Thực tập hóa sinh cơ bản

Thực tập hóa sinh: 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐEXTRIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA VỚI CỒN 2. ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CANXI PECTAT 3. ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZO 4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 5. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND 6. ĐỊNH LƯỢNG SACCAROZO THEO PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN BẰNG AXIT

Bài 1: ĐỊNH LƯỢNG ĐEXTRIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

KẾT TỦA VỚI CỒN1.1 Mục đích, yêu cầu:

- Mục đích: giúp sinh viên nắm được phương pháp định lượng ddexxtrin bằng

X: % đextrin trong mẫu

a : khối lượng của giấy lọc và kết tủa sau khi sấy (gam)

b : khối lượng giấy lọc (gam)

V : thể tích định mức (ml)

V1: thể tích lấy xác định (ml)W: khối lượng mẫu phân tích (gam)

- Căn 5g mẫu cho vào cốc Cho thêm 50ml nước cất Khuấy kĩ cho tan

- Lọc qua giấy lọc và cho vào bình định mức Rửa vài lần bằng nước cất địnhmức đến vạch lắc đều

- Dùng pipet lấy 100ml dung dịch trong bình định mức cho vào cốc Thêm từ từvào cốc 30ml cồn tuyệt đối, lắc đều Để yên cốc khoảng 30 phút cho kết tủa đextrinmàu trắng lắng xuống

- Lọc lấy kết tủa qua 2 lớp giấy lọc ( đã biết khối lượng ) Rửa kết tủa vài lầnbằng cồn tuyệt đối Sấy giáy lọc có chứa kêt tủa ở 1050C đến khi có khối lượng khôngđổi

- Hàm lượng % đextrin trong mẫu là hiệu số giữa giấy lọc có chứa đextrin vàgiấy lọc không chứa đextrin

1.5 Kết quả, nhận xét

Qua thí nghiệm ta thu được kết quả như sau:

a = 0.578g, b = 0.532g, w = 5g, V = 250ml, V1 = 100ml

Bài 2 ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CANXI

PECTAT

2.1 Mục đích, yêu cầu:

1 Mục đích: Giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc và thao tác tiến hành định

lượng pectin theo phương pháp canxi pectat

2 Yêu cầu: phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất thí nghiệm, trong lúc tiến hành thí

nghiệm các thao tác phải nhẹ nhàng cẩn thận

Trong đó: W: khối lượng của pectin lấy để pha thành dung dịch (gam)

V1: thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml)

V2: thể tích dung dịch pectin lấy để xà phòng hóa (ml)

Hàm lượng canxi pectat bằng hiệu của khối lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọckhông có kết tủa

Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau:

P =

Trong đó: W: khối lượng kết tủa canxi pectat (g)

B : Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g)

0,92: hệ số tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa làpectin chiếm 92% khối lượng canxi pectat)

100: Hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo phần %

2.3 Hóa chất dụng cụ

Hóa chất:

- Dung dịch axit axetic ( CH3COOH) 1N: Pha loãng 60,03ml axit axetic đặcbằng nước cất cho tới 1000ml.

Dụng cụ: bình tam giác, pipet, bình định mức, giấy lọc, bếp điện, xoong…

2.4 Tiến hành

1 Cho 0,15g pectin mẫu nghiên cứu vào bình

2 Cho thêm 100ml NaOH 1N

3 Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectinthành axit pectic

4 Thêm 50ml dung dịch axit axetic 0,1N

5 Sau 5 phút thêm 50ml CaCl2 2N giữ 1 giờ

6 Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tan đã được sấy khô tới khốilượng không đổi

7 Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clonữa ( thử rửa với dung dịch bạc nitrat 1% không có kết tủa trắng)

8 Sau khi rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy khô ở 1050Ccho tới khối lượng không đổi

Trong đó: W: khối lượng của pectin lấy để pha thành dung dịch (gam)

V1: thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml)

V2: thể tích dung dịch pectin lấy để xà phòng hóa (ml)

Áp dụng công thức trên ta có: B = 0.15*100/200 = 0.075g

Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau:

P =

Trong đó: W: khối lượng kết tủa canxi pectat (g)

B : Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g)

0,92: hệ số tính chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa làpectin chiếm 92% khối lượng canxi pectat)

100: Hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo phần %

P = 0.012*0.92*100/0.075 = 14.72 %

- Nhận xét: Qua kết quả thí nghiệm ta thấy hàm lượng pectin trong quả bí đỏtương đối cao (14.72%) Qua bài này giúp sinh viên nắm được phương pháp xác đinhhàm lương pectin trong mẫu, rèn luyện kỹ năng thí nghiệm.

Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZO

3.1 Mục đích, yêu cầu:

- Mục địch: giúp sinh nắm được phương pháp định lượng xenlulozo

- Yêu cầu: chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ thí nghiệm, các thao tác phải cẩn thận

nhẹ nhành

3.2.Nguyên tắc:

Phương pháp định lượng xenlulozo dựa vào tính chất của nó trong một hợp chấtbền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụngcủa acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm với xenlulozo như hemiluloza,lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa, phân giải và tan

ra khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc hỗn hợp acid nitric với acid axetic

Hàm lượng xenlulozo được tính bằng công thức sau:

X =

Trong đó: X - hàm lượng xenlulozo tính bằng %

a - khối lượng xenlulozo (gam)

W - khối lượng mẫu thí nghiệm (gam)

100 - hệ số chuyển thành %

2 Hóa chất, dụng cụ

- Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc (d=1,4)

- Dung dịch acid axetic (CH3COOH) đặc

- Rượu etylic 96%

3.3 Tiến hành

- Cân 0,5-1g mẫu đã nghiền nhỏ(sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ100-1050C), cho vào bình nón dung tích 250ml Nếu hàm lượng xenlulozo trong mẫukhoảng 10-20% thì cân 1,5-2g, hàm lượng khoảng 40-50% thì cân 1-1,5g, nhỏ hơn10% cân 2,5-5g

- Thêm vào 16,5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc và 1,5ml acid axetic đặc.lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút Để nguội pha loãnghỗn hợp bằng nước nong Lọc qua giấy lọc đã biết trước khối lượng

- Rửa kết tủa xenlulozo nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10-15ml)

- Rửa bằng rượu etylic (96%) 1-2 lần

- Rửa bằng ete etylic

- Sấy giấy lọc có chứa xenlulozo ở nhiệt độ 100-1050C đến khối lượng khôngđổi Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với xenlulozo thường còn lạimột lượng nhỏ hemixenlulozo, chủ yếu là các pentozo và lignon v.v Do đó xenlulozoxác định được gọi là xenlulozo “thô”

3.4 Kết quả nhận xét

Qua thí nghiệm ta được kết quả như sau: w = 1g (khối lượng mẫu), a = 0.021g.Dựa vào công thức trên ta có:

X = a*100/W = 0.021*100/1 = 2.1%

- Nhận xét: Qua kết quả thí nghiệm ta thấy hàm lượng xenlulozo trong quả bí

đỏ tương đối cao đạt 2.1% Kết quả này có thể chưa chính xác vì trong quá trình thínghiệm có thể có nhiều sai sót, song qua thí nghiệm này giúp sinh viên nắm phươngpháp xác định hàm lương xenlulozo trong mẫu

BÀI 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

4.1.Mục đích yêu cầu

- Mục đích: Giúp sinh viên nắm được phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn

protein và phương pháp xác định hàm lượng potein trong mẫu

- Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, trong quá trình tiến hành thí nghiệm

phải cẩn thận

4.2 Nguyên tắc

Dựa vào phản ứng màu giữa protein với thuốc thử Folin Do trong môi trườngkiềm với sự có mặt của một lượng nhỏ Cu2+ protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh.Cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có trong mẫu (cónghĩa là hàm lượng protein trong mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm) Sau đó dùngmáy so màu để xây dựng đồ thị chuẩn, và thông qua đồ thị chuẩn ta tính được hàmlượng protein có trong mẫu

+ Dung dịch Na2CO3 2% tan trong NaOH 0.1N (dung dịch A)

+ Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1)

+ Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2)

+ Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B1, 0.5ml dung dịch B2 và 50ml dungdịch A (dung dịch C chuẩn bị trước khi dùng 30 phút)

+ Thuốc thử Folin 0.5N Chú ý thuốc thử Folin được đựng trong chai màu vàbảo quản lạnh, thuốc thử này có màu vàng, khi dùng nếu thấy có màu xanh thì cho vàigiọt brom đun trong 15 phút thì sẽ có màu vàng trở lại và dùng được

4.4 Tiến hành thí nghiệm

4.4.1 Cách xây dựng đồ thị chuẩn protein

- Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân chính xác 1g albumin hòa tan trongnước cất và định mức đến 100ml

- Chuẩn bị dãy gồm 6 ống nghiệm khô sạch, sau đó cho vào các ống nghiệmnhững chất như bảng sau:

Hàm lượng

Albumin(µg/ml) 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4

OD 0.175 0.29 0.40 0.515 0.623

Sử dụng phần mềm oringin 6.0 xây dựng đồ thị chuẩn protein:

Linear Regression for Data1_B:

-Đồ thị chuẩn protein

4.4.2 Tiến hành xác định hàm protein trong mẫu

Trước hết ta phải chiết mẫu bằng cách cân 1g mỗi mỗi loại rồi nghiền trong cáccối sứ được làm lạnh với dung dịch đệm phosphat 0.1N Sau đó dùng đệm phosphatđịnh mức đến 250ml, như vậy mẫu đã được pha loãng 250 lần Sau đó chia mẫu vàocác ống ly tâm và đem ly tâm trên máy li tâm ở 6000 vòng trong thời gian 15 phút.Sau khi ly tâm ta thu phần dịch trong cho vào lọ và bảo quản lạnh để thực hiện các thínghiệm tiếp theo

- Sau khi chuẩn bị xong dịch chiết ta chuẩn bị dãy 4 ống nghiệm khô sách Mộtống nghiệm chứa mẫu trắng đối chứng, còn ba ống chứa mẫu

- Ta cho vào ống mẫu trắng 1ml nước cất và 4ml dung dịch C, tương tự các ốngkhác ta cho vào mỗi ống 1ml mẫu và 4ml dung dịch C, để yên trong 10 phút sau đócho vào mỗi ống 0.5ml dung dịch Folin lắc đều để yên trong 30 phút Sau đó đem somàu ở bước sóng 620nm, mẫu trắng dùng để chuẩn máy so màu

Mẫu TN Bí đỏ Thanh tràHàm lượng

Bài 5: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP

BERTRAND5.1 Mục đích, yêu cầu:

- Múc đích: giúp sinh viên nắm được phương pháp định lượng đường khử bằng

phương pháp Bertrand, nắm được bản chất của phản ứng oxy hóa khử

- yêu cầu: chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ, tiến hành thí nghiệm đúng nguyêntắc

5.2 Nguyên tắc:

Khi đun sôi dung dịch kiềm của Cu++ với dung dịch đường sẽ tạo thành kết tủa

Cu2O, sau khi rửa bằng nước, hào tan kết tủa Cu2O bằng dung dịch Fe2(SO4 )3 , Cu++

sẽ chuyển thành Cu+ và Fe3+ sẽ chuyển thành Fe2+

Chuẩn độ Fe2+ bằng dung dung dịch KMnO4 0,1N; biết lượng KMnO4 đã dùng đểchuẩn độ tính ra lượng đồng Từ lượng đồng ấy đối chiếu trong bảng sẽ biết đượclượng đường tương ứng

Tóm tắt quá trình định lượng đường khử theo sơ đồ sau:

- Phản ứng đường khử Cu++ tahnhf Cu+ (Cu2O) – phản ứng Felling

- Phản ứng hòa tan kết tủa đồng oxit (Cu2O)

Cu2O + Fe2(SO4 )3 + H2SO4 2 CuSO4 + FeSO4 + H2O

- Phản ứng chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N

10 Fe2(SO4 )3 + 2 KMnO4 + H2SO4 5 FeSO4 + K2SO4 + 2 MnSO4 + 8 H2O

5.3 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

4.3.1 Nguyên liệu: Bí ngô

3 lần, dùng nước cất tráng lại cối chày sứ, chuyển dịch chiết sang bình định mức100ml và dùng nước cất dẫn dung dịch đến mức của bình

Lọc dịch chiết qua phểu lọc có giấy lọc hoặc bông, được dịch chiết trong để xácđịnh đường khử trong dung dịch

5.4.2 Phản ứng Fehling: Cho vào bình nón 5ml dung dịch dã lọc và 20ml dungdịch Fehling, đậy bình bằng một phểu nhỏ sau đó đun sôi và theo dõi Khi thấy bọt khíđầu tiên xuất hiện thì bấm đồng hồ tính thời gian Đun đúng 3 phút kể từ khi xuất khibắt đầu xuất hiện bọt khí đầu tiên và kết tủa đỏ gạch, kết tủa lắng xuống đáy bình.5.4.3 Rửa kết tủa Cu2O: Quá trình rửa tủa được thực hiện trên phểu lọc Bucne gắnliền với máy hút chân không

- Dồn tủa về một phía dưới của bình nón, chiếc từ từ dung dịch Fehling qua phểulọc Bucne, cẩn thận giữ tủa Cu2O ở trong bình nón luôn ngập trong dung dịch để

Cu2O không tiếp xúc với O2 không khí tạo thành CuO Mở máy lọc chân không chodung dịch Fehling được hút nhanh xuống bình Bucne, giữ lại một lớp dung dịch bêntrên giấy lọc để bảo vệ tủa Cu2O trên bề mặt giấy Sau đó cho từ từ 20ml nước cấtnóng theo thành bình nón để tủa không bị vẩn, lắc nhẹ sao cho tủa Cu2O luôn ngậptrong nước nóng Chiết nước rửa tủa tương tưh như chiết dung dich Fehling Quá trìnhrửa tủa được lặp lại 3 lần, dùng giấy quỳ kiển tra nước rửa khi không còn phản ứngkiềm thì kết thúc quá trình rủa tủa

5.4.4 Hòa tan kết tủa Cu2O: Đặt phểu lọc lên bình nón, cho vào phểu 15ml dungdịch Fe2(SO4 )3 để cho chảy từ từ xuống bình lắc nhẹ để rửa tủa Cu2O được hòa tanhoàn toàn Quan sát xem tủa trong bình và trong phểu đã tan hết chưa, nếu chưa tanhết thì cần phải thêm 3-5ml Fe2(SO4 )3 để hào tan tủa Cu2O Dùng nước cất nóng để rửaphểu lọc cho đến khi nước rủa không còn phản ứng acid trên giấy quỳ thì kết thúc quátrình hòa tan kết tủa

5.4.5 Chuẩn độ bằng KMnO4 0,1N: Chuẩn độ dung dịch trong bình (Fe++) bằngdung dịch KMnO4 0,1N đến khi vừa xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây thì kết thúcquá trình chuẩn độ

5.5 Tính kết quả:

Hàm lượng đường khử tính theo công thức:

X = a*V1*100/V*W*1000

X: hàm lượng đường khử tính theo %

a- số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số ml KMnO4 0.1N dùng để chuẩn

độ mẫu thí nghiệm trừ đi số ml KMnO4 dùng để chuẩn độ mẫu đối chứng

V- dung tích bình định mức

V1- lượng dung dịch lấy để xác định đường khử

W-lượng mẫu thín nghiệm (g)

Bài 6 ĐỊNH LƯỢNG SACCAROZO THEO PHƯƠNG PHÁP

THỦY PHÂN BẰNG AXIT

6.1 Mở đầu

Trong nhiều loại rau,củ, quả… các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khálớn saccarozơ cùng với đường khử Saccarozơ không có tính khử nên không thể trựctiếp xác định được bằng phương pháp Bertrand Để có thể xác định được saccarozơphương pháp này phải thủy phân saccarozơ thành các đường khử ( glucozơ vàfructozơ )

6.2 Nguyên tắc

Khi thủy phân dung dịch saccarozơ bằng axit ta thu được hỗn hợp hai đườngkhử là glucozơ và fructozơ Định lượng đường khử tạo thành cho phép tính đượclượng saccarozơ có trong mẩu thí nghiệm

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

(saccarozơ) (glucozơ) (fructozơ)

Hàm lượng saccarozơ của mẩu thí nghiệm tính theo công thức :

X = (a + b)*0.95

Trong đó : X- hàm lượng saccarozơ tính bằng %

a- hàm lượng đường khử theo glucozơ của dung dịch đường sau khi thủy phânbằng axit(%)

b - hàm lượng đường khử của dung dịch đường (trước khi thủy phân ) (%),0.95- hệ số chuyển từ glucozơ sang saccarozơ

6.3 Hóa chất dụng cụ

Hóa chất:

- Dung dịch HCl 5%

- Dung dịch NaOH 5%hoặc dung dịch Na2CO3 bảo hòa

- Metyl đỏ 2% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất )

Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo Bertrand

bằng dung dịch Na2SO3 bão hòa Để yên 10 phút, cho nước cất vào đến vạch địnhmức, lọc qua giấy lọc thu dịch lọc làm thí nghiệm.

- Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xácđịnh đường khử như phần trên vào bình nón 250ml

- Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%

- Đun cách thủy hổn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30-40 phút, làmnguội nhanh

- Trung hòa hổn hợp bằng dung dịch Na2CO3 bảo hòa đến Ph 6,5-7 với chỉ thịmetyl đỏ (3 giọt)

- Thêm từng giọt kiềm vào cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

- Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand

- Chú ý : khi xác định saccarozỏ là các dịch chiết bằng nước có thể khết quả sẽ

bị sai khác, bởi vì trong một số polisaccarit cao phân tử khác củng chuyển vàodung dịch chiết một phần hay hoàn toàn Trong quá trình thủy phân những chấtnày cũng tạo thành các monosaccarit Do đó, có thể chiết đường bằng cồn saocho nồng độ của cồn trong dung dịch đạt 75-80%

Bài 7 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA CATALAZA

7.1 Mục đích yêu cầu

- Mục đích: Giúp sinh viên nắm vững phương pháp xác định hoạt độ catalaza.

- Yêu cầu: nắm vững lý thuyết về hoạt độ của catalaza, nắm vững nguyên tắc tiến

b: số ml dung dịch KMnO4 0,1N dùng để chuẩn độ ở bình thí nghiệm

f: hệ số chỉnh lý của dung dịch KMnO4 0,1 (f = 1)

1,7: số mg H2O2 tương ứng với 1ml KMnO4 0,1N

W: khối lượng nguyên liệu mẫu (g)

+ Bình định mức,pipet, bình tam giác

+ Bếp điện, xoong, giấy lọc, buret…

7.4 Tiến hành thí nghiệm

Cách lấy mẫu thí nghiệm:

Tiến hành: cân mỗi loại 1g đem nghiền nhỏ trong cối sứ với bột thủy tinh và 0,3gCaCO3, sau đó cho thêm 20ml nước cất, nghiền lại cẩn thận tạo thành dịch đồng thể,cho vào bình đinh mức 50ml và dẫn nước đến vạch định mức Lắc đều hỗn hợp,sau 30phút đem lọc hoặc li tâm

Lấy hai bình nón 100ml, cho vào mỗi bính 20ml dịch lọc Đun sôi bình kiểm tra

2-3 phút (làm mất hoạt động của enzyme), làm nguội bình Thêm vào mỗi bình 20mlnước cất và 3ml dung dịch H2O2 1%, để ở nhiệt độ phòng 30 phút, cho thêm 4ml