Nghiên cứu ảnh hưởng của acid citric, acid acetic, acid lactic đến hiệu quả khử khoáng và một số tính chất cơ bản của collagen trong qui trình thu nhận collagen bằng phương pháp hóa

LỜI MỞ ĐẦU 1Tính cấp thiết của đề tài: Collagen là một polyme với bản chất là protein dạng sợi chiếm tới 25% tổng lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường đại học Nha Trang, Khoa Chế biến, phòng thực hành công nghệ chế biến, phòng thực hành hóa sinh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hỗ trợ cho em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Anh Tuấn và Ths Trần Thị Huyền

đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt và động viên tinh thần cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài

Cũng qua đây, em muốn cảm ơn gia đình em, các anh chị cùng Khoa, các bạn cùng lớp luôn luôn chia sẻ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và làm đề tài

Xin chân thành cảm ơn !

Nha Trang, tháng 6 năm 2011

Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thúy Kiều

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số loài trong giống cá Tra (Pagasius) ở Việt Nam (Mai Đình Yến và

các ctv, 1992) 4

Bảng 1.5: Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá Tra đến ngày 24/01/2011 9

Bảng 1.6: Thành phần hóa học của da cá 11

Bảng 1.7: Dạng cấu trúc phân tử của một số loại Collagen 13

Bảng 1.8: Các ứng dụng y học của Collagen 22

Bảng 3.1: Thành phần hóa học cơ bản của da cá Tra ban đầu .40

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Hình dạng bên ngoài của cá Tra……… 3

Hình 1.2 : Hình ảnh cấu trúc của Collagen……… 12

Hình 2.1: Nguyên liệu da cá Tra 27

2.3.1 Sơ đồ Quy trình nghiên cứu tổng quát……… 30

2.3.2.Sơ đồ Quy trình nghiên cứu……… 32

2.3.4.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 34

2.3.5.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian xứ lý các loại axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 36

2.3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ xử lý các loại axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 38

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit đến hiệu quả khử khoáng 41

Hình3.2:Ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit đến nhiệt độ biến tính của collagen……… 42

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit đến khả năng giữ nước của Collagen 43

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý các loại Axit đến hiệu suất khử khoáng… 45

Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian xử lý các loại Axit đến khả năng giữ nước của collagen……… 46

Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian xử lý các loại Axit đến nhiệt độ biến tính của collagen……… 47

Hình 3.7: Ảnh hưởng của tỷ lệ(w/v) các loại Axit đến hiệu suất khử khoáng… 48

Hình 3.8: Ảnh hưởng của tỷ lệ (w/v) các loại Axit đến khả năng giữ nước của collagen 49

Hình 3.9: Ảnh hưởng của tỷ lệ (w/v) các loại Axit đến nhiệt độ biến tính của collagen……… 50

Hình 3.10: Ảnh hưởng của việc không khử khoáng bằng axit đến nhiệt độ biến tính của collagen……… … 51

Hình 3.11 : Hàm lượng Collagen trong sản phẩm Collagen……….… … 51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐBSCL : Đồng bằng song Cửu Long

CTV : Cộng tác viên

NN-PTNT : Nông nghiệp và phát triển nông thôn

VASEP : Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam TNHH : Trách nhiệm hữu hạn

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU……… ….1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… … 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ TRA VÀ DA CÁ TRA……… 3

1.1.1.Tìm hiểu chung về cá Tra……… 3

1.1.2 Nguồn lợi cá Tra ……… 8

1.1.3 Sản lượng nuôi và thị trường xuất khẩu cá Tra ở Việt Nam… 8

1.1.4.Nguyên liệu da cá Tra 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN……… 11

1.2.1.Định nghĩa Collagen ……… 11

1.2.2.Cấu tạo và cấu trúc……… 12

1.2.3 Phân loại……… 15

1.2.4.Tính chất của collagen……… 16

1.2.5.Những tính chất khác của Collagen……… 19

1.2.6.Ứng dụng của Collagen……… …… 19

1.2.7.Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước……… 22

1.3 NHỮNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA COLLAGEN 24

1.3.1 Tủa bằng muối……… 24

1.3.2 Tủa bằng ion kim loại……… 25

1.3.3 Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện……… 25

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… … … 27

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.1.1 Da cá Tra……… 27

2.1.2 Hóa chất……… 27

2.1.3 Thiết bị sử dụng để làm thí nghiệm……… 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 29

2.2.1.Phương pháp……… 29

2.2.2 Phương pháp phân tích……… 29

2.2.3.Phương pháp xử lý số liệu……… 29

2.3 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM……… 30

2.3.1 Sơ đồ Quy trình nghiên cứu ……… 30

2.3.2.Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát……… 32

2.3.3.Phương pháp thu và xử lý mẫu……… 33

2.3.4.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 34

2.3.5.Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian xứ lý các loại axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 36

2.3.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỷ lệ xử lý các loại axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của collagen……… 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN…… 40

3.1.THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA DA CÁ TRA……… … 40

3.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ AXIT CHO DA CÁ 41

3.2.1 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của nồng độ các loại Axit đến hiệu quả xử lý da cá Tra và một số tính chất của Collagen……… 41

3.2.2 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của thời gian xử lý các loại Axit đến hiệu quả xử lý da cá Tra và một số tính chất của collagen……… 45

3.2.3 Kết quả thăm dò ảnh hưởng của tỷ lệ (w/v) các loại Axit đến hiệu quả xử lý và một số tính chất của da cá Tra……… 48

3.2.4 Kết quả thăm dò hiệu quả xử lý và một số tính chất của sản phẩm Collagen không qua khử khoáng bằng axit……… 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN……… 53

I KẾT LUẬN ……… 53

II ĐỀ XUẤT Ý KIẾN……… 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 55 PHỤ LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

1)Tính cấp thiết của đề tài:

Collagen là một polyme với bản chất là protein dạng sợi chiếm tới 25% tổng lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau [6][31] Hiện nay Collagen được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thuộc da, mỹ phẩm, phẫu thuật… cũng như các ứng dụng khác trong ngành công nghệ sinh học Trong ngành mỹ phẩm, Collagen được sử dụng như một chất chống lão hóa và tái tạo

da rất hiệu quả Trong y học, nhờ tính chất tái tạo cấu trúc mô, Collagen được sử dụng rộng rãi để sản xuất da nhân tạo thay thế cho phần da chết, điều trị sau phẫu thuật chỉnh hình…[31]

Theo Hiệp hội Chế biến & Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, các doanh nghiệp này có khả năng tiêu thụ khoảng 4.000 tấn nguyên liệu/ngày Nguồn nguyên liệu này hầu hết chỉ được chế biến chủ yếu để xuất khẩu với các dạng sản phẩm là cá Tra fillet đông lạnh Trong quy trình sản xuất cá Tra fillet đông lạnh thì phụ phẩm trong đó có da cá chiếm tới 70% khối lượng nguyên liệu và nó được bán với giá rất rẻ Trên thế giới hiện nay Collagen được mua với giá 25–30USD/kg, trong khi cá Tra fillet đông lạnh được bán cao nhất cũng chỉ 3,5–4 USD/kg, còn các mặt hàng khác được xuất khẩu với giá chỉ 2 -2,5USD/kg, và da cá tươi có giá chưa tới 0,5 USD/kg.[20]

Trên thế giới đã có một số quy trình sản xuất Collagen từ các loại da khác nhau như

cá cod, catfish, da chuột, xương da và mô của trâu bò và lợn… góp phần mang lại lợi ích kinh tế rất lớn Ở nước ta hiện nay các doanh nghiệp vẫn chưa có hướng giải quyết phù hợp

mà chỉ dừng lại ở việc xuất khẩu nguồn nguyên liệu da thô cho các công ty nước ngoài chế biến tiếp Mặc dù ở Việt Nam, các nghiên cứu và triển khai sản xuất gelatin đã được một số doanh nghiệp áp dụng nhưng thực tế cho thấy vẫn còn nhiều bất cập [34] Xuất phát từ những vấn đề trên, việc nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Collagen từ da cá Tra nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng của nguồn nguyên liệu này là rất cần thiết Như vậy đề tài

“Nghiên cứu ảnh hưởng của acid Citric, acid Acetic, acid Lactic đến hiệu quả khử khoáng

và một số tính chất cơ bản (khả năng giữ nước, nhiệt độ biến tính, hàm lượng

hydroxyproline )của collagen trong qui trình thu nhận collagen bằng phương pháp hóa học” được thực hiện nhằm tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo để sản xuất Collagen

từ da cá Tra có chất lượng tốt, hiệu suất cao Đề tài hoàn thành sẽ có ý nghĩa cả về mặt khoa học và thực tiễn, đáp ứng sự mong đợi của các doanh nghiệp, các nhà quản lý kinh tế

2) Mục tiêu của đề tài là: Nghiên cứu ảnh hưởng của acid Citric, acid Acetic, acid Lactic đến hiệu quả khử khoáng và một số tính chất (khả năng giữ nước, nhiệt độ biến tính, hàm lượng hydroxyproline )của collagen trong qui trình thu nhận collagen bằng phương pháp hóa học từ da cá tra

3) Ý nghĩa khoa học của đề tài:

- Tạo ra dẫn liệu khoa học làm tài liệu tham khảo tốt cho cán bộ giảng dạy sinh viên, các nhà nghiên cứu và các nhà chế biến thủy sản

- Tạo ra các số liệu làm nền cho các nghiên cứu tiếp theo về sản xuất và nghiên cứu ứng dụng Collagen

4) Ý nghĩa thực tiễn của đề tài :

- Giúp các doanh nghiệp có tài liệu tham khảo để sản xuất ra các sản phẩm có giá trị cao hơn về da cá, tăng thêm lợi nhuận thay vì sản xuất da thô

5) Đồ án có nội dung bao gồm:

- Xác định ảnh hưởng của các axit trong công đoạn khử khoáng của qui trình thu nhận collagen từ da cá tra

- Phân tích một số tính chất đặc trưng của sản phẩm collagen

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÁ TRA VÀ DA CÁ TRA

1.1.1.Tìm hiểu chung về cá Tra [22][3]

1.1.1.1 Cá Tra là loại cá da trơn, một trong 11 loài thuộc họ cá Tra (Pangasiidae) đã

được xác định ở sông Cửu long Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả W.Rainboth xếp

cá Tra nằm trong giống cá Tra dầu

Cá Tra thuộc lớp cá Lưỡng Tiêm (Pisces)

Bộ cá Nheo Siluriformes

Họ cá Tra Pangasiidae

Giống cá Tra dầu Pangasianodon

Loài cá Tra Pangasianodon hypophthalmus

Hình 1.1: Hình dạng bên ngoài của cá Tra

Bảng 1.1: Một số loài trong giống cá Tra (Pagasius) ở Việt Nam (Mai Đình Yến và

các ctv, 1992) [27]

Các loài trong giống cá Tra Việt Nam

Thu hoạch quanh năm Thông thường một vụ nuôi kéo dài khoảng 6-8 tháng, nếu thả

cá nhỏ thì thời gian thu hoạch dài hơn (khoảng 10-12 tháng) Khi thu hoạch dùng lưới, đăng, rùng, vó để bắt cá, sau cùng tát cạn thu toàn bộ

d Đặc điểm sinh lý và sinh dưỡng[22][3]

Cá có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, có 2 đuôi râu dài Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (10 - 14 %

độ muối), có thể chịu đựng được nước phèn với pH≥4 (pH dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị sốc), ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nóng tới 390C

Cá trong tự nhiên, có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18kg hoặc có mẫu dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 tuổi Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 - 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt 5 - 6 kg/năm

e Đặc điểm sinh sản[22][3]

Tuổi thành thục: Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái ở tuổi thứ 3 trở lên Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp), nên nhìn hình dáng ngoài khó phân biệt đực - cái Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 (dương lịch) Ở Campuchia, bãi đẻ của cá nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê Kông và Tonlesap,

từ Sombor, tỉnh Crache trở lên Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (tháng3) Cá Tra có thể tái phát dục 1 - 2 lần trong năm Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá ta gọi là sức sinh sản tuyệt đối Sức sinh sản tuyệt đối của cá Tra có thể từ 200.000 đến vài triệu trứng

1.1.1.2.Thành phần khối lượng và hóa học cá Tra [3]

1 Thành phần khối lượng

Thành phần khối lượng là tỷ lệ phần trăm về khối lượng của các phần trong cơ thể so với toàn bộ cơ thể của nguyên liệu Thành phần này thay đổi tùy theo giống, loài, tuổi, giới tính, thời tiết khu vực, sinh lý, mức độ trưởng thành về sinh dục Đối với những loài cá nhỏ nếu nội tạng không có phần nào tận dụng chế biến được hoặc trọng lượng quá bé thì ta gộp toàn bộ nội tạng thành một phần, có khi chỉ chia thành phần khối lượng một cách đơn giản là phần ăn được và phần ăn không ăn được Cơ thể cá càng lớn thì tỷ lệ ăn được càng cao

Bảng 1.2: Thành phần khối lượng cá Tra kích cỡ 1-1,5kg [3]

Tổng khối

lượng (%)

Đầu + nội tạng+xương, vây (%)

Mỡ lá (%) Thịt vụn (%) Da (%) Thịt sau khi

chỉnh hình (%)

Từ bảng 1.2 ta thấy thành phần phần trăm về khối lượng của da cá Tra có hàm lượng thấp hơn so với các thành phần khác trong cá Tra như đầu, nội tạng, xương vây, mỡ lá, thịt vụn nhưng da có khả năng sử dụng để sản xuất các chế phẩm có giá trị như Collagen, gelatin…

2 Thành phần hóa học [27]

Thành phần hóa học của các loài thủy sản gồm: nước, protein, lipid, muối vô cơ, vitamin Các thành phần này khác nhau rất nhiều, thay đổi phụ thuộc vào giống, loài, giới tính, điều kiện sinh sống Ngoài ra, các yếu tố như thành phần thức ăn, môi trường sống, kích cỡ cá và các đặc tính di truyền cũng ảnh hưởng đến thành phần hóa học, đặc biệt là ở cá nuôi Các yếu tố này có thể kiểm soát được trong chừng mực nào đó

Thành phần hóa học của các bộ phận của cá phụ thuộc vào đặc điểm sinh sống, giống loài, mùa vụ… Ngoài thành phần thịt cá là thành phần chính tạo nên giá trị của cá thì các thành phần khác như trứng, gan cũng có giá trị về dinh dưỡng rất cao Ngoài ra, da cá cũng

là một thành phần được chú ý để sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng

vụ, thời tiết khí hậu, nguồn thức ăn, trạng thái sinh lý của cá Thành phần hóa học ảnh hưởng rất lớn đến giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm [1]

Thành phần hóa học của cá Tra được trình bày cụ thể ở bảng dưới đây:

Bảng 1.4: Thành phần hóa học cơ bản của cá Tra [27]

Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được Tổng năng lượng

cung cấp (calori)

Chất đạm (g)

Tổng lượng chất béo (g)

Chất béo chưa bão hòa (có DHA, EPA) (g)

Cholesterol (%)

Natri (mg)

Từ bảng 1.4 ta thấy cá Tra là một loài cá béo có hàm lượng dinh dưỡng tương đối cao, cụ thể như tổng năng lượng cung cấp là 124,520 (calori); trong đó hàm lượng protein chiếm tỷ trọng chủ yếu (23,420g), hàm lượng lipid với 3,420g và chất béo không bão hòa chiếm tỷ lệ cao hơn chất béo bão hòa Vì vậy thịt cá Tra dễ tiêu hóa Tuy hàm lượng chất béo cao nhưng hàm lượng cholesterol lại thấp (0,025%) Do đó thịt cá Tra dùng làm thực phẩm đảm bảo rất tốt cho người sử dụng

 Khoáng

Chất khoáng của cá phân bố chủ yếu trong mô xương, đặc biệt trong xương sống Canxi và phospho là 2 nguyên tố chiếm nhiều nhất trong xương cá Thịt cá là nguồn giàu sắt, đồng, lưu huỳnh và iôt Ngoài ra còn có niken, coban, chì, asen, kẽm

- Hàm lượng chất sắt trong thịt cá nhiều hơn động vật trên cạn, cá biển nhiều hơn cá nước ngọt, cơ thịt cá màu sẫm nhiều hơn thịt cá màu trắng

- Sunfua (S) có phổ biến trong thịt các loài hải sản, chiếm khoảng 1% chất khô của thịt Sunfua trong thịt cá phần lớn tồn tại ở dạng hợp chất hữu cơ sunfua hòa tan Hàm lượng sunfua nhiều hay ít có ảnh hưởng lớn đến màu sắc của sản phẩm

- Hàm lượng đồng trong cá ít hơn so với động vật thủy sản không xương sống

- Hàm lượng iod trong thịt cá ít hơn so với động vật hải sản không xương sống Cá biển có hàm lượng iod cao hơn cá nước ngọt Hàm lượng iod của động vật hải sản nói chung nhiều gấp 10 - 50 lần so với động vật trên cạn Thịt cá có nhiều mỡ thì hàm lượng iod có xu hướng tăng lên.[22]

1.1.2 Nguồn lợi cá Tra [22]

Cá Tra phân bố ở một số nước Ðông Nam Á như Campuchia, Thái Lan, Indonexia và Việt Nam Ðây là một trong những loài cá nuôi quan trọng có giá trị kinh tế Cá Tra được nuôi phổ biến hầu hết ở các nước Ðông Nam Á, là một trong 6 loài cá nuôi quan trọng nhất của khu vực này Bốn nước trong hạ lưu sông Mê kông đã có nghề nuôi cá Tra truyền thống

là Thái lan, Campuchia, Lào và Việt Nam do có nguồn cá Tra tự nhiên phong phú Ở Campuchia, tỷ lệ cá Tra thả nuôi chiếm 98% trong 3 loài thuộc họ cá Tra, chỉ có 2% là cá ba

sa và cá vồ đém, sản lượng cá Tra nuôi chiếm một nửa tổng sản lượng các loài cá nuôi Một

số nước trong khu vực như Thái Lan, Malaysia, Indonesia đã nuôi cá Tra có hiệu quả từ những thập niên 70-80 [22]

Hiện nay nuôi cá Tra đã phát triển ở nhiều địa phương, không chỉ ở Nam bộ mà một số nơi ở miền Trung và miền Bắc cũng bắt đầu quan tâm nuôi các đối tượng này Ðồng bằng sông Cửu Long ( ĐBSCL) và các tỉnh Nam bộ mỗi năm cho sản lượng cá tra nuôi hàng trăm ngàn tấn ÐBSCL có hơn 50% số tỉnh nuôi cá bè, nhưng tập trung nhất là hai tỉnh An Giang

và Ðồng Tháp, với hơn 60% số bè nuôi và có năm đã chiếm tới 76% sản lượng nuôi cá bè của toàn vùng [22]

Nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá Tra được bắt đầu từ năm 1978 Từ năm 1996, Ðaị học Cần Thơ, Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II, công ty Agifish An Giang đã nghiên cứu nuôi vỗ thành thục cá bố mẹ và cho đẻ nhân tạo cá basa, cá Tra thành công, chủ động giải quyết con giống cho nghề nuôi cá này[22]

1.1.3 Sản lượng nuôi và thị trường xuất khẩu cá Tra ở Việt Nam [28][36][30]

Thứ trưởng Bộ NN&PTNT Vũ Văn Tám, Phó ban Chỉ đạo sản xuất và tiêu thụ cá tra vùng ĐBSCL nhận định: Năm 2010, tình hình sản xuất, tiêu thụ cá tra ở vùng ĐBSCL có nhiều biến động không có lợi cho ngành nuôi cá tra Việt Nam Dù vậy, tổng sản lượng sản xuất cá tra giống toàn vùng đạt gần 2,4 tỉ con; diện tích thả nuôi 5.420 ha; năng suất trung bình đạt 261,2 tấn/ha/vụ; sản lượng cá thu hoạch 1,141 triệu tấn; sản lượng cá xuất khẩu đạt 645.000 tấn; kim ngạch xuất khẩu đạt 1,39 tỉ USD, giảm 2,8% về lượng, 7,8% về kim ngạch

xuất khẩu so cùng kỳ năm 2009 [28]

Bảng 1.5: Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá Tra đến ngày 24/01/2011 [36]

STT Địa phương Diện tích thả nuôi năm

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam, trong 2 tháng đầu năm

2011, xuất khẩu cá tra vào Braxin đã tăng 694% về khối lượng và 790% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái, cho dù Braxin đang ra sức thắt chặt nhập khẩu cá tra bằng các biện pháp

bảo hộ như áp thuế nhập khẩu cao, kéo dài thời gian cấp giấy phép nhập khẩu tới 120 ngày, gây tốn kém cho các doanh nghiệp xuất khẩu.[37]

Nhìn chung với thế mạnh và hiệu quả của nghề nuôi cá Tra, 10 năm qua, từ một loài

cá bản địa, cá Tra đã trở thành sản phẩm chiến lược quốc gia, sản lượng nuôi tăng gấp 65 lần, đóng góp khoảng 2% GDP của cả nước; chiếm hơn 1/2 tổng sản lượng thuỷ sản xuất khẩu cả nước Thị trường tiêu thụ cá Tra đã được mở rộng và có uy tín ở 130 nước và vùng lãnh thổ Một số nước, khu vực nhập khẩu lớn là Ucraina, Nga, EU, Bắc Phi, Trung Đông,

Mỹ Nhóm sản phẩm cá Tra càng quan trọng bởi chỉ sử dụng một diện tích rất nhỏ bé để nuôi (khoảng 6.000 ha mặt nước, bằng 1% diện tích nuôi tôm), có năng lực cạnh tranh trên thị trường quốc tế, tạo việc làm cho hàng chục vạn công nhân, nông ngư dân, góp phần chuyển dịch cơ cấu kinh tế, nhất là ở vùng nông thôn ĐBSCL[29]

1.1.4.Nguyên liệu da cá Tra [28][20][27]

Trong quy trình sản xuất cá Tra fillet đông lạnh xuất khẩu, lượng phế phẩm, phụ phẩm chiếm trên dưới 70% nguyên liệu, được bán với giá rất rẻ Ước tính 700.000 tấn cá Tra

sẽ loại ra được 100.000 tấn mỡ và khoảng 50.00070.000 tấn phế liệu da và xương Như vậy, có thể nói rằng nguồn nguyên liệu da cá rất dồi dào Kết quả cho thấy Collagen từ da cá Tra đạt những tiêu chuẩn không thua kém từ các nguồn nguyên liệu khác [28]

Hiện nước ta có khoảng 168 doanh nghiệp xuất khẩu cá Tra, cá basa Các doanh nghiệp này có khả năng tiêu thụ khoảng 4.000 tấn nguyên liệu/ngày Với tỷ lệ này, hằng ngày các nhà máy chế biến thủy sản thải ra môi trường một lượng rất lớn phụ phế phẩm gồm đầu, xương, mỡ, da cá,…Theo ước tính của VASEP (2006), nếu sản lượng cá Tra nguyên liệu đạt 1 triệu tấn trong năm, thì các nhà máy chế biến thủy sản sẽ phải loại bỏ hơn 600.000 tấn phế phẩm cá Tra Do đó, việc gia tăng giá trị sử dụng nguồn phế liệu này trở thành một yêu cầu cấp thiết nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng của nguyên liệu, tăng thu nhập cho nhà sản xuất và giảm tác động xấu đến môi trường, chi phí xử lý chất thải [20]

Da cá là một trong những loại nguyên liệu còn lại chiếm tỷ trọng khá cao, khoảng 4,8 đến 5,1% tùy thuộc vào hình thức nuôi và kích cỡ cá khi thu hoạch Nếu như mỗi ngày các doanh nghiệp chế biến các sản phẩm cá Tra ở Việt Nam tiêu thụ khoảng 4.000 tấn nguyên

liệu thì cũng đồng nghĩa với việc họ loại ra khoảng 192 đến 204 tấn da cá Tra Cho đến nay, hình thức xử lý lượng da cá Tra này mới chỉ dừng lại ở việc một phần rất nhỏ đem chế biến thành thực phẩm như bánh phồng, da cá tẩm gia vị, một phần nhỏ lẻ khác sản xuất Gelatin, còn hầu hết phần lớn lượng da cá này được xuất khẩu đông lạnh với giá thành rất rẻ

Thành phần hóa học của da cá nói chung thường bao gồm khoảng 60-70% là nước, một ít chất vô cơ, còn lại là protein và chất béo Protein của da cá chủ yếu là Collagen, elastin, keratin, rutin, globulin, và albulmin

1.2 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN

1.2.1.Định nghĩa Collagen [12]

Collagen là một loại protein kiến tạo chống đỡ cơ học đảm bảo độ bền và tính mềm dẻo của mô liên kết

Collagen là protein chính của mô nối động vật và là protein dồi dào nhất ở những

động vật có vú, chiếm khoảng 25% tới 35% toàn bộ lượng protein trong cơ thể Collagen tạo

nên 1% tới 2% của mô cơ, và chiếm 6% về trọng lượng của gân, xương, dây chằng, sụn và răng trong cơ thể

1.2.2.Cấu tạo và cấu trúc

a Công thức hoá học: C4H6N2O3R2.(C7H9N2O2R)n [26]

- Công thức cấu tạo:

- Cấu trúc phân tử Collagen:[38][39]

Hình 1.2 : Hình ảnh cấu trúc của Collagen

a) Cấu trúc của Collagen; b) Cấu trúc của xoắn bộ ba Các nhà nghiên cứu bao gồm Nobel, Watson và Crick, Linus Pauling đã biết được cấu trúc Collagen khi nó mới được phát hiện Vào năm 1954, cấu trúc xoắn gốc bộ 3 trong nghiên cứu của GN.Ramachandran được xem như đúng và hợp lý, theo kết quả nghiên cứu của ông thì một sợi Collagen là một bó các sợi lớn Mỗi sợi lớn lại là một bó gồm nhiều sợi nhỏ Sợi nhỏ lại bao gồm nhiều xoắn bộ ba Mỗi xoắn này là tập hợp của 3 mạch polypeptid bện lại với nhau, được gọi là đơn vị cấu trúc của Collagen.[5]

Đơn vị cấu trúc của phân tử Collagen được gọi là tropocollagen là một dải dài 300nm

và có đường kính 1,5nm, tạo thành bởi 3 mạch polypeptid mà mỗi mạch có thể là dạng chuỗi anpha 1 (α1) hoặc chuỗi anpha 2 (α2), có khi có cả chuỗi anpha 3 (α3) Mỗi mạch polypeptid

có dạng xoắn ốc từ bên trái, không bị xáo trộn với mỗi xoắn anpha từ bên phải Một mạch polypeptid chứa chính xác 1050 amino acid [24][39]

Một số tổng kết về cấu trúc các loại Collagen như sau:

Bảng 1.7: Dạng cấu trúc phân tử của một số loại Collagen [14]

Ba chuỗi xoắn ốc được cuộn cùng nhau chiều thuận tay phải, "đường xoắn ốc đặc biệt" hoặc đường xoắn ốc bộ ba, một cấu trúc bậc bốn được ổn định bởi nhiều liên kết hyđrô

Một đặc điểm đặc trưng của Collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino axit trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc Collagen này Thông thường các chuỗi theo mẫu sau:

Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây X và Y là các axit amin còn lại Mỗi acid amin có một chức năng riêng biệt Proline hoặc hydroxyproline tạo nên khoảng 1/6 tổng số chuỗi.[39]

Glycine chiếm 1/3 số chuỗi, điều này có nghĩa là khoảng nửa chuỗi Collagen không chứa glycine, proline hoặc hydroxyproline trong các chuỗi peptit Collagen anfa Mặt bên của Glycine, có một nguyên tử H duy nhất khớp với trung tâm dày đặc cuả xoắn 3 thành phần Hydro trong liên kết NH của Glycine còn lại với một nhóm CO- trong mạch peptid trong polypeptid liền kề giúp giữ vững 3 mạch với nhau Góc hợp bởi C và N trong vòng peptidyl của Proline hoặc Hydroxyproline cho phép mỗi mạch polypeptid tạo nếp gấp trong một đường xoắn với một cấu trúc hình học như là các mạch polypeptid có thể xoắn lại với nhau tạo nên một xoắn 3 thành phần Điều đặc biệt là mặc dù liên kết không linh động peptidyl-proline phá vỡ sự xếp kín của các acid amin trong một xoắn anpha, nhưng chúng lại làm ổn định vòng xoắn Collagen 3 thành phần [38]

[40]

Sự phân bố đều đặn với hàm lượng glycine cao được tìm thấy ở một số ít loại protein dạng sợi, như sợi tơ tằm Chiếm 75- 80 % của tơ tằm là : Gly - Ala – Gly- Ala với 10% serine

Các phân đoạn ngắn ở phía cuối của mạch Collagen là phần rất quan trọng trong việc tạo thành các sợi Collagen Các phân đoạn này không mang thể cấu tạo dạng xoắn ốc và không chứa các acid amin thông thường như hydroxylysine Các liên kết ngang aldol cùng hoá trị tạo nên giữa 2 lysine hoặc hydroxylysine còn lại tại cabon C cuối cùng của phân tử Collagen với 2 phần còn lại tại vị trí Nitơ N cuối cùng của một phân tử liền kề Các liên kết

ngang này làm ổn định mạch bên của mạch thành phần trong các phân tử Collagen và sinh ra sợi chắc khoẻ Hay nói cách khác, các phân tử Collagen loại sợi (I, II, III) gồm tập hợp các sợi nhỏ, sợi này được ổn định cầu liên kết bởi gốc aldol cùng hoá trị [12]

Các sợi Collagen tạo nên bởi sự tương tác mạch bên của các xoắn bậc ba Hầu hết phân tử Collagen loại I có 3 thành phần bện sát lại với nhau tạo nên các sợi nhỏ với đường kính 50-200nm Trong các sợi nhỏ, phân tử Collagen liền kề được thay thế bởi một phân tử khác có đường kính 67nm, chiếm khoảng ¼ chiều dài của chúng Sự xắp xếp xen kẽ này tạo

ra một hiệu ứng có nếp nhăn của các sợi nhỏ Collagen đổi màu mà có thể được nhìn thấy trong kính hiển vi điện tử; đoạn mẫu đặc trưng này của dải được lặp lại cứ 67nm một lần [24]

Các sợi Collagen loại I có sức bền chịu căng rất lớn- đây là loại Collagen có thể bị kéo căng, vuốt dài ra mà không bị đứt Các sợi này có đường kính sấp xỉ 50nm và chiều dài khoảng vài micromet, chúng được tập hợp cạnh nhau trong các bó song song Các sợi Collagen trong gân liên kết với các bắp thịt và với xương nên bắt buộc chúng phải chịu được một lực khổng lồ Có thể ví Collagen loại I cứng hơn thép [24]

1.2.3 Phân loại [39][12]

Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể Đã có 29 loại Collagen được tìm thấy

và thông báo trong các tài liệu khoa học

Trên 90% Collagen trong cơ thể là dạng I, II, III và IV

Collagen I: có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương

Collagen II: có trong sụn xương (thành phần chính của sụn)

Collagen III:có trong bắp cơ, tìm thấy bên cạnh Collagen I

Collagen IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào[39]

Các sợi Collagen loại I có sức bền, chịu căng rất lớn, có thể bị kéo căng, vuốt dài ra mà không bị đứt Các sợi này có đường kính xấp xỉ 50nm và chiều dài khoảng vài micromet, chúng được tập hợp cạnh nhau trong các bó song song Các sợi Collagen trong gân liên kết

với các bắp thịt và với xương nên bắt buộc chúng phải chịu được một lực mạnh Có thể ví Collagen loại I cứng hơn thép [12]

1.2.4.Tính chất của collagen [13][25][22][9][14]

a Khối lượng phân tử của Collagen

Các Collagen sản xuất từ nguyên liệu khác nhau thì có khối lượng phân tử khác nhau tùy thuộc vào cấu trúc phân tử của nó Khối lượng phân tử của Collagen được đo bằng phương pháp SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide electrophoresis) dựa trên cơ sở của phương pháp Laemmli (1970) Qua các tài liệu tham khảo được, tác giả nhận thấy khối lượng phân tử Collagen dao động trong khoảng 14 đến 200 kDa Sự khác nhau này

do cấu trúc sắp xếp trên mạch phân tử Collagen [13][25]

b Tính chất bền của Collagen [13][22][25][14]

Nhiệt độ biến tính của các Collagen sản xuất từ nguyên liệu khác nhau là rất khác nhau Hầu hết các Collagen có nhiệt độ biến tính nằm trong khoảng 16-35oC Collagen sản xuất từ các phụ phẩm thủy sản có nhiệt độ biến tính thấp hơn hẳn so với Collagen sản xuất

từ động vật trên cạn Ví như, Collagen từ da mực có nhiệt độ biến tính 27.1oC trong khi nhiệt độ biến tính của Collagen từ gân bò lên đến 36oC Collagen từ phụ phẩm của thủy sản sống ở vùng nước lạnh có nhiệt độ biến tính thấp hơn Cụ thể, Collagen từ da cá Minh thái Alaska chỉ là 16.8oC [13][22][25]

Collagen trơ với hầu hết các enzym proteaza Vì vậy hiện nay các phương pháp thu nhận Collagen chủ yếu vẫn là phương pháp hóa học hoặc một số lại kết hợp phương pháp hóa học và sinh học [9][14]

Collagen không hòa tan trong nước nhưng nó hút nước và trương nở làm tăng thể tích nguyên liệu, làm giảm độ bền liên kết trong phân tử Collagen Khi hút nước chuỗi cực tính của Collagen bị ion hóa nhẹ do tác dụng lực giữa các phân tử (lực Vandervasl) [5]

Cơ chế quá trình hút nước của Collagen như sau: [5]

Do nước là phân tử phân cực tác dụng lên liên kết hydro, làm cho mạch vốn có trong kết cấu protein bị suy yếu đi Collagen kết hợp với nước và trương nở làm cho độ dày tăng dần lên khoảng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử Collagen tăng lên độ 2÷3 lần [5]

Khả năng giữ nước của Collagen sản xuất từ phụ phẩm thủy sản lớn hơn rất nhiều so với Collagen sản xuất từ phụ phẩm của động vật trên cạn [5][6]

e.Sự tương tác của Collagen với acid và kiềm

Collagen là chất lưỡng tính, nó có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch bên của phân tử Collagen tồn tại gốc cacboxyl và gốc amin

Trong điều kiện có acid, ion H + của acid tác dụng với nhóm COO-, điện tích cacboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp), ngược lại gốc amin bị ion hóa thành –NH 3+

Trong điều kiện có kiềm mạnh thì ngược lại gốc amin bị ức chế

Ngoài ra acid, kiềm có thể làm cho Collagen biến đổi như sau:

 Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa NH 3+…COO - ) làm đứt mạch peptid trong mạch chính

 Acid amin bị phân hủy giải phóng amoniac

 Điểm đẳng điện của Collagen hạ thấp xuống

f.Tính kháng nguyên [10][31]

Tính chất này cần được quan tâm khi ứng dụng Collagen trong ngành y học Hầu hết các nghiên cứu chỉ ra rằng tất cả các loại Collagen đều không có hoặc có tính kháng nguyên rất thấp [10] Khi sử dụng Collagen từ động vật cho cơ thể người thì Collagen đóng vai trò là kháng nguyên - là những phân tử lạ, thường là protein khi xâm nhập vào cơ thể chủ thì có khả năng kích thích cơ thể chủ sinh ra các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống lại chúng Tính kháng nguyên của Collagen là khả năng kết hợp một cách đặc hiệu của Collagen với các sản phẩm cuối cùng của các đáp ứng miễn dịch Nếu Collagen không có hoặc có tính kháng nguyên rất thấp thì việc thu nạp Collagen của động vật vào cơ thể người làm tác nhân thúc đẩy tế bào biểu mô sinh ra Collagen sẽ trở nên dễ dàng hơn Điều này mở ra những nghiên cứu ứng dụng Collagen vào y học phong phú hơn [31]

1.2.5.Những tính chất khác của Collagen [5][6]

Collagen có các gốc (-COOH) và gốc (-NH2 ) trong phân tử do vậy khi ở trong dung dịch muối trung tính, các hợp chất muối được tạo thành Tác dụng phân giải Collagen bởi NaCl mạnh hơn so với Na2SO2 do khả năng điện ly của NaCl lớn hơn [5][6]

Tác dụng phân giải Collagen của enzym pepsin mạnh hơn so với enzym tripsin Điều kiện thích hợp của nó là pH từ 1,651,70, nhiệt độ là 37 0 C Thực nghiệm cho thấy rằng: Tác dụng của enzym tripsin đối với Collagen tự nhiên rất nhỏ, nhưng đối với Collagen đã qua xử lý như (đun nóng, ngâm trong acid, kiềm, muối, xử lý cơ học…) thì nó có tác dụng phân giải khá mạnh, đặc biệt trong điều kiện thích hợp pH từ 8,18,2, nhiệt độ là 37 0 C [5]

1.2.6.Ứng dụng của Collagen [39]

Collagen là một loại protein chiếm tới 25%-35% tổng protein trong cơ thể của động vật có vú Collagen là protein cấu trúc quan trọng trong cơ thể động vật (đặc biệt là da và xương) Dựa trên vai trò cấu trúc và tính phù hợp với cơ thể của Collagen, nên nó dược sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp, thực phẩm, y học và dược phẩm đặc biệt sử dụng làm chất hỗ trợ chức năng của thuốc Hơn nữa, Collagen được sử dụng rất phổ biến trong công nghệ sản xuất các sản phẩm mỹ phẩm dạng lỏng nhờ vào khả năng giữ nước của nó Ngày nay, có nhiều nghiên cứu trong việc sử dụng Collagen như một thực phẩm chức năng

mà phổ biến nhất ở các nước Đông Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc Chúng được

sử dụng để bôi hoặc uống, các sản phẩm Collagen sử dụng trong công nghiệp hiện nay chủ yếu được chiết từ da, xương của bò và heo Tuy nhiên, với lý do tâm lý và bệnh bò điên nên chúng được sử dụng rất hạn chế Người ta đã chứng minh được rằng Collagen chiết từ da bò điên có thể gây hại cho da của phụ nữ sử dụng sản phẩm có chứa nguồn Collagen này Do vậy, Collagen từ da cá là một hướng tiếp cận tiềm năng bởi những ứng dụng và tính an toàn của nó.[39]

1.2.6.1.Ứng dụng trong ngành thực phẩm[9][29]

Khi Collagen được thủy phân đủ ta thu được một loại protein dễ tan trong nước gọi là gelatin Gelatin được sử dụng trong các ngành công nghiệp như: thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và công nghiệp nhiếp ảnh Cả Collagen và gelatin đều có thể sử dụng như một chất phụ gia thực phẩm Gelatin còn nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, gelatin có chức năng làm khô và bảo quản trái cây, thịt; làm trong cà phê, bia, rượu và nước ép trái cây; chế biến sữa bột và các loại thức ăn bột khác Hàm lượng gelatin dùng trong các món tráng miệng là 8-10% khối lượng khô, trong yoyurt 0,3-0,5% với chức năng là chất làm đặc

1.2.6.2.Ứng dụng trong ngành mỹ phẩm [31][33]

Collagen là một loại protein chiếm tới 25% tổng lượng protein trong cơ thể người, có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau Các nhà khoa học thường ví Collagen giống như một chất keo dính các bộ phận trong cơ thể người lại thành một khối hoàn chỉnh, nếu không có chúng cơ thể người sẽ chỉ là các phần rời rạc [31]

Collagen là lớp nâng đỡ bên dưới cho bề mặt da, chiếm đến 75% cấu tạo da và 90% cấu tạo biểu bì Collagen khỏe mạnh sẽ giúp da căng bóng và sáng đẹp, ngược lại Collagen suy yếu sẽ khiến da dễ bị lão hóa Collagen là một chuỗi liên kết amino acid trong sụn động vật, da, xương…và liên kết các mô trong cơ thể Với làn da, ngoài nhiệm vụ liên kết nó còn giúp tạo sự đàn hồi và là nhân tố quan trọng nhất giúp con người duy trì sự trẻ trung

Người từ tuổi 25 trở đi, mỗi năm da bị mất 1,5% lượng Collagen sẵn có do quá trình lão hóa và tác động của môi trường; khi đó, cấu trúc Collagen trong cơ thể bắt đầu bị suy thoái Sự suy thoái Collagen diễn ra tỉ lệ thuận với thời gian: ở tuổi 30, da mất 15% lượng Collagen; ở tuổi 40 da mất 30% lượng Collagen và 45% lượng Collagen sẽ bị thoái hóa ở tuổi 50 Mặt khác, Collagen là thành phần cấu trúc cơ bản của da Collagen đem lại cho da

sự vững chắc, mềm mại và khỏe mạnh, nó giúp duy trì sự đàn hồi và độ ẩm của da Khi độ tuổi tăng, nếu gặp phải những yếu tố có hại cho da như tia UV từ ánh sáng mặt trời, Collagen rất dễ bị tổn thương

Trước kia muốn sử dụng Collagen các bác sĩ phải lấy chúng ngay trên cơ thể từ vùng này dùng cho vùng khác Tuy nhiên phương pháp này tốn kém và phức tạp Ngày nay, các

nhà khoa học đã nghiên cứu thành công việc chiết rút Collagen từ da động vật như: bò, lợn,

cá da trơn, một số loại thực vật và ứng dụng nguồn Collagen này hiệu quả trong điều trị thẩm mỹ.[33]

Như đã phân tích ở trên, Collagen có khả năng giữ nước cho da nên nó được sử dụng

là một thành phần quan trọng trong hầu hết các sản phẩm mỹ phẩm Sản phẩm “Phials of Collagen and Elastin” với các thành phần chính là Collagen từ da lợn, elastin và vitamin F; sản phẩm này giúp kích thích tế bào và sửa chữa các khiếm khuyết ở mô, nhờ đó phục hồi khả năng đàn hồi của da Ngoài ra, sản phẩm còn có thể điều trị các vết rạn do tăng cân hay mang thai [31]

1.2.6.3 Ứng dụng trong y học[8][13][31][33]

Do Collagen không có hoặc có tính kháng nguyên rất thấp nên chúng hoàn toàn không có độc tố, khả năng tương thích với cơ thể con người cao mà không hề có phản ứng đào thải hay loại bỏ Nên phần lớn các sản phẩm Collagen nguyên chất đều được chiết xuất trực tiếp từ da động vật: lợn, bò, cừu và cá da trơn được ứng dụng để điều trị da và mắt Collagen đã được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, làm tái tạo xương, phẫu thuật chỉnh hình và hỗ trợ chữa bệnh cho bệnh nhân bỏng và làm màng bao thuốc… [13][8]

Collagen được làm dưới dạng những miếng nhỏ (có kích thước phù hợp để sản xuất

vỏ thuốc hoặc là thành phần của thuốc điều trị bỏng) Các nhà khoa học chứng minh được rằng Collagen có trong các băng y tế có thể điều trị nhanh và hữu hiệu các vết bỏng nông và sâu Lúc này có thể tạo hình cho nó thành những tấm, miếng 0,5-2 cm để sản xuất vỏ thuốc hoặc thuốc điều trị bỏng hoặc tạo ra kích thước phù hợp để phối trộn vào các kem mỹ phẩm sau khi đã được thanh trùng Các nhà nghiên cứu cho rằng kể cả những vết bỏng sâu cũng có thể được điều trị nhanh và hữu hiệu nhờ các băng y tế có Collagen

Số lượng các liên kết mạch ngang trong cấu trúc dưới phân tử Collagen có thể điều chỉnh thời gian phân giải của tia UV lên niêm mạc mắt Vì vậy họ đã nghiên cứu chế tạo các màng bảo vệ mắt Ngoài ra Collagen còn được ứng dụng trong công nghệ sinh học, Collagen phối hợp với vật liệu nhu mô có thể được sử dụng như một chất mang bề mặt mới trong nuôi cấy tế bào động vật Theo các nghiên cứu của Lazovic G., Colic M., Grubor M., Jovanovic

M thuộc trung tâm điều trị bỏng ở Serbia, sử dụng màng Collagen đắp lên các vết bỏng nặng có thể giúp phục hồi chúng sau 10 ngày [8] [13]

Tóm lại bên cạnh những ứng dụng trong ngành công nghiệp thuộc da, Collagen được

sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, mỹ phẩm, phẫu thuật, nha khoa, thuốc viêm mắt, cũng như các ứng dụng khác trong ngành công nghệ sinh học Các ứng dụng của Collagen trong y học có thể tóm tắt như bảng sau:

Bảng 1.8: Các ứng dụng y học của Collagen [8]

Tác nhân cầm máu Bột, bọt xốp, bông xốp

Mạch máu Mạch máu người/động vật đã xử lý, Collagen dạng sợi có khả

năng tái tạo

Van tim Van tim lợn đã qua xử lý

Gân, dây chằng Gân động vật đã xử lý, hỗn hợp các sợi cacbon-Collagen Băng y tế điều trị bỏng Collagen dạng bọt xốp từ da động vật

Giải phẫu trong da Collagen dạng sợi có khả năng tái tạo

Hệ thống phân tán thuốc Các dạng có mức phân giải khác nhau

1.2.7.Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.7.1.Trong nước[12][5]

Năm 2000 các nhà khoa học của Đại học Cần Thơ đã nghiên cứu chiết rút Gelatin (một chất dẫn xuất của Collagen từ da cá Tra) Trong nghiên cứu này một số tính chất lý hóa của Collagen (độ nhớt, nhiệt độ biến tính, màu sắc, hàm lượng các acid amin, khối lượng phân tử) đã được xác định

Năm 2001, các tác giả KS.Cao Vân Điểm, TS.Phạm Lê Dũng, TS.Nguyễn

Gia Tiến, BS.Đặng Hoàng Nga, BS.Trần Đoàn Đạo, tại Viện Trang Thiết bị và

Công trình Y tế Hà Nội đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng màng sinh học

Vinachitin” Trong đó tác giả thực hiện so sánh kết quả lâm sàng điều trị bỏng: độ II và III

nông của màng sinh học Vinachitin với màng ối người và da ếch đông khô; độ III sâu, độ IV

của màng Vinachitin với màng Collagen ấn Độ; độ II và III của màng Vinachitin với cream Silverin Sulfadiazin của Ấn Độ.[12]

Tác giả Võ Quốc Văn và Hà Thanh Toàn (năm 2008) đã nghiên cứu sản xuất gelatin từ da cá Tra Tạp chí thương mại thủy sản, số 5-6/2008

Tác giả Trần Thị Huyền (năm 2009) đã sử dụng phương pháp hóa học để chiết rút Collagen từ da cá Tra Chất lượng của Collagen đã được đánh giá thông qua các chỉ tiêu cảm quan Tuy nhiên trong nghiên cứu này các tính chất hóa, lý, sinh học của Collagen chưa được xác định.[5]

1.2.7.2.Ngoài nước

Năm 2004, tác giả Nagai và các cộng sự đã nghiên cứu tách chiết Collagen từ vẩy của một số loài cá bằng axit acetic rồi kết tủa bằng muối NaCl trong môi trường trung tính Hiệu suất thu Collagen từ vẩy cá mòi là cao nhất (50,9%), từ vẩy cá tráp Nhật Bản là thấp nhất (37,5%) Kết quả phân tích tính chất lý, hóa của Collagen cho thấy Collagen từ vẩy cá gồm hai loại mạch là α1 và α2, và nhiệt độ biến tính Collagen từ vẩy những loài cá này là khoảng

28 0 C [5]

Năm 2005, tác giả Vittayanont và Bebjakul đã đưa ra quy trình chiết Collagen từ chân

gà với các công đoạn xử lý bằng acid acetic, enzyme pepsin và kiềm NaOH Kết quả thu được hàm lượng Collagen là 12,7% so với trọng lượng khô của nguyên liệu, với sự có mặt của enzyme (một loại protease) đã giúp tăng hàm lượng thu Collagen lên tới 9 lần mà không làm thay đổi tính chất đặc trưng của nó [10]

Năm 2006, tác giả Sensrsture và các cộng sự đã nghiên cứu đưa ra quy trình tách chiết Collagen từ da cá cóc với các công đoạn xử lý bằng kiềm kết hợp với enzyme pepsin Hàm lượng Collagen thu được là 54,3% tính theo trọng lượng của Collagen đã sấy khô đưa trên kết quả phân tích điện di (SDS- PAGE), Collagen từ da cá này chứa 3 mạch xoắn alpha

1, 2, 3 và nhiệt độ biến tính là 28 0 C

Năm 2007, Choi và các cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra quy trình chiết Collagen từ

da mực với công đoạn xử lý bằng kiềm NaOH Kết quả cho thấy hiệu suất thu Collagen đạt 70-76% Nghiên cứu này đã xác định được tính chất lý, hóa của Collagen Theo đó, nhiệt độ

biến tính là 27,3 0 C; khả năng giữ nước là 99,7%, thành phần và số lượng các acid amin và các phân tích cấu trúc của Collagen này

Tác giả Sionkowska và các cộng sự (2009) đã nghiên cứu sử dụng một số phương pháp khác nhau chiết Collagen khác nhau từ gân đuôi chuột và thử nghiệm ứng dụng của chúng trong y học Kết quả cho thấy sử dụng axit acetic 0,04N trong 48 giờ cho hiệu suất chiết là cao nhất Collagen thu được chủ yếu là Collagen loại I [29]

Bản chất của collaegn là protein Phương pháp kết tủa để tinh sạch collagen là dựa trên

cơ sở kết tủa protein Các phương pháp kết tủa được ứng dụng rộng rãi như tủa bằng muối , bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein [5]

sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa

Hiệu quả tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: Citrate >Phosphate >Sulphate > Acetate/chloride >Nitrate > Thiocyanate

Cơ chế của quá trình kết tủa protein bằng ding dịch muối có nồng độ cao :

Hầu hết protein ở dạng hòa tan trong dịch tế bào (ví dụ như enzyme) đều tan tốt trong dung dịch muối sinh lý có nồng độ ion khoảng 0,5-2 M và ở pH trung tính Khi tiến hành tách chiết protein ra khỏi tế bào thì các điều kiện môi trường thay đổi dẫn đến protein bị kết tủa

Độ tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác có cực của protein với dung môi, sự tương tác ion của protein với các phân tử muối hiện diện trong dung dịch và sự tương tác tĩnh điện

giữa phân tử mang điện tích hay những nhóm phân tử mang điện tích của protein kết dính lại với nhau Quá trình kết tủa protein bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc rất lớn vào tính kỵ nước của phân tử protein Trong dung dịch, các gốc kỵ nước của phân tử protein tập trung trên bề mặt, tiếp xúc trực tiếp với các phân tử nước.Các phân tử nước này ngăn cản quá trình hình thành liên kết để tạo kết tủa giữa các phân tử protein với nhau Khi nồng độ dung dịch muối tăng, các phân tử muối bị Solvate hóa làm giảm số phân tử nước xung quanh

bề mặt các phân tử protein tạo điều kiện cho các bề mặt kỵ nước tiến đến gần nhau và kết tủa xuống Mặc dù quá trình kết tủa bằng dung dịch muối có nồng độ cao phụ thuộc nhiều vào các phân tử kỵ nước của protein nhưng các yếu tố khác như pH, nhiệt độ cũng gây ảnh hưởng đến quá trình này Ở pH gần điểm đẳng điện pI thì quá trình kết tủa xảy ta dễ dàng hơn và khi nhiệt độ tăng ở nồng độ muối cao thì độ hòa tan của protein cũng giảm Ngoài ra trong quá trình kết tủa protein bằng muối có nồng độ cao cần lưu ý đến bản chất của muối dùng để kết tủa Những loại muối có gốc Anion tích nhiều điện tích âm như SO42- , PO43-

… là những loại muối làm tăng hiệu quả của quá trình kết tủa Gốc cation tuy không ảnh hưởng lắm nhưng cần lưu ý không sử dụng các ion phức hoặc các ion có khả năng hình thành liên kết với phân tử protein Do đó những ion NH4+ , Na+, K+…thường được sử dụng [32][5]

1.3.2 Tủa bằng ion kim loại

Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm Các ion như Mn2+ , Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+

sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen Các ion như Ca2+,

Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic Các ion như Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh [5]

1.3.3 Tủa bằng phương pháp điểm đẳng điện

Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi Ở pH

thấp, protein tích điện dương vì nhóm Amide bị proton hóa (thu nhận proton) Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm Carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất

H+) Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện.Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi

trường Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đẳng điện khoảng 4.6)

Từ những tổng quan trên cho phép đề xuất một số hướng sản xuất Collagen

có thể ứng dụng vào đề tài là:

- Sử dụng các tác nhân hóa học để loại bỏ các hợp chất phi Collagen ra khỏi nguyên liệu da

cá, thành phần chủ yếu còn lại sẽ là Collagen Hướng này cần kiểm soát chế độ xử l í nghiêm ngặt vì trong quá trình tách các tạp chất rất dễ gây ảnh hưởng đến mạch Collagen, làm thất thoát Collagen giảm hiệu suất thu Collagen

- Sử dụng kết hợp tác nhân hóa học và tác nhân sinh học (enzym) để loại bỏ các hợp chất phi Collagen ra khỏi nguyên liệu da cá, thành phần chủ yếu còn lại sẽ là Collagen

- Chỉ xử lý sơ bộ các tạp chất phi Collagen bằng tác nhân hóa học hoặc sinh học, rồi sử dụng dung môi chiết và tác nhân kết tủa Collagen thích hợp Rất nhiều các công trình nghiên cứu

đã công bố khẳng định hiệu quả của hướng nghiên cứu thứ ba nêu trên Theo hướng này, nguyên liệu trải qua hai quá trình chính là xử lý sơ bộ và chiết-kết tủa Khi đó, một mặt các tạp chất đều được tách ra từ cả hai quá trình, mặt khác độ tinh sạch của Collagen đ ược cải thiện đáng kể qua quá trình chiết- kết tủa nên chất lượng Collagen thu được có thể tốt hơn Tuy nhiên cũng cần kiểm soát những tác động bất lợi lên mạch Collagen trong hai lần tác động này cũng như đảm bảo hiệu suất thu Collagen Đề tài này tập trung nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khử tạp chất phi collagen bằng phương pháp hóa học cụ thể là ảnh hưởng của các axit lên hiệu quả khử khoáng và các tính chất của sản phẩm collagen Nhằm giúp xây dựng quy trình nghiên cứu thu được collagn có hiệu xuất và chất lượng cao [5]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1 Kiềm NaOH

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GB/T629-1997

- Trạng thái: dạng tinh thể màu trắng đựng trong hộp nhựa

- Chỉ số M=40 , d=2,13

- Độ tinh khiết ≥ 96%

2 Axit acetic CH3COOH

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GB/T629-1997

- Trạng thái: dung dịch màu trắng đựng trong chai thủy tinh

- Chỉ số M=60,05 , d= 1,05

- Độ tinh khiết ≥ 99,5%

3 Axit lactic C3H6O3 ( CH3-CH(OH)-COOH )

- Công thức cấu tạo :

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GB/T629-1997

- Trạng thái: dạng dung dịch màu trắng đựng trong thủy tinh

- Chỉ số M=90,08 , d=1,21

- Độ tinh khiết ≥ 85-90%

4 Axit citric C6H807.H20

- Công thức cấu tạo:

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GB/T629-1997

- Trạng thái: dạng tinh thể màu trắng đựng trong hộp nhựa

- Chỉ số M=210,16

- Độ tinh khiết ≥ 99.5%

5 Muối NaCl

- Được sản xuất theo tiêu chuẩn GB/T629-1997

- Trạng thái: dạng tinh thể màu trắng đựng trong hộp nhựa