do an la sen chong oxi hoa

Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “nhữngngười thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phảnứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứn

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM



BÁO CÁO ĐỒ ÁN

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA

GVHD: HUỲNH NGUYỄN QUẾ ANH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Trong những năm gần đây, ngoài khuynh hướng nâng cao ý thức phòng và chữa bệnh, người tiêu dùng còn quan tâm đến cách thức ăn uống sinh hoạt Người ta bắt đầu quan tâm nhiều đến việc sử dụng các thực phẩm có chức năng chữa bệnh từ thức ăn như các loại họ đậu (đậu xanh, đậu nành, gạo lức…) đến thức uống như trà dược thảo, nước mát dân gian, trà xanh… Điều đó cho thấy những loại thực phẩm rất gần gũi với người Việt – thực phẩm truyền thống đang được sử dụng dần dần trở lại Khoa học hiện đại vẫn khuyến khích sử dụng nguồn thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên như các loài thảo mộc, các loại trà xanh, dược thảo Những thực phẩm này không những là thực phẩm đơn thuần mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh 1 Sen là một loài cây đã quá quen thuộc với con người Việt Nam Sen còn là biểu tượng về tinh thần của dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi tanh mùi bùn” Không chỉ có vẻ đẹp, hương thơm mà sen còn có nhiều công dụng, tác dụng quý báu Hải Thượng Lãn Ông đã viết về cây sen như sau: “cây sen mọc dưới bùn đen mà không

ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của đất trời; nên củ, lá, hoa, tua, vỏ, quả, ruột đều là thuốc hay” Nhưng từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến

sử dụng hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen (liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm Còn lá sen chỉ được dùng để gói thức ăn, ít người nghĩ rằng lá sen có nhiều tác dụng quý để chữa

bệnh Ngày nay, nhờ công nghệ hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra một chất đặc biệt của cây sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol trong máu và hoạt tính chống lại serotonin Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất.Nuciferine chiết ra từ lá sen có công dụng kéo dài giấc ngủ Ngoài

ra, lá sen còn chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh hơn tâm sen 1

Về hóa học, lá sen chứa nhiều thành phần như: tanin, flavonoid, các hợp chất

polyphenol, alkaloid trong đó có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain, liriodenin, pro-nuciferine, O-nornuciferine, armeparin, N-nor-amepavin, metyl- coclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, N- metyl lisococlaurin Trong đó, nuciferine là alkaloid chính .1

Về dược lý, lá sen được nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt cơ

trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu đã được y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh Về sau này khi bệnh béo phì trở nên phổ biến, thì lá sen

được sử dụng rất hiệu quả để chống lại căn bệnh này Chính vì những lý do trên, nhóm chúng em đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢP CHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY

HÓA” để làm đề tài đồ án tốt nghiệp 2

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1 Giới thiệu về cây sen - Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn 3

2.Đối tượng nghiên cứu 4

3.Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 7

3 Một số sản phẩm từ sen có trên thị trường 9

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

a.Thời gian nghiên cứu: 18

b.Địa điểm nghiên cứu: 18

2.Nguyên vật liệu và thiết bị, dụng cụ-hóa chất 18

a.Nguyên liệu 18

b.Thiết bị, dụng cụ-hóa chất 19

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ dung môi cồn trích ly cho hàm lượng flavonoid là cao nhất 23

3.7.Quy trình tiến hành nghiên cứu 29

a.Sơ đồ quy trình xử lý nguyên liệu 29

b.Sơ đồ quy trình trích ly 30

3.8.Phương pháp phân tích 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngoài khuynh hướng nâng cao ý thức phòng và chữabệnh, người tiêu dùng còn quan tâm đến cách thức ăn uống sinh hoạt Người ta bắtđầu quan tâm nhiều đến việc sử dụng các thực phẩm có chức năng chữa bệnh từthức ăn như các loại họ đậu (đậu xanh, đậu nành, gạo lức…) đến thức uống như tràdược thảo, nước mát dân gian, trà xanh… Điều đó cho thấy những loại thực phẩmrất gần gũi với người Việt – thực phẩm truyền thống đang được sử dụng dần dần trởlại Khoa học hiện đại vẫn khuyến khích sử dụng nguồn thực phẩm có nguồn gốc từthiên nhiên như các loài thảo mộc, các loại trà xanh, dược thảo Những thực phẩmnày không những là thực phẩm đơn thuần mà còn có tác dụng phòng và chữa bệnh

Sen là một loài cây đã quá quen thuộc với con người Việt Nam Sen còn là biểu

tượng về tinh thần của dân tộc Việt : “Gần bùn mà chẳng hôi tanh mùi bùn” Không

chỉ có vẻ đẹp, hương thơm mà sen còn có nhiều công dụng, tác dụng quý báu Hải Thượng Lãn Ông đã viết về cây sen như sau: “cây sen mọc dưới bùn đen mà không

ô nhiễm mùi bùn, đượm khí thơm trong lành của đất trời; nên củ, lá, hoa, tua, vỏ, quả, ruột đều là thuốc hay” Nhưng từ trước đến nay, người ta chỉ chú ý đến sử dụng

hạt sen (liên nhục) để nấu chè, tâm sen (liên tâm) làm thuốc an thần, tua sen

(liên tu) dùng ướp chè, ngó sen (liên ngẫu) làm thực phẩm Còn lá sen chỉ được dùng để gói thức ăn, ít người nghĩ rằng lá sen có nhiều tác dụng quý để chữa bệnh Ngày nay, nhờ công nghệ hiện đại, các nhà khoa học đã phát hiện ra một chất đặc biệt của cây sen, chất nuciferine có tác dụng chống viêm, giảm đau, trị béo phì, hạ cholesterol trong máu và hoạt tính chống lại serotonin Lá sen chứa nhiều nuciferine nhất.Nuciferine chiết ra từ lá sen có công dụng kéo dài giấc ngủ Ngoài

ra, lá sen còn chứa nhiều vitamin C, alkaloid tác dụng an thần mạnh hơn tâm sen.

Về hóa học, lá sen chứa nhiều thành phần như: tanin, flavonoid, các hợp chất

polyphenol, alkaloid trong đó có nuciferine, nor-nuciferine, roemerine, anonain,

liriodenin, pro-nuciferine, O-nornuciferine, armeparin, N-nor-amepavin,

metyl-coclaurin, nepherin, dehydro roemerine, dehydro nuciferine, dehydro anonain, metyl lisococlaurin Trong đó, nuciferine là alkaloid chính

N-Về dược lý, lá sen được nghiên cứu có tác dụng an thần, chống co thắt cơ

trơn, chống thoáng phản vệ, ức chế loạn nhịp tim, từ lâu đã được y học cổ truyền dùng làm thuốc chữa bệnh Về sau này khi bệnh béo phì trở nên phổ biến, thì lá sen được sử dụng rất hiệu quả để chống lại căn bệnh này Chính vì những lý do trên,

nhóm chúng em đã chọn đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT HỢPCHẤT FLAVONOID TRONG LÁ SEN VÀ THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXYHÓA” để làm đề tài đồ án tốt nghiệp

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tách chiết thu nhận dịch giàu flavonoid từ lá sen và ứng dụng thử hoạt tính chốngoxy hóa của nó

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 Giới thiệu về cây sen

- Cây sen thuộc loài Nelumbo nucifera Gaertn

- Ngành Ngọc Lan (magno liophyta)

- Lớp Ngọc Lan (magno liopsida)

- Phân lớp Sen (Nelumbonidae)

- Bộ Sen (Nelumbonales)

- Họ Sen (nelumbonaceae)

- Chi Nelumbo Adans

- Ngoài ra còn có tên khác như: Liên, Ngậu (Tày)

- Tên khoa học: Nelumbo nuciferagaertn

- Tên nước ngoài: sacred lotus, chinese water-lily, Indian lotus, Egypian

bean

Hình 1.1.Lá sen

Mô tả cây sen: sen là một loại cây mọc ở dưới nước, sống dai nhờ thân rễ

Ngó sen màu trắng, tiết diện gần tròn.Thân rễ phình to thành củ, màu vàng nâu,hình dùi trống, gồm nhiều đoạn, thắt lại ở giữa, trong có nhiều khuyết rộng Láhình lọng có 2 thùy sâu đối xứng nhau, mặt trên xanh đậm, nhẵn bóng, mặt dướixanh nhạt, nhám Cuống lá màu xanh, hình trụ, có nhiều gai.Hoa to, màu hồnghay trắng Cuống hoa màu xanh, dài khi già chuyển sang màu nâu, có nhiều gainhọn Cuống lá và cuống hoa có nhiều khoang rỗng bên trong.Đế hoa rất lồi dạnghình nón ngược, mép lồi lõm, xốp, non màu vàng, già màu xanh.Quả màu xanh,nhẵn, hình bầu dục Hạt màu trắng 2 lá mầm dày mập màu trắng , bên trong cótâm sen màu xanh Tâm sen gồm rễ mầm, thân mầm, chồi mầm và 2 lá đầu tiên

Loại đất có đặc điểm tự nhiên rất thích hợp cho cây sen phát triển chính làđất phèn, bởi vậy vùng trồng sen số lượng lớn phải kể đến các tỉnh thuộc đồngbằng sông Cửu Long như: Đồng Tháp, Long An, Tây Ninh, An Giang, Ở miềntrung nổi bật nhất sen được trồng ở Huế và trở thành đặc trưng của mảnh đất này,ngoài ra Quảng Nam cũng có những vùng nhỏ lẻ của các hộ gia đình.

Tại miền Bắc, sen được trồng trong các ao hồ nhỏ với quy mô ít hơn, đượcphân bố ở các vùng như: Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hòa Bình,…

Trên thế giới Sen được trồng tại một số nước như: Nhật Bản, Ấn Độ, TrungQuốc, Ai Cập, Đài Loan, Hàn Quốc,…

2 Đối tượng nghiên cứu

Lá sen lấy ở đại lộ Võ Văn Kiệt quận 6

Các hợp chất hóa học có trong lá sen:

Năm 1970, D Cunitomo ( J Pharm Soc Jap., 1970, 90, 9,1165) đã tách được từ

lá sen các chất anonain, pronuxiferin, N-nornuxiferin, liriodenin, D N.metylcoclaurin, roemerin, nuxiferin và O.nornuxiferin

Theo cuốn sách những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của giáo sư tiến sĩ Đỗ TấtLợi thì trong lá sen có nhiều alkaloid, trong đó nuciferine là alkaloid chính

Công thức phân tử của nuciferine: C19H21NO2

Trọng lượng phân tử: 295,2

Công thức cấu tạo của nuciferine

Hàm lượng alkaloid toàn phần của lá sen chiếm từ 0.28-0.8% tùy theo điềukiện khí hậu, thổ dưỡng Có khoảng 15 alkaloid đã được xác định.Các alkaloidtrong lá sen có cấu trúc isoquinolin bao gồm các phân nhóm aporphin,proaporphin, benzylisoquinolin và bisbenzylisoquinolin.Các alkaloid có cấu trúcaporphin chiếm phần lớn về tỉ lệ cũng như số lượng trong alkaloid toàn phần của

lá sen

Hàm lượng flavoniod toàn phần của lá sen từ 3.814% tùy theo điều kiện khíhậu, thổ dưỡng Có khoảng 16 flavonoid đã được xác định trong lá sen Flavonoidtrong lá sen thuộc các nhóm flavonol, flavon, catechin, leucoanthocyanidin, trong

đó hàm lượng cao nhất được tìm thấy là quercetin 3-O-β-D-glucuronid

- Tính chất lí – hóa: Nuciferin là chất kết tinh, tinh thể hình khối, màu vàng nhạt,không mùi, không vị, tan tốt trong CHCl3, MeOH, EtOH nóng, hầu như không tantrong nước, nhiệt độ nóng chảy 164– 165oC, Phổ UV (đo trong MeOH) cho λmax

tại bước sóng 210 nm, 228 nm, 270nm

- Tác dụng dược lí: Nuciferin chiết từ lá Sen có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ứcchế thần kinh trung ương, chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotoninvàcó hoạt tính phong bế thụ thể adrenergic Nuciferin ít độc, liều LD50 là 330mg/kg thể trọng chuột Nuciferin có tác dụng tăng cường quá trình ức chế các tếbào thần kinh vùng vỏ não cảm giác – vận động và thể dưới thân não trên thỏ thínghiệm, có tác dụng an thần và kéo dài giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thínghiệm

Bảng 2.1 Bảng thành phần dinh dưỡng của lá sen:

Qua bảng trên đây cho ta thấy hàm lượng flavonoid và alkaloid của lá sen, câylược vàng và cây mã đề là tương đương nhau, thậm chí, hàm lượng flavonoid của

lá sen còn cao hơn so với hai cây còn lại

Đã có nhiều bài báo khoa học chứng minh tác dụng của flavonoid cũng như cơ chếchống oxy hóa của chúng Hợp chất flavonoid có công dụng trong lĩnh vực sinhhọc cũng như y học Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là “nhữngngười thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên” nhờ vào khả năng sửa chữa các phảnứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chấtsinh ung Nhờ vậy chúng có đặc tính kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus vàung thư Hơn nữa, flavonoid là một chất chống oxy hóa mạnh giúp cơ thể chốnglại các tổn thương do sự oxy hóa và các gốc tự do một cách hữu hiệu Nhờ vậyflavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh

lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa độngmạch,… nhờ khả năng chống sự ôxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giốngnhư các chất chống ôxy hóa khác như vitamin C, E,…) Ngược lại, nếu lượngflavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên rõrệt.Khả năng chống ôxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác nhưvitamin C, E, selenium và kẽm Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi íchriêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ nhau và tác dụng thường chồng chéolên nhau

Các yếu tố ảnh hưởng đến các hợp chất có lợi trong lá sen:

Dung môi có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình chiết xuất dược liệu Đểchiết xuất đạt hiệu suất cao và ít tạp chất phải lựa chọn được dung môi có độ phâncực phù hợp và có tính chọn lọc cao với chất cần chiết Trong chiết xuất các chấtflavonoid sử dụng dung môi hữu cơ thì pH, nhiệt độ, nồng độ dung môi là yếu tốquyết định đến hiệu suất chiết

Vai trò của lá sen trong dân gian:

- Chữa mất nước: Người bị tiêu chảy vừa khỏi, cơ thể đang bị thiếu nước Chỉ cầnlấy lá sen non (loại lá còn cuộn lại chưa mở càng tốt) rửa sạch, thái nhỏ, ép lấynước uống làm nhiều lần trong ngày Hoặc thái nhỏ, trộn với các loại rau ghém, ănsống hằng ngày

- Chữa máu hôi không ra hết sau khi sinh: Lá sen sao thơm 20-30 g, tán nhỏ, uốngvới nước, hoặc sắc với 200 ml nước còn 50 ml uống một lần trong ngày

- Chữa rối loạn mỡ máu: Lá sen khô 1 lá, sắc nước uống trong ngày

- Chữa mất ngủ: Lá sen loại bánh tẻ 30 g rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc (hoặc hãmnước sôi) để uống, có tác dụng còn lớn hơn tim sen.

- Chữa sốt xuất huyết: Lá sen 40 g, ngó sen hoặc cỏ nhọ nồi 40 g, rau má 30 g, hạt

mã đề 20 g, sắc uống ngày một thang Nếu xuất huyết nhiều, có thể tăng liều của

lá và ngó sen lên 50-60 g

- Chữa băng huyết, chảy máu cam, tiêu chảy ra máu: Lá sen 40 g để sống, rau má 12

g sao vàng, thái nhỏ, sắc với 400 ml nước còn 100 ml, uống làm hai lần trongngày

- Chữa ho ra máu, nôn ra máu: Lá sen, ngó sen, sinh địa (mỗi vị 30 g), trắc bá, ngảicứu (mỗi vị 20 g) Tất cả thái nhỏ, phơi khô, sắc uống trong ngày

- Chữa đau mắt: Lá sen, hoa hòe (mỗi vị 10 g), cúc hoa vàng 4 g, sắc uống còn chữacao huyết áp

- Đắp nhọt: Dùng ngoài, núm cuống lá sen nấu nước đặt để rửa, rồi lấy lá sen rửasạch, giã nát với cơm nếp, đắp làm tan mụn nhọt

- Phòng chống béo phì: Lá sen tươi 1 lá, gạo tẻ 100g, đem nấu cháo dùng với đườngtrắng, cũng có thể gia thêm đậu xanh để tăng sức thanh nhiệt giải độc Nếu không

có lá sen tươi, có thể dùng lá sen khô, nhưng trước khi dùng phải ngâm cho mềmhoặc mỗi ngày uống trà lá sen

3 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012) đã chiết xuất và tinh chế nuciferin từ lá sen

để làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm dược Nuciferin là alkaloid chính

có trong lá sen, có tác dụng giải thắt co cơ trơn, ức chế thần kinh trung ương,chống viêm yếu, giảm đau, chống ho, kháng serotonin và có hoạt tính phong bếthụ thể adrenergic Chiết nuciferin bằng phương pháp chiết nóng với dung môi làethanol Sau khi phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với hệ dung môi là n-hexan:aceton:NH4OH (3:1:0,1), thì thu được nuciferin với độ tinh khiết khá caokhoảng 96,2% Bằng phương pháp kết tinh lại trong ethanol ở nhiệt độ thấp thuđược nuciferin với độ tinh khiết lên đến 98-99%.[9]

Trong nghiên cứu của Phạm Hữu Điền (2010)về thành phần hóa học của

cây sen (Nenumbo nucifera) trồng ở Hà Nội Tinh dầu hoa sen được thu hồi bằng

phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, sản phẩm có chứa trên 30 cấu tử, chủyếu là pentadecan (36,49%), a-terpineol (11,88%)… Từ dịch chiết ethanol của lásen, đã chiết tách và xác định cấu trúc của 4 hợp chất của dodexylamine, β-sitosterol, hexadecanamide và nuciferin Nuciferin, một alcaloid chính trong lásen, có biểu hiện họat tính kháng được năm chủng vi khuẩn.[10]

Hoạt tính chống oxy hóa của hạt sen chiết bằng ethanol, đã được Sujay Rai

và các cộng sự nghiên cứu (2006) Trên mô hình in vitro, hàm lượng phenolic tổng

số trong hạt sen là 7,6±0,04% (w/w) Giá trị IC50 thấp trên cả hai phương phápDPPH (6,12±0.41g/mL) và oxit nitric (84,86±3,56 g/mL) và thấp hơn rutin chuẩn

là 18,95±0,49 μg/mL, 152,17±5,01 μg/mL cho thấy hoạt tính loại gốc tự do mạnh

In vivo, thử độc tính cấp tính ở chuột Swiss Albino, cho thấy không có dấu hiệu

ngộ độc trong 24 giờ, khi cho chuột uống dịch

chiết với liều lên đến 1000 mg/kg.[11]

Nghiên cứu của Sasikumar Dhanarasu và cộng sự (2013)cho thấy: Dịchchiết từ nhị hoa sen trong methanol chứa kaempferol có tác dụng ức chế và làmgiảm thụ thể IgE (immunoglubulin E)-một tác nhân gây dị ứng Alkaloid vàflavonoid của hạt sen chiết trong ethanol 95% có hoạt tính kháng virus HSV-1

Dịch chiết từ thân rễ có khả năng chống lại vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, và Pseudomonus aeruginosa.

Khả năng chống nấm có thể so sánh với griseofulvin chống lại năm chủng nấm

khác nhau Ở một thí nghiệm khác cho thấy thân sen được chiết bằng ethanol có

tính hạ sốt Thực hiện trên chuột với thân nhiệt bình thường và chuột bị gây sốt.Kết quả là dịch chiết thân sen ở liều cho uống 200 mg/kg làm giảm thân nhiệt bìnhthường 3 giờ sau khi uống; còn liều 400 mg/kg thì giảm thân nhiệt tới 6 giờ saukhi uống.[12]

Bo Huang và các cộng sự (2010) đã nghiên cứu khả năng bảo vệ gan vàhoạt tính chống oxy hóa từ lá sen đƣợc chiết bằng ethanol Thí nghiệm về hoạttính bảo vệ gan ở chuột từ dịch chiết lá sen ở các liều 100 mg/kg, 300 mg/kg, 500mg/kg và so sánh với silymarin 100 mg/kg, một chất điều trị chuẩn Trong đó liều100mg/kg chiết xuất từ lá được xem là tương đương với silymarin chuẩn ởliều100mg/kg Bằng phương pháp HPLC-DAD-ESI/MS đã phát hiện ra sáu chấtchống oxy hóa mạnh là glycoside của catechin và năm dẫn xuất glycoside của

flavonoid: hyperin, isoquercitrin, astragalin, miricitrin–3–O–glucozid, quercetin– 3–O–rhamnoside Góp phần chứng minh cho hoạt tính chống oxy hóa mạnh của

chiết xuất lá sen.[13]

“Antioxidant activity of methanol extract of the lotus leaf (nelumbonucifera Gertn)”, The American Journal of Chinese Medicine, Vol 31, No 5, 687-

698, 2003

Thirunavukkarasu Santhoshkumar, 10/2010, Springer-Verlag, “Synthesis ofsilver nanoparticles using Nelumbo nucifera leaf extract and its larvicidal activityagainst malaria and filariasis vectors”

3 Một số sản phẩm từ sen có trên thị trường

- Tinh lá sen tươi Firi: làm giảm huyết áp, mỡ máu, gan nhiễm mỡ

- Sen vông R – Viên nén bao đường: sản phẩm của công ty dược phẩm

Dopharma (cao khô lá sen và cao khô lá vông là thành phần chính), có tác dụng anthần gây ngủ, giảm đau nhẹ

- Hạt sen sấy bơ thành phần gồm có hạt sen và bơ là sản phẩm của Công ty Đầu TưThương Mại Du Lịch Đồng Tháp Mười

4 Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa

4.1 Gốc tự do

 Định nghĩa:

Gốc tự do là những mảnh phân tử (CH3, OH ), phân tử (NO, NO2, CO2 ),nguyên tử tự do (Cl, Br ) hay ion (O2 ) trung tính hay mang điện tích, có lớpngoài cùng chứa một điện tử không ghép cặp (điện tử độc thân) Chúng có thểmang điện tích dương, âm hoặc không mang điện và cả 3 loại này đều giữ vai tròquan trọng trong hệ thống sinh học Vì vậy gốc tự do thường không ổn định cả vềnăng lượng cũng như điện học

Gốc tự do luôn có khuynh hướng đạt tới sự ổn định và có thời gian tồn tạirất ngắn, hoạt động rất mạnh Gốc tự do có thời gian tồn tại càng ngắn, càng cóđộc tính lớn Người ta thấy rằng mức độ hoạt động của gốc tự do tương quannghịch với thời gian tồn tại của chúng Gốc tự do có thời gian tồn tại < 10-6giây làgốc tự do không bền và có độc tính cao, gốc tự do tồn tại > 10-6giây là gốc tự dobền, ít độc tính hơn và đây chính là tác nhân trung hoà gốc tự do không bền Trong

cơ thể có những gốc chứa oxy rất không bền, đó là các gốc O2 (gốc superoxid),

OH (gốc hydroxyl), Alkoxyl (LO), Peroxyl(LOO•)

Gốc tự do khi đạt tới trạng thái ổn định, nó có thể thể hiện là gốc oxy hoákhử Ví dụ hoạt động của gốc anion superoxid (O2)

O2• + Cu2+ Cu2+ + O2

O2• + Fe2+ 2 H+ Fe3+ + H2O2

Hoặc anion superoxid tự oxy hoá theo phản ứng dị ly:

O2• + O2• 2 H+ H2O2 + O2

Gốc tự do hoạt động dễ dàng tấn công vào các phân tử tạo ra các phân tửmới, gốc mới và gây ra phản ứng dây chuyền:

R• + R1H R•1 + RH

R•1 + R2- R3 R•3 + R1- R2

Các gốc mới sinh nếu không được trung hoà theo phản ứng “gốc- gốc” đểtạo phân tử không gốc thì sẽ tiếp tục chuỗi phản ứng như trên Các gốc tự do luônđược hình thành từ nhiều con đường khác nhau, gốc này mất đi, các gốc khác lạiđược sinh ra

 Phân loại:

Có thể phân loại gốc tự do theo nhiều cách khác nhau như nguồn gốc phátsinh, bản chất gốc tự do…Theo nguồn gốc phát sinh, gốc tự do được xếp thành hailoại như sau:

- Gốc tự do nội sinh: Có trong cơ thể do những quá trình chuyển hóa tự nhiên như

hô hấp tế bào, diệt khuẩn trong quá trình thực bào, tổn thương các tế bào…

- Gốc tự do ngoại sinh: Được hình thành do các yếu tố ngoại lai như ô nhiễm môitrường, uống rượu, hút thuốc lá…

 Ảnh hưởng của gốc tự do:

- Tác hại:

Gốc tự do nội sinh với một tỷ lệ nhất định thoát ra khỏi quá trình hữu íchcùng với gốc tự do lạ do tác động của môi trường, luôn tấn công quyết liệt và liêntục vào mọi cấu trúc của tế bào Do có khả năng phản ứng mạnh nên các gốc tự do

có thể thực hiện các phản ứng hóa học, phá hủy hệ thống tế bào dẫn đến khả năngsinh bệnh ung thư, nhồi máu cơ tim và lão hóa

- Lợi ích:

Tuy nhiên, không phải lúc nào gốc tự do cũng gây hại Gốc tự do nội sinh

là cần thiết cho quá trình phân huỷ và tổng hợp các chất trong chu trình chuyểnhoá của cơ thể Phản ứng oxy hoá cơ chất để cung cấp năng lượng cho sự sốnghoặc các dây truyền trao đổi electron giữa các hệ thống, thường thông qua phảnứng gốc tự do Khi cần gốc tự do cũng là vũ khí tiêu diệt các vật thể lạ xâm nhập

4.2 Chất chống oxy hóa

Trong điều kiện bình thường, các gốc tự do luôn luôn sản sinh trong cơ thể

Do gốc tự do có khả năng phản ứng rất mạnh, nên nếu tăng quá mức cho phép sẽ

gây ra những tổn thương tế bào làm phát sinh nhiều bệnh bệnh lý phức tạp Chính

vì thế mà trong cơ thể chúng ta hình thành hệ thống chất chống oxy hoá(antioxidant) có vai trò khử các chất oxy hoá và gốc tự do gây độc hại đến tế bào

 Định nghĩa:

Chất chống oxy hoá là chất có khả năng phân huỷ được các peroxide, oxyđơn bội, gốc tự do khác, dập tắt gốc tự do, hoặc ngăn chặn quá trình oxy hoá sinhhọc do một cơ chế gián tiếp nào khác Có thể có sẵn trong cơ thể hoặc được cungcấp bởi các thực phẩm hàng ngày

 Phân loại:

Chất chống oxy hoá đuợc chia thành 2 loại: Các chất chống oxy hoá có bảnchất enzyme và các chất chống oxy hoá không có bản chất enzyme

- Hệ thống chất chống oxy hoá có bản chất enzyme:

Trong cơ thể sống, phản ứng trong các dây truyền chuyển hoá thường sinh

ra gốc tự do nhưng thường xuyên đƣợc thu dọn nhờ enzyme có sẵn trong tế bàotrong đó có hồng cầu Một số loại enzyme: Superoxide dismutase (SOD),Catalase, Glutathion reductase (GR), Gluthion peroxidase (GPx)

- Hệ thống chất chống oxy hoá không có bản chất enzyme:

Polyphenol[15][16]

Hợp chất phenolic là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp của thực vật Đến nay

đã có hơn 8000 hợp chất polyphenol đã được xác định cấu trúc Các phân lớpchính của polyphenol gồm có: acid phenolic, flavonoid và tannin Đặc điểm cấutrúc chung của nhóm này là phân tử có một vòng thơm (vòng benzene) gắn trựctiếp với một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) Về mặt y học, việc sử dụng thựcphẩm giàu các hợp chất phenol như trà, rượu vang đỏ được chứng minh là có lợicho sức khỏe Tác dụng tốt này có được là do khả năng chống oxy hóa của các hợpchất phenol Một số nghiên cứu cho thấy polyphenol có tác dụng chống ung thư vàchống gây đột biến Do chúng can thiệp vào một số các bước dẫn đến sự phát triểncủa khối u ác tính, bất hoạt các chất gây ung thư, ức chế sự biểu hiện gen đột biến

và hoạt động của các enzyme tham gia vào sự kích hoạt procarcinogens (chất gâyhại cho ADN), và kích hoạt hệ thống enzyme chuyển hóa chất lạ xenobiotic thamgia giải độc

Flavonoid

Flavonoid là một hợp chất rất phổ biến trong thực vật, có bản chất hoá học

là những polyphenol, các flavonoid có hoạt tính sinh học được gọi là bioflavonoid

có khả năng chống oxy hoá cao.Các hợp chất flavonoid là tập hợp những chất cókhung cơ bản theo kiểu C6-C3-C6, trong đó có ít nhất một vòng benzen Nhữnglớp hợp chất flavonoid như là: flavan, flavonol, flavanonol, isoflavon, catechin,flavan-3,4 diol…Trong tự nhiên thường tồn tại dưới dạng glycoside, trong đó cómột hay nhiều nhóm hydroxyl phenolic gắn với phần đường qua liên kếtglycosidic Flavonoid có khả năng kìm hãm các hóa trình oxy hóa dây chuyền sinh

ra từ gốc tự do hoạt động Hoạt tính này phụ thuộc vào sự sắp xếp của các nhómchức trong phân tử (cấu hình phân tử) và và số lượng nhóm hydroxyl Sự có mặtcủa nhóm hydroxyl phenolic làm cho chúng có khả năng tương tác với protein.Nếu nhóm hydroxyl gắn trên vòng B thì hoạt tính loại gốc tự do mạnh nhất so vớikhi nhóm hydroxyl gắn trên vòng A hay vòng C Thêm vào đó, hoạt tính chốngoxy hóa được tăng lên khi trùng hợp các monome flavonoid thành dạng polyme

Ví dụ : proanthocyanidins (tannin ngưng tụ), các polyme của catechins là nhữngchất chống oxy hóa tuyệt vời, bởi có chứa một lượng lớn nhóm hydroxyl trongphân tử Ngoài ra, khả năng chống oxy hóa của proanthocyanidins còn phụ thuộcvào chiều dài của chuỗi oligomer và loại gốc tự do mà chúng phản ứng Flavonoidloại gốc tự do theo nhiều cách khác nhau như: loại trực tiếp gốc tự do hoạt động,kích thích các enzyme chống oxy hóa, tạo phức với kim loại, làm giảm bớt các α-tocopheryl, ức chế enzyme oxidase, giảm tress oxy hóa gây ra bởi oxit nitric, làmtăng acid uric hay làm tăng hoạt tính cho chất chống oxy hóa kém hoạt độnghơn…Chính những tác dụng này là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướngcho việc sử dụng các flavonoid để chữa bệnh

Hình 2 Những vị trí có hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid

- Một số lợi ích của flavonoid:[5]

Hoạt tính sinh học của flavonoid: Có tác dụng với khối u và một số dạng ungthư như enpatin (3,5,3'-trihydroxy-6,7,4'-trimetoxyflavon), enpatoretin (3,3'-dihydroxy -5,6,7,4'-tetrametoxyflavon); Nâng cao tính bền của thành mạch máunhư rutin; Có tác dụng estrogen như glycosid quecxetin và kaempferol- 3-3-ramnogalacto-7-ramnorid Ngoài các tác dụng trên, flavonoid còn có các tác dụngkhác như: chống dị ứng, chống co giật, giãn phế quản, giãn mạch, lợi mật, giảmđau và có tác dụng diệt nấm Một số dẫn chất của flavonoid có tác dụng thôngtiểu như quercetin (có trong lá diếp cá), kháng khuẩn như acvicularin Đặc biệt,flavonoid còn có hoạt tính vitamin P, làm bền những mao mạch và giảm tính giòncủa thành mạch

Các kết quả nghiên cứu khoa học đã kết luận rằng: tác dụng sinh học củaflavonoid là do khả năng chống oxy hoá của chúng quy định Do khả năng ức chếquá trình oxy hoá nênchúng có hiệu ứng chống u lành tính và u ác tính Cácflavonoid còn được ứng dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng như chốngviêm loét dạ dày, viêm mật cấp tính và mãn tính, viêm gan, thận, thương hàn, lị

- Khả năng loại gốc tự do:

Flavonoid có khả năng chống oxy hóa rất mạnh, chúng triệt tiêu các gốc tự

do sinh ra trong quá trình bệnh lý của cơ thể và tạo nên những gốc tự do của chúngbền vững hơn và không tham gia vào dây chuyền phản ứng gốc Nhờ thế oxy hóakhử thấp nên flavonoid (Fl-OH) có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyl vàhydroxyl bằng cách nhường nguyên tử hydro

Fl-OH + R Fl-O +RH (Với R là gốc tự do)

Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạothành hợp chất bền.

Hình 3 Flavonoid trung hòa gốc tự doVitamin C

Vitamin C có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyểncho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của nó và khi đó nó trở thànhdehydroascorbic acid

Ngoài khả năng vô hoạt trực tiếp gốc tự do, vitamin C còn có khả năng tăngtác dụng chống oxy hóa của các chất khác trong cơ thể như vitamin E, carotenoid

và flavonoid Khi có sự tiếp xúc giữa vitamin E và gốc tự do peroxide của acidbéo, vitamin E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhưng đồng thời nó trở thànhgốc tự do tocopheryl (vitamin E ở dạng oxy hóa) Vitamin C tiến hành khử gốctocopheryl thành vitamin E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxidemới Các carotenoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ chếtương tự bởi vitamin C Điều này góp phần hạn chế sự tự kích thích oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitamin E và flavonoid

5.Tổng quan về các phương pháp

5.1 Phương pháp trích ly

Trong phạm vi bài nghiên cứu này, chúng chúng tôi chọn phương pháp trích

ly flavonoid bằng kĩ thuật trích ly dùng dung môi lỏng, cụ thể là kĩ thuật trích lypha lỏng – rắn (solid – liquid extraction) vì những ưu điểm và sự thuận tiện mà nómang lại Trích ly bằng dung môi lỏng là phương pháp truyền thống và được sửdụng phổ biến nhất hiện nay để trích ly flavonoid từ các mẫu nguyên liệu thực vật,với các đặc điểm dễ dàng sử dụng, hiệu quả và đối tượng mẫu áp dụng rộng rãi.Lượng chất trích ly được phụ thuộc vào từng loại dung môi phân cực khác nhau,thời gian và nhiệt độ trích ly, tỉ lệ nguyên liệu mẫu so với lượng dung môi cũngnhư thành phần hóa học và đặc tính vật lý của mẫu Và hiển nhiên độ tan của hợpchất phenolic bị chi phối bởi bản chất hóa học của mẫu thực vật cũng như sự phâncực của loại dung môi sử dụng Ngoài ra, số lượng và chất lượng sau khi thu hồi

của các hợp chất flavonoid trích ly được cũng bị ảnh hưởng bởi thời gian và nhiệt

độ trích ly Sự tăng nhiệt độ có thể thúc đẩy quá trình hòa tan hay làm tăng vận tốchòa tan các chất trích ly vào dung môi, tăng động lực truyền khối cả quá trình; bêncạnh đó, độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi cũng sẽ giảm ở nhiệt độ caohơn, cải thiện khả năng trích ly Tuy nhiên, hợp chất flavonoid có thể dễ dàng bịphân hủy và bị oxy hóa Thời gian trích ly lâu và nhiệt độ cao làm tăng khả năngoxy hóa flavonoid

Một số loại dung môi như methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate và hỗnhợp phối trộn các loại dung môi này và thường có sự kết hợp ở các tỉ lệ khác nhauvới nước, đã được dùng để trích ly hợp chất flavonoid từ nguyên liệu thực vật.Việc lựa chọn chính xác loại dung môi cũng như chế độ trích ly phù hợp quyếtđịnh đến số lượng và chất lượng flavonoid trích ly được

5.2 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa

Vai trò chống oxy hóa của hợp chất flavonoid thể hiện qua khả năng choelectron hoặc nguyên tử hydro đến các gốc tự do hiện diện trong mẫu, điều này sẽlàm ngừng chuỗi phản ứng không mong muốn diễn ra trong quá trình oxy hóa

(Tsao và Deng, 2004).

Gốc tự do được hình thành khi oxy bị chuyển hóa thành dạng cấu trúc hóahọc đặc biệt với một electron đơn lẻ hoặc đôi khi là một vài electron ở lớp vỏngoài của phân tử Với cấu trúc như vậy nên các gốc tự do có độ hoạt động cao và

có thể phản ứng với protein, lipid, carbohydrate và DNA Các gốc tự do này sẽ tấncông vào các phân tử ổn định ở gần nó nhất và lấy các electron của chúng Khiphân tử bị tấn công công mất electron thì nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, tiếptục bắt đầu chuỗi phản ứng tương tự Phương pháp xác định hoạt tính chống oxyhóa của một chất thường dựa trên phản ứng trực tiếp của phân tử chất đó với gốc

tự do hoặc trong phản ứng với các kim loại chuyển tiếp (RiceEvan và cộng sự, 1996; Antolovich và cộng sự, 2002; Re và cộng sự, 1999, Record và cộng sự, 2001) Việc xác định hoạt tính chống oxy hóa là một cách để xác định giá trị về

mặt sinh học và dinh dưỡng của thực phẩm

Có rất nhiều phương pháp để xác định hoạt tính chống oxy hóa, bao gồm

phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH (Nagaraja, 2008), ABTS (Leong, Shui, 2002; Miller, Rice-Evans, 1997; Kriengsak và cộng sự, 2006), hydroxy peroxide (Tatjana Kadifkova Panovska, 2005) khả năng khử sắt (Huda và cộng sự, 2009),

sử dụng hệ β-carotene – acid linoleic (Moure và cộng sự, 2000)… Trong đó,

phương pháp sử dụng sử dụng gốc tự do DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) làphương pháp có thể thực hiện việc kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa một cáchnhanh chóng, đơn giản và chính xác Đây là phương pháp có thể sử dụng được cho

cả mẫu ở dạng rắn và lỏng, và được dùng để xác định năng lực chống oxy hóa chotổng thể mẫu thử chứ không dùng để xác định khả năng chống oxy hóa riêng của

một thành phần nào (Koleva và cộng sự, 2001)

Phương pháp DPPH dựa trên khả năng làm giảm các gốc tự do DPPH diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH là một gốc tự do ổn định ở nhiệt độ phòng, tạothành dung dịch có màu tím trong các loại dung môi rượu như methanol, ethanol,

(2,2-… khi các gốc tự do này phản ứng với chất chống oxy hóa, số lượng gốc tự do sẽ

bị giảm và chúng sẽ chuyển sang màu vàng Độ giảm hàm lượng gốc tự do đượcxác định bằng cách đo quang phổ hấp thụ với bước sóng hấp thu cực đại đặc trưngcho màu tím của gốc tự do DPPH Thông thường, độ hấp thụ sử dụng trong

phương pháp này được xác định ở bước sóng từ 515 – 520nm (Bandoniene và cộng sự, 2002; Pavlov và cộng sự, 2002) Khi dung dịch DPPH được trộn với các

cơ chất có khả năng nhường nguyên tử hydro (chất chống oxy hóa), DPPH thunhận nguyên tử hydro này và chuyển thành dạng chất bị khử Cơ chế được mô tảtheo phản ứng minh họa sau:

Trong đó, Z● đại diện cho gốc tự do DPPH, AH đại diện cho các phân tử

có khả năng cho nguyên tử hydro, ZH là dạng bị khử và A● là gốc tự do mớiđược hình thành Điều đó có nghĩa là số lượng gốc DPPH sẽ giảm (bị mất màutím) và bị thay thế bằng dạng bị khử (có màu vàng) Các gốc tự do A● này tiếptục liên kết với nhau, ngăn chặn chuỗi phản ứng oxy hóa

Nhận xét: cứ hai phân tử AH sẽ phản ứng với hai gốc tự do DPPH để hìnhthành 1 phân tử A-A mới, vậy tỉ lệ phản ứng giữa DPPH với cơ chất dạng AH là1:1 Cơ chất AH đại diện cho các hợp chất chống oxy hóa mà trong phân tử có khảnăng nhường 1 nguyên tử hydro Nếu trong phân tử của chất chống oxy hóa có hainhóm –OH (ví dụ: acid ascorbic), tức chúng có khả năng cho hai nguyên tử hydro

thì tỉ lệ này sẽ thay đổi tương ứng là 2:1 (Phillip, 2004) Cơ chế được mô tả qua

hai phương trình sau:

Và tương tự để áp dụng cho các hợp chất polyphenol có nhiều nhómhydroxyl.

Hình 1.13 Gốc tự do DPPH trước và sau khi nhận nguyên tử hydroVới các cơ chế đã nêu, để xác định hoạt tính chống oxy hóa, người ta xâydựng đường chuẩn trên cơ sở cho DPPH phản ứng với chất cần xác định hoạt tính

và ghi nhận lại độ giảm hàm lượng gốc tự do DPPH ứng với độ giảm giá trị hấpthụ của mẫu đo quang Một trong những tham số được đưa ra để giải thích kết quả

từ phương pháp DPPH nói riêng và nhiều phương pháp xác định hoạt tính khácnói chung là giá trị EC50 – “efficient concentration” (cách gọi khác là IC50) Giátrị này được định nghĩa là nồng độ của cơ chất (chất chống oxy hóa) có thể làm

giảm 50% lượng DPPH (hay 50% độ màu) (Brand-Williams và cộng sự, 1995; Bondet và cộng sự, 1997).

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

a Thời gian nghiên cứu:

Đề tài được nghiên cứu trong vòng 6 tháng

Thời gian tiến hành làm đồ án được chia làm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Thời gian tiến hành thí nghiệm trích ly hợp chất flavonoid trong lásen

- Giai đoạn 2: Thời gian tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxi hóa củaflavonoid trích ly được

 Giai đoạn 1: thời gian tiến hành thí nghiệm trích ly hợp chất flavonoid trong lá senđược tiến hành từ ngày 1/11/2016 đến ngày 20/11/2016 Cụ thể như sau:

- Thí nghiệm 1, 2, 3 tiến hành cùng lúc và mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần tiếnhành từ ngày 1/11/2016 đến ngày 20/ 11/2016

 Giai đoạn 2: Thời gian tiến hành thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxi hóa củaflavonoid trích ly được

- Thí nghiệm cho phương pháp 1 cũng được lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày20/11/2016 đến ngày 27/11/2016

- Thí nghiệm cho phương pháp 2 lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 28/11/2016 đếnngày 5/12/2016

- Thí nghiệm cho phương pháp 3 lặp lại 3 lần tiến hành từ ngày 6/12/2016 đến ngày13/12/2017

Thời gian còn lại sẽ làm lại những thí nghiệm làm sai hoặc thay đổi phương pháplàm để có kết quả tốt nhất và tiến hành viết báo cáo Hoàn chỉnh đồ án vào ngày

30 tháng 3 năm 2017

b Địa điểm nghiên cứu:

Đề tài được thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm F7.7, Viện Công nghệ Sinh học-Thực phẩm của trường Đại học Công nghiệp TP.HCM

2 Nguyên vật liệu và thiết bị, dụng cụ-hóa chất

a Nguyên liệu

Lá sen được lấy ở hồ trên đường đại lộ Võ Văn Kiệt, quận 6

Các mẫu được chuẩn bị theo chế độ sấy đã khảo sát, được nghiền theo kích thước500µm, đóng gói và hút chân không bảo quản để thực hiện cho các khảo sát tiếp theo.

Hình 2.1 Hồ sen ở Võ Văn Kiệt

b Thiết bị, dụng cụ-hóa chất

Thiết bị:

 Máy đo ẩm hồng ngoại:

- Thang đo: 0 – 100 % RH, khối lượng mẫu đo: 0,5 – 120 g

- Nhiệt độ sấy: 30 – 180 oC

- Thời gian cài đặt: 1 – 240 phút

- Nguồn điện hoạt động: AC 220V 50/60 Hz

- Công suất sấy: 900 W

 Máy so màu UV-Vis:

- Giới hạn bước sóng: 200 nm – 800 nm

- Độ chính xác buớc sóng: ± 2 nm

- Chức năng: A; T; C, điện tử hiện số

- Khoảng truyền quang: 0 - 100 % T

- Nguồn điện: 220 V AC / 50 Hz

 Máy Đo Màu Minolta:

- Không gian màu: Lab, XYZ, Yxy, LCh,

- Dãy quang phổ: 400 - 700 nm

- Nguồn sáng: A, C, D50, D65, F2, F6, F7, F8, F11, F12

- Công thức sai lệch màu: d*ab, d94, d00

- Góc chụp: 2 và 100

- Đầu đo: MAV 8/11 mm, SAV 3/6 mm

- Sai số giữa 2 chế độ MAV /SAV: d*ab < 0,2

- Sai số lần đo: d*ab < 0,02

- Nguồn điện sử dụng: adapter hoặc pin AA

 Máy sấy khay:

- Điện áp: 220V, 50Hz

- Công suất tiêu thụ: 1,5 kW

- Nhiệt độ: 0 – 300 0C

- Năng suất: 3 - 8kg/ lần

 Máy xay mẫu

 Máy cô quay

và được trình bày dưới dạng Mean ± SD.

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mỗi thí nghiệm có độ lặp lại là 3 lần để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm

3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu cho hàm lượng flavonoid

- Khối lượng nguyên liệu đem sấy: 360g/mẻ

- Hàm ẩm của nguyên liệu sau khi sấy: 12%

- Số khay đựng mẫu mỗi lần sấy: 3 khay

- Khối lượng trên mỗi khay: 120g/khay

- Khối lượng nguyên liệu của từng nhiệt độ sấy: 5g

- Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi là 1:30 (w/v)

- Loại dung môi trích ly: methanol

- Thời gian trích: 1 giờ

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng

3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu:dung môi cho hàm lượng

flavonoid cao nhất

 Mục đích:

Khảo sát sự thay đổi của hàm lượng flavonoid theo từng tỉ lệ nguyên liệu:dung môi,chọn ra tỉ lệ nguyên liệu:dung môi thích hợp cho hàm lượng flavonoid là cao nhất

 Thông số cố định:

- Khối lượng nguyên liệu: 5g

- Loại dung môi: methanol 70o

- Thời gian trích ly: 1 giờ

 Thông số thay đổi:

Tỉ lệ nguyên liệu : dung môi: 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60 (w/v)

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng

3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng trích ly flavonoid từ lá sen bằng dung môi nước

 Mục đích:

- Khảo sát hàm lượng flavonoid theo dung môi trích ly là nước

 Thông số cố định:

- Khối lượng nguyên liệu: 5g

- Loại dung môi: nước

- Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: kết quả phù hợp từ thí nghiệm khảo sát tỉ lệnguyên liệu:dung môi

- Thời gian trích ly: 1 giờ

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng

3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ dung môi cồn trích ly cho hàm lượng flavonoid

là cao nhất

 Mục đích:

- Khảo sát sự thay đổi hàm lượng flavonoid theo nồng độ dung môi cồn trích ly

- Xác định nồng độ dung môi cồn trích ly thích hợp cho hàm lượng flavonoid làcao nhất

 Thông số cố định:

- Khối lượng nguyên liệu: 5g

- Loại dung môi: cồn

- Tỉ lệ nguyên liệu:dung môi: kết quả phù hợp từ thí nghiệm khảo sát tỉ lệnguyên liệu:dung môi

- Thời gian trích ly: 1 giờ

 Thông số thay đổi:

- Nồng độ dung môi: 40o, 50o, 60o, 70o, 80o

Hàm mục tiêu: Hàm lượng flavonoid tổng

- [4]