

được sự hiện diện hay không và nguyên

nhân/nguồn gốc (nếu có) cho những sai sót

kỹ thuật có thể xảy ra khi phân tích mẫu bệnh phẩm

Trang 29

Trang 30

Trang 31

2 MỘT SỐ XÉT NGHIỆM SHPT

Trang 32

2a PHẢN ỨNG ENDPOINT PCR

Trang 33

Điều kiện thí nghiệm

• Môi trường XN, hóa chất và dụng cụ XN: vô trùng, không có nuclease, v.v…

• Thiết kế primer phù hợp:

– Tham khảo primer (bài báo)

– Thiết kế primer (Primer Blast NCBI)

Trang 34

Trang 35

Trang 36

Chuỗi trình tự gene mà mình muốn khuếch đại

Trang 37

2B REAL – TIME PCR

Trang 38

MIQE Guidelines

http://clinchem.aaccjnls.org/content/55/4/611.long

Trang 39

QLCL Dữ liệu

i Phát hiện những khuếch đại lỗi

ii Kiểm tra Melting Curve

iii Kiểm soát những mẫu lặp lại

iv Kiểm tra chứng âm chứng dương

v Quyết định độ ổn định của gene tham chiếu

(reference gene)

vi Đánh giá những yếu tố tiêu chuẩn (standardization

factors)

Trang 40

Biểu đồ khuếch đại

Samples that contain inhibitors may be detected by comparing the amplifcation plots across all samples for a given assay, provided that the degree of inhibition is suffciently large to result in a noticeable effect on the amplifcation plot This comparison may be done visually

by looking for plots that are less steep, and often result in lower plateau phase levels

Trang 41

Melting curve

Trang 42

Mẫu lặp lại và các đối chứng

• NTC: Non-template control

– Chứng không có khuôn

– Rất quan trọng trong việc kiểm soát nhiễm

– Tại sao?

• No amplifcation controls (NAC)

– NAC contains all reaction components and the template (gDNA or cDNA), except for the polymerase An amplifcation signal indicates auto-ﬂuorescence of the

probe, which may be attributed to probe degradation.

• Internal amplifcation controls (IAC)

– An IAC serves to exclude false-negative results due to inhibition by substances

originating from the sample or due to other ﬂaws during the qPCR reaction

Trang 43

Mẫu lặp lại và các đối chứng

• Mẫu lặp lại là gì?

• Tại sao phải có mẫu lặp lại?

• Nhận biết mẫu lặp lại lỗi

• Cách xử lý mẫu lặp lại lỗi

– Loại trừ?

– Giữ lại nhưng xử lý lỗi di truyền để kết quả cuối

cùng thể hiện đúng sự yếu kém của dữ liệu

Trang 44

Gene tham chiếu

• Gene tham chiếu cần

hoặc nhiều gene tham

chiếu giữa các thí nghiệm

Trang 45

2c PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Trang 46

Southern Blotting

• Cần lưu ý:

– Mẫu DNA

• Kỹ thuật tách chiết DNA

• Đo nồng độ, pha loãng hợp lý trước khi điện di

• Chọn lọc restriction enzyme hợp lý

– Màng gel

• Đảm bảo màng không bị hư hại

• Thiết lập chế độ chạy điện di, không quá nhanh

Trang 47

Không thấy band Không đủ chất nhuộm (EthBr) Nhuộm lại gel

Thấy thang nhưng

không thấy DNA

mẫu

Không đủ lượng DNA hay là DNA chất lượng kém

Thử nghiệm lượng và chất của DNA bằng cách chạy thử 1ug DNA không cắt

Nền có chấm Bột từ găng tay Sử dụng găng tay không bột Band mờ (1) Ít DNA (2) Thời gian

chuyển hóa hoặc thời gian lai quá ít (3) Nhiệt độ lai quá gắt

(1) Tăng lượng DNA (2) Tăng thời gian lai và chuyển hóa (3) Giảm nhiệt độ lai

Trang 49

Một phản ứng FISH thành công cần có

• Chất lượng mẫu

• Hiệu suất lai

• Các bước rửa sau phản ứng lai

• Phát hiện kháng thể

Trang 50

2d GIẢI TRÌNH TỰ

Trang 51

Trước khi bắt đầu TN

• Chất và lượng của DNA khuôn

• Các chất ứng chế?

• Các hóa chất phản ứng?

• Primer design có thích hợp?

Trang 52

Trang 53

Trang 54

Trang 55

Trang 56

Ý chính

• XNSHPT: DNA, primer

• Quá trình chuẩn bị mẫu và xử lý các chất ức chế

quyết định mức độ thành công của phản ứng

• Mẫu lặp lại

• Các đối chứng

Trang 57

3 NỘI KIỂM TRA & NGOẠI KIỂM TRA

Trang 58

Đối tượng

• Các phòng TN XN SHPT

• Nội KT (Internal Quality Control – IQC)

• Ngoại KT (External Quality Assessment – EQA)

Trang 59

NỘI KT

• Các XN: đảm bảo tiêu chuẩn, hiệu suất, và các thông số khác cho nhu cầu xác định phân tích

• Hiệu chuẩn: hóa chất thiết bị tần suất

• Các quy trình thực hiện các xét nghiệm được xem xét và thông qua (Standard Operation

Procedure – SOP)

Trang 61

THANK YOU

THE END

Định dạng
Số trang	61
Dung lượng	2,55 MB