Hóa sinh Phân lập các hợp chất chính có tác dụng chống oxi hóa trong lá chùm ngây (Moringa oleifera lam.)

Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng Bảng 2.7: Quy trình thử hoạt tính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

SALIHAH

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT CHÍNH

CÓ TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY

(MORINGA OLEIFERA LAM.)

Chuyên ngành: Hóa Sinh

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA SINH

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Công Luận

Tp HCM, tháng 09 năm 2011

LỜI CÁM ƠN

Luận văn này được hoàn thành, đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến:

∗ PGS TS Trần Công Luận, người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng,

động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

∗ Tập thể các thầy cô trong Bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TP HCM đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức nền tản quý báu cho tôi

∗ Các thầy cô, anh chị và các bạn ở Trung tâm Sâm và Dược liệu TP HCM đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và môi trường làm việc vui vẻ trong thời gian tôi thực hiện đề tài ở đây

∗ Thầy Lương Văn Thanh, chị Lê Thị Thao, chị Thái Thị Cẩm Nguyệt và các anh chị, bạn bè đồng nghiệp của trường THPH Thủ Thiêm đã động viên, hỗ trợ về vật chất lẫn tinh thần, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học Cao học

∗ Anh Văn Đức Thịnh và các bạn học viên lớp Hóa sinh K18 đã cùng chia sẽ buồn vui, cổ vũ tinh thần cho tôi những lúc tôi gặp khó khăn

∗ Cám ơn gia đình luôn là động lực cho tôi phấn đấu trên bước đường của mình

Xin chân thành cảm ơn!

Salihah

Tp Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2011

Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam

Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng

Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic

Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng

Bảng 2.7: Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do

Bảng 3.1: Kết quả giảm khối lượng do sấy khô

Bảng 3.2: Tỷ lệ giữa cọng và lá chét

Bảng 3.3: Độ ẩm bột dược liệu

Bảng 3.4: Độ tro toàn phần

Bảng 3.5: Độ tro không tan trong HCl

Bảng 3.6: Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật trong lá Chùm Ngây

Bảng 3.7: Hiệu suất thu cao toàn phần từ lá Chùm Ngây

Bảng 3.8: Kết quả thu cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng

Bảng 3.9: Kết quả định tính hóa học các cao phân đoạn

Bảng 3.10: Mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD758nm

Bảng 3.11: Hàm lượng phenolic tổng trong cao tổng cồn và cao phân đoạn

Bảng 3.12: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cồn tổng

Bảng 3.13: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao eter

Bảng 3.14: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cloroform

Bảng 3.15: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao etyl acetat

Bảng 3.16: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao nước

Bảng 3.17: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitamin C

Bảng 3.20: Các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển Bảng 3.21: Thông số phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO)

của chất I đối chiếu với vitexin Bảng 3.22: Thông số phổ 1H (500 MHz, DMSO) và 13C-NMR (125 MHz, DMSO)

của chất II đối chiếu với isoquercitrin Bảng 3.23: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitexin Bảng 3.24: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên isoquercitrin Bảng 3.25: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do của vitexin và isoquercitrin Bảng 3.26: Năng lực khử của vitexin và isoquercitrin

Bảng 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin Bảng 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và

isoquercitrin

Hình 1.1: Chùm Ngây Moringa oleifera Lam

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây tươi

Hình 3.1: Quy trình chiết cao cồn tổng và thu cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây

Hình 3.2: Đường chuẩn acid gallic

Hình 3.3: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 1)

Hình 3.4: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 2)

Hình 3.5: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng

Hình 3.6: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao eter

Hình 3.7: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cloroform

Hình 3.8: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao etyl acetat

Hình 3.9: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước

Hình 3.10: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitamin C

Hình 3.11: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng và các

cao phân đoạn

Hình 3.12: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn etyl acetat hệ 2

Hình 3.13: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn C1, C2 từ sắc ký nhanh – cột khô (hệ 1)

Hình 3.14: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn E1, E2, E3, E4 từ sắc ký nhanh – cột khô,

(hệ 1)

Hình 3.15: Sắc ký lớp mỏng phân đoạn EM từ sắc ký nhanh – cột khô (hệ 1)

Hình 3.16: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn thu được từ sắc ký cột cổ điển (hệ 1)

Hình 3.22: Công thức cấu tạo của chất I và chất II

Hình 3.24: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của isoquercitrin Hình 3.25: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin và

isoquercitrin so với vitamin C Hình 3.26: Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và vitamin C Hình 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin Hình 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do

GAE: Gallic acid equivalent – đương lượng acid gallic

HTCO: Hoạt tính chống oxi hóa

Do đó chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng và không thể thiếu trong phác đồ điều trị cũng như liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác tính Vì thế trong thời gian gần đây, chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên ngày càng thu hút nhiều sự quan tâm

Bên cạnh đó, Chùm Ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất

được quan tâm về hoạt tính chống oxy hóa Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã và đang thực hiện nhằm làm rõ hoạt tính này của Chùm Ngây Trong khi đó, tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng này chỉ mới bắt đầu và mang tính khảo sát sơ nét về thành phần hóa học Một vài nghiên cứu dược lý về hoạt tính chống oxy hóa của Chùm Ngây cũng được thực hiện Tuy nhiên, chưa nghiên cứu nào trong nước chuyên sâu về thành phần hóa học của Chùm Ngây, cụ thể là xác định cơ chế hóa học của khả năng chống oxy hóa của Chùm Ngây Để tìm hiểu sâu hơn về khả năng chống oxy của Chùm Ngây, nhằm sử dụng loài cây này hiệu quả hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm Ngây như một loại thuốc hay thực

phẩm chức năng chống oxy hóa, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập các hợp

chính có tác dụng chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây (Moringa oleifera L.)”

Đề tài được thực hiện gồm các nội dung sau:

- Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

- Phân lập các hợp chất chính có trong lá Chùm Ngây Dự kiến kết quả:

phân lập được 2 hợp chất chính trong lá Chùm Ngây

- Xác định cấu trúc của các chất phân lập được thông qua các phương pháp

phổ Dự kiến kết quả: xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất chính

trong lá Chùm Ngây

- Thử hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được

Nhằm mục đích phân lập được các hoạt chất có khả năng chống oxy hóa có

trong lá cây Chùm Ngây

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây Chùm Ngây:

1.1.1 Danh pháp và phân loại:

Chùm ngây, hay còn gọi là Chùm ngây cải ngựa, có tên khoa học là

Moringa oleifera Lam., nằm trong hệ thống phân loại như sau [50]:

Moringa oleifera Lam Loài cây này được trồng nhiều nơi trong khu vực nhiệt đới,

và là loài duy nhất của chi Moringa có mặt tại Việt Nam [2]

Quả nang treo, có thiết diện tam giác, dài 25 – 30 cm hay hơn, mở làm 3

1.1.3 Sinh thái học và phân bố:

Chùm ngây là loài cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khô

và có khả năng chịu hạn hán Theo một số báo cáo thì chi Chùm Ngây chịu được nhiệt độ từ 18,7 – 28,5oC và pH khoảng 4,5 – 8 [6]

Cây có nguồn gốc ở Tây Bắc Ấn Độ, sau được đưa vào trồng rộng rãi ở Ấn

Độ, Hy Lạp, Philippin, Thái Lan, Malaysia, Pakistan, Singapore, Cuba, Nigeria Hiện nay tồn tại quần thể Chùm ngây mọc hoang ở cận Hymalaya, từ vùng Chenab đến phía đông của Sarda (Ấn Độ) [2] Ngoài ra, người ta còn tìm thấy Chùm Ngây phân bố ở châu Phi, Madagascar

Ở nước ta, cây này mọc hoang hoặc được trồng ở các tỉnh phía Nam từ Đà Nẵng, Nha Trang, Phan Thiết vào đến Kiên Giang và cả đảo Phú Quốc [2]

1.1.4 Thành phần hóa học:

Rễ cây Chùm Ngây

Chứa các hợp chất glucosinolat như: 4-(α-L-rhamnosyloxy) benzyl glucosinolat (khoảng 1%), sau khi chịu tác động của enzym myrosinase sẽ cho 4- (α-L-rhamnosyloxy) benzylisothiocyanat, glucotropaeolin (khoảng 0.05%) và benzylisothiocyanat [16]

Nhựa cây Chùm Ngây (Gôm)

Gôm chiết từ vỏ cây có chứa arabinose, galactose, acid glucuronic và vết rhamnose Từ gôm, chất leucoanthocyanin đã được chiết và xác định là leucodelphinidin , galactopyranosyl, glucopyranosid [50]

Lá cây Chùm Ngây

Chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và phenolic như kaempferol 3-O- α -rhamnosid, kaempferol, syringic acid, gallic acid, rutin, quercetin 3-O-β- glucosid Các flavonol glycosid được xác định đều thuộc nhóm kaempferid nối kết với các rhamnosid hay glucosid [39]

Hoa Chùm Ngây

Hoa chứa polysaccharid được dùng làm chất phụ gia trong kỹ nghệ dược

phẩm [50]

Hạt cây Chùm ngây

Hạt chứa glucosinolat như trong rễ, có thể lên đến 9% sau khi hạt đã được

khử chất béo Các acid loại phenol carboxylic như 1- β - D - glucosyl 2, 6 dimethyl

benzoat Ngoài ra hạt còn chứa chất béo (33 – 38%) được dùng trong dầu ăn và kỹ

nghệ hương liệu, thành phần chính gồm các acid béo như acid oleic (60 – 70 %),

acid palmitic (3 – 12 %), acid stearic ( 3 – 12 %) và các acid béo khác như acid

behenic, acid eicosanoic và acid lignoceric [1]

Chùm ngây là mặt hàng thực phẩm quan trọng, được chú ý đến như là một

nguồn dinh dưỡng tự nhiên của vùng nhiệt đới Lá Chùm ngây giàu β-caroten,

protein, vitamin C, calcium, kali và dồi dào chất chống oxi hóa tự nhiên như acid

ascorbic, flavonoids, phenolic và carotenoid [36]

Kết quả phân tích hàm lượng dinh dưỡng của quả, lá tươi và bột khô

của lá cây Chùm Ngây có thể được tóm tắt như bảng 1.1 [13]

Bảng 1.1: Hàm lượng dinh dưỡng của Chùm Ngây Moringa oleifera Lam

STT THÀNH PHẦN DINH

DƯỠNG/100gr

TRÁI TƯƠI LÁ TƯƠI

BỘT LÁ KHÔ

Pakistan dùng vỏ rễ dùng sắc lấy nước trị đau răng, đau tai Hay rễ tươi của câynon dùng trị nóng sốt, phong thấp, gout, sưng gan và lá lách

Vỏ thân Chùm Ngây

Vỏ cây được dùng điều trị chứng thiếu vitamin C, đôi khi dùng trị tiêu chảy

Ở Ấn Độ, người ta hay dùng vỏ thân chùm ngây để trị nóng sốt, đau bao tử, đau bụng khi có kinh, sâu răng, làm thuốc thoa trị hói tóc, chữa đau cổ họng (dùng chung với hoa của cây nghệ, hạt tiêu đen), trị tiểu ra máu, trị thổ tả [17]

Vỏ cây được người dân Campuchia dùng làm thuốc cho phụ nữ sau khi sinh

đẻ uống như là nước chóng lại sức

Vỏ thân được Thái Lan dùng làm thuốc thông hơi

Hay người dân Pakistan dùng vỏ thân để phá thai bằng cách đưa vào tử cung, gây giãn nở

Nhựa cây có công dụng giảm đau, chống sưng tấy

Lá Chùm Ngây

Lá dùng uống để điều trị chứng hạ huyết áp và vò xát vào vùng thái dương

để trị chứng nhức đầu

Lá còn được dùng để điều trị các vết cắt ở da, vết trầy xướt, sưng tấy, nổi

mẩn ngứa hay các dấu hiệu của lão hóa da

Dịch chiết từ lá có tác dụng chống nhiễm trùng da Nó cũng được dùng để

điều khiển lượng đường máu trong trường hợp bị bệnh tiểu đường Dịch chiết từ lá

có thêm nước cà-rốt là một thức uống lợi tiểu [6]

Bột làm từ lá tươi có khả năng cung cấp năng lượng làm cho năng lượng

tăng gấp bội khi dùng thường xuyên Lá cũng được dùng chữa sốt, viêm phế quản,

viêm nhiễm mắt và tai, viêm màng cơ, diệt giun sán và làm thuốc tẩy xổ Sản phụ

ăn lá sẽ làm tăng tiết sữa Ở Philippines lá được chỉ định dùng chống thiếu máu, do

chứa lượng sắt cao [7]

Dùng lá giã nát đắp lên vết thương bị sưng, nhọt; trộn với mật ong để đắp

lên bên ngoài mắt trị mắt sưng đỏ

Ở Pakistan dùng lá giả nát đắp lên vết thương, trị sưng và nhọt, đắp và bọng

dịch hoàn để trị sưng

Hoa Chùm Ngây

Hoa Chùm Ngây được Ấn Độ dùng làm thuốc bổ, lợi tiểu

Quả, hạt Chùm Ngây

Quả dùng trị bệnh đau gan và tỳ, đau khớp, uốn ván và chứng liệt

Ấn Độ dùng quả Chùm Ngây giã kỹ với gừng và lá Justicia gendarussa

làm thuốc đắp trị gẫy xương

Hạt điều trị bệnh viêm dạ dày Dầu hạt được dùng ngoài để điều trị nấm da

Trường Đại học San Carlos ở Guatemala đã tìm ra một loại kháng sinh có tác dụng

như neomycin có khả năng bảo vệ da khỏi sự viêm nhiễm do Staphylococcus

aureus Loại kháng sinh này là một hỗn hợp kháng khuẩn và nấm có tên

pterygospermin, danh pháp hóa học là glucosinolat 4 alpha-L-rhamnosyloxy benzyl

isothiocyanat [40] Nhiều nơi trên thế giới dùng bột nghiền từ hạt để khử trùng nước

sông, nước sông trong mùa lũ có tổng số trực trùng Escherichia coli lên tới 1.600 -

18.000 / 100 ml, được xử lý bằng bột hạt Chùm Ngây trong vài giờ đồng hồ đã giảm xuống còn 1 - 200 / 100 ml

Hạt còn dùng trị chứng trướng bụng, khó tiêu và còn có tác dụng giảm đau

Ở Philippines, chúng được xem là bạn thân của các bà mẹ vì có tác dụng làm lợi sữa

1.2 Tình hình nghiên cứu cây Chùm Ngây 1.2.1 Trên thế giới:

Hoạt tính kháng nấm gây bệnh

Nghiên cứu tại Institute of Bioagricultural Sciences, Academia Sinica, Đài Bắc (Đài Loan) ghi nhận dịch chiết từ lá và hạt Chùm Ngây bằng etanol có các hoạt

tính diệt được nấm gây bệnh loại Trichophyton rubrum, Trichophyton

mentagrophyte , Epidermophyton floccosum và Microsporum canis

Rễ Chùm Ngây có hoạt tính kháng khuẩn và chứa nhiều các hợp chất kháng khuẩn Yếu tố kháng vi sinh vật là pterygospermin, có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm mạnh Phức hợp tương tự, liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cũng được tìm thấy ở hoa Dịch chiết rễ cũng có hoạt tính chống vi sinh vật do sự có mặt của hợp chất 4- α-L-rhamnosyloxybenzyl isothiocyanat Aglycon của deoxy-niazimicin [N-benzyl, S-ethyl thioformat] phân lập từ phân đoạn cloroform của dịch chiết etanol vỏ rễ cũng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm [20]

Tác dụng của quả Chùm Ngây trên cholesterol và lipid trong máu

Nghiên cứu tại Đại học Baroda, Kalabhavan, Gujarat (Ấn Độ) về hoạt tính trên các thông số lipid của quả Chùm Ngây, thử trên thỏ, ghi nhận: Thỏ cho ăn Chùm Ngây (200mg/kg mỗi ngày) hay uống lovastatin (6mg/kg/ngày) trộn trong một hỗn hợp thực phẩm có tính cách tạo cholesterol cao, thử nghiệm kéo dài 120 ngày Kết quả cho thấy Chùm Ngây và lovastatin có tác dụng làm hạ cholesterol, phospholipid, triglycerid, VLDL (very low density lipoprotein), LDL (low density lipoprotein) hạ tỷ số cholesterol/phospholipid trong máu so với thỏ trong nhóm đối chứng [40]

Metyl phydroxybenzoat và β-sitosterol trong quả Chùm Ngây đã được

nghiên cứu và chứng minh là có hoạt tính làm giảm huyết áp [44] Rễ, lá, hoa, chất

gôm, dịch chiết nước hạt Chùm Ngây đều có hoạt tính lợi tiểu, và những phức hợp

có tính lợi tiểu này có khả năng đóng vai trò bổ sung cho hoạt tính hạ huyết áp của

loài cây này [27]

Dịch chiết thô lá Chùm Ngây có hoạt tính làm giảm đáng kể cholesterol

trong huyết thanh của chuột thí nghiệm có chế độ ăn giàu chất béo Được cho là do

sự có mặt của thành phần hóa học β-sitosterol Quả Chùm Ngây làm giảm bớt

cholesterol, phospholipid, triglycerid, LDL, VLDL, làm giảm các chỉ số lipid gây

xơ vữa động mạch, giảm lipid trong gan, tim, động mạch chủ của thỏ bị tăng

cholesterol huyết và làm gia tăng sự bài tiết cholesterol qua phân [6]

Các hoạt tính chống co thắt và bảo vệ gan

Dịch chiết bằng nước nóng của hoa, lá, rễ, hạt, vỏ thân Chùm Ngây đã được

nghiên cứu tại Trung Tâm Nghiên cứu Kỹ Thuật (CEMAT) tại Guatamala City về

các hoạt tính dược học, thử trên chuột Hoạt tính chống co giật được chứng minh

bằng thử nghiệm trên chuột đã cô lập, hoạt tính chống sưng thử trên chân chuột bị

gây phù bằng carrageenan và tác dụng lợi tiểu bằng lượng nước tiểu thu được khi

chuột được nuôi nhốt trong lồng Nước trích từ hạt cho thấy tác động ức chế khá rõ

sự co giật gây ra bởi acetylcholin ở liều ED50= 65.6 mg/ml môi trường; tác động ức

chế phụ gây ra do carrageenan được định ở 1000mg/kg và hoạt tính lợi tiểu cũng ở

1000 mg/kg

Những nghiên cứu về tính dược lý của lá Chùm Ngây đã được tiến hành rộng

rãi, cho thấy những thành phần trong dịch chiết cồn có hoạt tính chống co thắt,

thông qua việc phong tỏa kênh calci Hoạt tính chống co thắt của dịch chiết cồn lá

Chùm Ngây là do sự có mặt của hợp chất 4-[α-[L-rhamnosyloxy] benzyl]-o-metyl

thiocarbamat [27] Đây là cơ sở để lý giải vì sao lá Chùm Ngây được dùng để chữa

bệnh tiêu chảy trong y học dân gian Ngoài ra, hoạt tính chống co thắt từ những

thành phần khác nhau còn là cơ sở dược lý để loài cây này được sử dụng trong điều

trị rối loạn nhu động ruột Dịch chiết metanol lá Chùm Ngây thể hiện hoạt tính

chống viêm loét và bảo vệ gan trên chuột Dịch chiết nước của lá cũng có hoạt tính chống viêm loét cho thấy rằng những phức hợp chống viêm loét là phổ biến trong loài cây này Cũng có những nghiên cứu công bố rễ Chùm Ngây có hoạt tính bảo vệ gan Dịch chiết nước và dịch chiết cồn hoa Chùm Ngây cũng có hoạt tính bảo vệ gan đáng kể, có thể là do sự có mặt của quercetin, một loại flavonoid phổ biến với hoạt tính bảo vệ gan [28]

Các chất gây đột biến gen từ hạt Chùm Ngây rang chín

Một số các hợp chất các chất gây đột biến gen đã được tìm thấy trong hạt Chùm ngây rang chín: Các chất quan trọng nhất được xác định là 4 (α Lrhamnosyloxy) phenylacetonitril; 4-hydroxyphenylacetonitril và 4-hydroxyphenyl-acetamid [6]

Khả năng ngừa thai của rễ Chùm Ngây

Nghiên cứu tại Đại học Jiwaji, Gwalior (Ấn Độ) về các hoạt tính kháng estrogen, ngừa thai của nước chiết từ rễ Chùm Ngây ghi nhận chuột đã bị cắt buồng trứng, cho uống nước chiết, có sự gia tăng trọng lượng của tử cung Khi cho chuột uống nước chiết này chung với estradiol dipropionat (EDP) thì có sự tiếp nối tụt giảm trọng lượng của tử cung so sánh với sự gia tăng trọng lượng khi chỉ cho chuột uống riêng EDP Trong thử nghiệm deciduoma liều cao nhất 600mg/kg có tác động gây rối loạn sự tạo deciduoma nơi 50 % số chuột thử Tác dụng ngừa thai của rễ Chùm Ngây được cho là do nhiều yếu tố phối hợp

Hoạt tính kháng khuẩn của hạt Chùm Ngây

4 - (α-L-Rhamnosyloxy)benzyl isothiocyanat được xác định là có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trong các hoạt chất trích từ hạt Chùm Ngây (trong hạt Chùm Ngây còn có benzyl isothiocyanat) Hợp chất trên ức chế sự tăng trưởng của

nhiều vi khuẩn và nấm gây bệnh Nồng độ tối thiểu để ức chế Bacillus

subtilis là 56 micromol/l và để ức chế Mycobacterium phlei là 40 micromol/l

[16] Dịch ép vỏ thân cũng thể hiện hoạt tính kháng Staphylococcus aureus Dịch

ép lá tươi cũng ức chế sự sinh trưởng của Pseudomonas aeruginosa và

Staphylococcus aureus [20]

Hoạt tính kháng khối u và ung thư

Makonnen và cộng sự đã phát hiện lá Chùm Ngây có tiềm năng chống khối

u Hợp chất o- etyl- 4- rhamnosyloxy] benzyl carbamat cùng với 4

[α-L-rhamnosyloxy]- benzyl isothiocyanat, niazimicin và 3- O- [6′- O- oleoyl- α-

D-glucopyranosyl]- β-sitosterol đã được khảo sát hoạt tính chống khối u, sử dụng mô

hình phân tích in vitro [29] Kết quả cho thấy chúng có hiệu quả ức chế đáng kể

virus Epstein – Bar Niazimicin đã được đề nghị là chất có hiệu lực ngăn ngừa

những tác nhân hóa học gây ung thư Dịch chiết hạt Chùm Ngây cũng được nhận

thấy là có hoạt tính chuyển hóa chất gây ung thư gan, chống oxi hóa và kháng khối

u trên da của chuột thí nghiệm [14]

1.2.2 Tại Việt Nam:

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam bắt đầu có những nghiên cứu tập

trung vào đối tượng Chùm Ngây, chủ yếu là các nghiên cứu về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý, nhằm có những biện pháp nghiên cứu, chế

biến và sử dụng hiệu quả đối tượng này Trong số đó, một số công trình nghiên cứu

nổi bật đã được công bố:

- Đại học Y dược Tp HCM, 2011, cũng đã có công trình nghiên cứu về

tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của các dạng cao chiết từ lá cây

Chùm Ngây Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao lá Chùm Ngây trồng tại

Việt Nam có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan Khả năng này thể

hiện rõ nhất là dịch chiết lá Chùm Ngây bằng cồn 60% ở liều 0,2g/kg

Nhận định này được rút ra dựa trên các nghiên cứu MDA, GSH, AST,

ALT

- Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh (2010) đã khảo sát được

trong lá Chùm Ngây có những nhóm hợp chất là: chất béo, tinh dầu,

carotenoid, triterpenoid, coumarin, flavonoid, tannin, acid hữu cơ Đồng

thời, tác giả cũng đã khảo sát và ghi nhận được những đặc điểm về hình

thái và vi học, cũng như đặc điểm của bột dược liệu lá Chùm Ngây Ngoài ra, công trình này cũng đã định lượng được flavonoid toàn phần

có trong lá cây Chùm Ngây mọc tại Tp Hồ Chí Minh và Đồng Nai, giữa lá non và lá già Từ đó, rút ra được mối tương quan giữa hàm lượng flavonoid trong lá với nơi cây mọc, cụ thể là hàm lượng flavonoid sẽ gia tăng khi cường độ chiếu sang vào cây (cường độ tia UV) tăng và hàm lượng flavonoid trong cây non sẽ cao hơn trong cây già [6]

- Một nghiên cứu khác của Trung tâm phát triển Khoa học và Công nghệ

Trẻ Tp HCM, 2010, cũng đánh giá được thành phần hóa học của Chùm Ngây sẽ khác nhau tùy theo từng bộ phận trên cây và tùy theo nơi mọc của cây

Trước đó, những công trình nghiên cứu về Chùm Ngây trong nước chủ yếu hướng vào khảo sát đặc điểm hình thái học thực vật, hệ thống phân loại thực vật và thống kê các công dụng dân gian của Chùm Ngây Trong số đó, tiêu biểu là những tài liệu về thực vật và cây thuốc của Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ Những nghiên cứu khác mang tính nhỏ lẻ và hầu như chưa được quan tâm [1],[2]

1.3 Gốc tự do và chất chống oxy hóa:

1.3.1 Gốc tự do:

Khái niệm về gốc tự do (Free Radical-FR) được đề xướng lần đầu tiên năm 1954, do bác sĩ Denham Harman, đại học Berkeley- Califonia, đưa ra trong luận thuyết về cơ chế tích tuổi (Free Radical Theory of Aging) Gốc tự do là những phân tử có mang 1 điện tử đơn lẻ ở quỹ đạo vòng ngoài Các điện tử đơn

lẻ có xu hướng nhận thêm điện tử để trở về trạng thái cân bằng hóa học Do đó, các gốc tự do có một thuộc tính đặc biệt quan trọng là có khả năng oxy hóa rất cao

Gốc tự do có thể nguồn gốc nội sinh hay ngoại sinh:

- Gốc tự do nội sinh là những gốc tự do thường xuyên được sinh ra

trong cơ thể sinh vật thông qua các chuỗi chuyển hóa biến dưỡng, hoạt động thực bào của bạch cầu, phản ứng viêm của mô tổn

thương… Gốc tự do phổ biến trong các trường hợp này là oxy

nguyên tử, gốc hydroxyl, gốc peroxyd, gốc alkoxyd…

- Gốc tự do ngoại sinh có trong môi trường sống xung quanh, có

thể được sinh ra do bức xạ mặt trời, tia X; sinh ra trong quá trình

chế biến thực phẩm như chiên, nướng, cũng có trong thành phần

của rượu bia, thuốc lá; hay có trong các chế phẩm hóa học như

thuốc xịt côn trùng… Các gốc tự do này thường đa dạng và phức

tạp hơn

Trong cơ thể sinh vật luôn tồn tại một cơ chế cân bằng nhất định các gốc tự

do được sinh ra lẫn dung nạp vào cơ thể nhờ các chất chống oxy hóa Tuy nhiên,

khi vì một lý do nào đó làm phá vỡ hệ thống cân bằng này, các gốc tự do sẽ khởi

động những chuỗi phản ứng dây chuyền oxy hóa những chất nền trong cơ thể,

đáng chú ý là các lipid màng tế bào Lipid màng tế bào khi đã bị oxy hóa sẽ bị

thay đổi các đặc tính lý hóa, làm thay đổi các hoạt tính đặc hiệu, ảnh hưởng đến

quá trình trao đổi chất qua màng tế bào Đồng thời, khi vào trong tế bào, các gốc

tự do sẽ có thể tấn công DNA, RNA, protein, lipid, tấn công ty thể và các bào

quan khác, hay làm biến đổi enzyme và rối loạn nội tiết tố (hormone) cũng thông

qua phản ứng oxy hóa khử

Theo ThS BS Phan Bích Nga- Viện dinh dưỡng, tổn thương do các gốc tự

do gây ra cho tế bào là cơ sở sinh bệnh học của những trạng thái bệnh thường gặp

ở những người có tuổi như vữa xơ động mạnh, bệnh tiểu đường, bệnh ung thư…

Các nghiên cứu khoa học gần đây cũng cho thấy các phân tử sinh học bị tổn

thương sẽ gây ra tình trạng bệnh lý của tế bào và cơ thể sống như bệnh ung thư,

chứng xơ vữa động mạch, các bệnh tim mạch, bệnh đái tháo đường, bệnh viêm

nhiễm, bệnh về da, bệnh Alzheimer…

1.3.2 Chất chống oxy hóa:

Chất chống oxi hóa là những chất có khả năng nhường điện tử cho những

gốc tự do hay đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, làm mất đi tính thiếu ổn

định và dễ gây phản ứng hóa học với những phân tử khác

Với khả năng đưa các gốc tự do về trạng thái cân bằng, chất chống oxy hóa giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại tác hại của gốc tự

do Hệ thống bảo vệ, chống oxy hóa này bao gồm nhiều thành phần Sự thiếu hụt bất kỳ thành phần nào đều có thể gây giảm trạng thái chống oxy hóa toàn phần

Các chất chống oxy hóa gồm 2 loại: chất chống oxy hóa có bản chất enzym và không phải enzym:

¾ Hệ thống chống oxy hóa có bản chất enzym: Trong tế bào sinh vật luôn có

cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại tác động của gốc tự do bằng enzym Enzym kháng oxy hóa có khả năng trung hòa gốc tự do và mỗi phân tử enzym có thể

vô hiệu hóa hàng ngàn gốc tự do Các enzym đó thường xuyên hiện diện trong cơ thể từ trước khi có phản ứng tạo ra gốc tự do Tiêu biểu là enzym superoxyd dismutase (SOD), glutathion (GSH), enzym glutathione peroxydase (GSH-Px), enzym catalase… mỗi enzym liên hệ vào từng phản ứng riêng biệt Tuy nhiên, sự gia tăng quá mức do tác động của các yếu tố bên ngoài dẫn tới phá vỡ sự cân bằng giữa các chất oxy hóa và khả năng thu dọn của hệ thống enzym trong cơ thể

¾ Hệ thống chống oxy hóa không phải enzym: Gồm có 3 nhóm chính: nhóm polyphenol, nhóm thiol và nhóm các phối tử của kim loại (thường là sắt hay đồng) Chúng có sẵn trong cơ thể hay được đưa từ ngoài dưới hình thức thực phẩm hay được bổ sung theo liều lượng nhất định Các chất chống oxy hóa

bổ sung có thể có nguồn gốc từ tự nhiên hay được tổng hợp hóa học Tác dụng triệt tiêu gốc tự do của chúng thể hiện ở một số tính chất sau:

- Dạng khử của chúng có thể phản ứng với gốc tự do, tạo dạng oxy

hóa (quinon)

- Dạng oxy hóa của chúng có thể chuyển thành dạng lưỡng gốc và

như vậy chúng có thể phản ứng với hai gốc tự do nữa Tuy nhiên, phản ứng này yếu

- Đặc biệt là dạng khử và dạng oxy hóa có thể phản ứng với nhau

tạo gốc semiquinon một cách thuận nghịch Các gốc semiquinon

rất bền, có thể tồn tại lâu và không độc nên chúng là chất trung

hòa gốc tự do rất tốt

Các loại chất chống oxy hóa, nguồn gốc và cơ chế tác dụng của chúng có

thể được tóm tắt trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng

Nguồn gốc Chất điển hình Cơ chế

Chất có sẵn trong cơ

thể (bản chất là

enzym)

Catalase, SOD, GSHR, GSHPO…

Tác động trực tiếp với oxy

Chất ngắt mạch: các thiol BHA (buthyl hydroanisol), BHT (buthyl hydroxytoluen), hydroquinone, vitamin E, propyl gallat…

Tác động trên các gốc

tự do như R-, RO.

như những chất ngắt mạch

1.4 Tổng quan về hợp chất flavonoid

1.4.1 Sơ lược về hợp chất thứ cấp flavonoid

Thực vật sản xuất ra một lượng lớn các chất hữu cơ mà có một số

chất không tham gia trực tiếp vào quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,

những chất này được gọi là sản phẩm thứ cấp Những hợp chất thứ cấp ñóng vai trò quan trọng gồm có: alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và flavonoid Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, và được tìm thấy trong rất nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một dẫn xuất khác nhau Cho đến nay, người ta đã tìm thấy gần 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác nhau, và hàng năm một số lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm

Có nhiều phương pháp để thu nhận hợp chất thứ cấp ở thực vật, một trong những cách đơn giản đó là thu nhận từ các cơ quan: rễ, thân, lá trong thực vật, tất cả các cơ quan này ở thực vật đều có thể sản xuất hợp chất thứ cấp, đó

là nguồn cung cấp nguồn nguyên liệu cho dược học Tuy nhiên, trong điều kiện nuôi trồng tự nhiên năng suất của các hợp chất thứ cấp không ổn định theo các giai đoạn phát triển của thực vật, vì do sự ảnh hưởng của tuổi cây, thời gian thu hoạch, điều kiện dinh dưỡng…Do vậy, để thu nhận một lượng lớn hợp chất thứ cấp ổn định về hàm lượng và xác định đúng thời gian thu hoạch

là một điều chúng ta cần quan tâm trong công tác thu hái làm dược liệu, tạo được nguồn nguyên liệu phục vụ trong sản xuất ở qui mô công nghiệp trong y dược học

Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng Về cấu trúc hoá học flavonoid có khung cơ bản theo kiểu C6 – C3 – C6 (2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon) và được chia làm nhiều nhóm khác nhau [10] Cũng giống vitamin C, các flavonoid được khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất của thế kỷ 20: Albert Szent- Gyorgyi (1893-1986) Ông nhận giải Nobel năm

1937 với những khám phá quan trọng về các đặc tính của vitamin C và flavonoid

Flavonoid thuộc nhóm hợp chất thứ cấp lớn gồm nhiều loại polyphenol như: anthocyanin, flavanon, flavanol, flavon, flavonol, isoflavonoid…Các hợp chất flavonoid được tạo ra ở trong mô thực vật nhằm chống lại tia UV

Có khoảng trên 6000 hợp chất flavonoid tự nhiên có trong thực vật và

nói chung là có nhiều trong thực vật bậc cao, một số hợp chất là sắc tố trong

thực vật nhưng cũng là những hợp chất có hoạt tính sinh học Hầu hết các

flavonoid đều ở dạng glycosid, đều tan trong nước và tích luỹ trong không bào

của tế bào thực vật [9]

Flavonoid là nhóm hợp chất thứ cấp ở thực vật có rất nhiều chức năng

quan trọng và hữu ích cho sức khoẻ con người, từ việc tách chiết RNA và phân

tích sự biểu hiện gen cho thấy có sự xuất hiện 5 đoạn cDNA biểu hiện cho 5

enzym trong quá trình sinh tổng hợp flavonoid (phenylalanin

ammonia-lyase, chalcone synthase, flavanon 3-hydroxylase, dihydroflavanol 4-reductase

and anthocyanidin synthase) Sự hoạt hoá của các gen trong quá trình sinh tổng

hợp flavonoid đồng thời có sự tập trung flavonoid và acid hydroxycinnamic

được xác định trong lá đang phát triển dưới điều kiện trực tiếp của ánh sáng mặt

trời, so sánh với lá trong tối của một số thực vật tương tự Cyanidin của

anthocyanins và quercetin flavonol có vai trò ưu thế hơn trong việc chống lại

ánh sáng cao của mặt trời trong lá Vaccinium myrtillus L Flavonoid có vai trò

trong việc bảo vệ thực vật chống lại bức xạ cao của mặt trời [25]

Quercetin

Nguồn gốc: Quercetin thuộc nhóm flavonol xuất hiện phổ biến trong rau,

quả và rượu vang Lượng flavonol và flavonon dùng hàng ngày khoảng 23

mg/người, trong đó quercetin chiếm 60% Quercetin đầu tiên được chiết xuất

từ cây Rhododendron cinnabarium Hook., Ericeace Hiện nay, quercetin được

chiết xuất chủ yếu từ hoa Hòe, Mạch Ba Góc

H

OH O

Đặc tính lý - hóa: Quercetin kết tinh từ cồn, tinh thể màu vàng và ngậm

2 phân tử nước Nhiệt độ nóng chảy là 314°C Tan trong acid acetic băng, dung dịch kiềm cho màu vàng, tan trong cồn, không tan trong nước Có vị đắng Hấp thu cực đại ở bước sóng 258 nm và 375 nm

Tác dụng dược lý của Quercetin:

- Những nghiên cứu tương quan về dịch tễ học đã chỉ ra tác động tỉ lệ

nghịch giữa lượng flavonol sử dụng và số ca tử vong do bệnh xơ vữa động mạch vành Tính chất chống oxy hoá của flavonol thể hiện trong các cơ chế đáp ứng có tác động ngăn ngừa xơ vữa động mạch vành đã được biết đến rộng rãi

- Riêng tác động chống cao huyết áp chỉ được biết đến gần đây

Nghiên cứu trên chuột bị chứng cao huyết áp tự phát, người ta nhận thấy sử dụng quercetin làm giảm huyết áp tâm trương, tâm thu, có tác động tốt đối với chứng phì đại thất trái và rối loạn chức năng nội

mô [23]

- Quercetin và kaempferol có tác dụng chống viêm do ức chế tác

dụng của protein kinase, phospholipase, cyclooxygenase, và lipooxygenase, cũng như ức chế sự giải phóng những chất trung gian của viêm từ bạch cầu

- Quercetin được biết nhiều nhất như tác nhân kháng viêm, kháng dị

ứng do cơ chế cân bằng màng đại thực bào, ngăn ngừa sự giải phóng histamin và các tác nhân kháng viêm khác Vì vậy, quercetin được chỉ định trong các trường hợp hít phải các chất dị ứng, hen suyễn, eczema, bệnh vảy nến, bệnh gout và viêm loét kết tràng [24]

1.4.2 Chiết xuất flavonoid

Không có một phương pháp chung nào để chiết xuất các flavonoid vì

chúng thường rất khác nhau về độ tan trong nước và trong các dung môi

hữu cơ Các flavonoid glycosid thường dễ tan trong các dung môi phân cực,

các flavonoid aglycon dễ tan trong các dung môi kém phân cực Các dẫn chất

flavon, flavonol có nhóm OH tự do ở vị trí C7 tan được trong dung dịch

kiềm loãng [9]

Tuy nhiên việc chiết xuất cũng tuân theo một số nguyên tắc sau:

- Dược liệu tươi là thích hợp nhất cho việc chiết xuất flavonoid,

tuy nhiên khó thực hiện ở quy mô lớn Dược liệu khô được bảo

quản tốt vẫn đáp ứng yêu cầu chiết xuất flavonoid

- Trong dược liệu flavonoid thường ở dạng glycosid tan được

trong các dung môi như MeOH, EtOH nóng hoặc nguội Dung

môi này có thể hoà tan 1 số flavonoid ở dạng tự do có nhiều

nhóm OH nên MeOH và nhất là EtOH cao độ (70- 90º) thường

được dùng

- Dược liệu được xay nhỏ thích hợp cho việc chiết xuất

Thông thường để chiết các flavonoid glycosid, người ta phải loại các

chất thân dầu bằng Ether dầu hỏa sau đó chiết bằng nước nóng hoặc MeOH

hoặc EtOH hoặc hỗn hợp CHCl3 và EtOH:

- Cồn ở các nồng độ khác nhau và nước thường chiết được phần

lớn các flavonoid

- Hỗn hợp CHCl3 và cồn hay dùng để chiết các dẫn chất methoxy

flavonoid

- Các chất anthocyanidin thường kém bền vững nhất là các acyl

anthocyanidin đ ược acyl hoá với các acid béo do đó người ta

thường chiết bằng MeOH có mặt của các acid yếu như acid

acetic, tartric hay citric thay vì HCl Có tác giả dùng một lượng

nhỏ acid mạnh dễ bốc hơi là acid trifluoroacetic (0,5-3%) để

chiết các polyacylanthocyanin phức tạp vì acid này dễ bốc hơi

trong quá trình cô dịch chiết

Dịch chiết thường đem cô giảm áp ở nhiệt độ thấp (40-70º) Đối với những chất dễ bị biến đổi thuộc các nhóm flavan-3-ol, anthocyanin, flavanon, chalcon glycosid thì nên làm đông khô

Đôi khi để tinh chế hoặc tách flavonoid, người ta dùng muối chì để kết tủa Sau khi thu tủa người ta tách chì bằng cách sục dihidrosulfid thì flavonoid được giải phóng [10]

Trong định tính để đảm bảo chiết xuất đầy đủ chất, việc chiết xuất flavonoid được thực hiện với dung môi qua 2 bước sau: đầu tiên chiết với MeOH-H2O (9:1) sau đó với MeOH-H2O (1:1) Lượng dung môi chiết nên cho vừa đủ, để yên trong 6- 12 giờ Lọc lấy dịch chiết qua bông gòn, bông thuỷ tinh hay giấy lọc trong phễu Buchner Gộp chung hai dịch chiết và cô giảm áp để loại hết MeOH Dịch chiết nước thu được có thể loại tạp ít phân cực như dầu béo, terpen, chlorophyll, xanthophyll…bằng cách lắc với hexan, heptan hay ether dầu hoả Gộp các dịch nước chứa phần lớn khối lượng flavonoid sau khi

đã kiểm tra bằng SKLM để loại lớp dung môi không phân cực Cô giảm áp để thu cắn toàn phần [3]

Đối với flanonoid phân cực:

Áp dụng quy trình như trên Dịch chiết nước chứa phần lớn khối lượng flavonoid và các chất phân cực Lắc dịch chiết này với Et2O rồi với EtOAc, phần dung dịch nước sẽ chứa đường, lớp Et2O chứa dạng tự do, lớp EtOAc chứa dạng glycosid và 1 số dạng tự do còn sót lại Sau đó có thể phân lập và tinh chế bằng các phương pháp khác (SKLM, SKC, SKG, HPLC…) [3]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá Chùm Ngây thu tại Tri Tôn, An Giang vào ngày 1/8/2010 Mẫu sử dụng

bao gồm cọng và lá chét

Mẫu được thu hái ngoài tự nhiên về, loại bỏ bụi, lá hư, sâu… Một phần được

phơi khô ở 500C – 600C rồi xay nhỏ thành bột Bột dược liệu được lưu trữ tại trung

tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh Một phần lá tươi được dùng để chiết etanol

thu cao toàn phần

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Dung môi: etanol công nghiệp, dietyl eter, cloroform, etyl acetat, metanol, acid

acetic, acid formic…

- Hóa chất: acid acetic, NH4OH, FeCl3, HCl, H2SO4, KOH, Mg, CaSO4 khan,

- Tủ sấy Sanyo Mow-112 (Nhật)

- Cân kĩ thuật Mettler Toledo Ab-204 (Thụy Sỹ)

- Máy cô giảm áp Buchi- 114 (Thụy Sỹ)

- Bồn chiết siêu âm Ultrasonic Branson 3510 (Mỹ)

- Đèn soi UV-VIS Desaga Sarstedt Gruppe

- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY Thermo Spectrorius

- Cân chính xác vào bì khoảng 2g mẫu

- Sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 4 giờ, lấy ra để trong bình hút ẩm và đem cân trọng lượng sau khi sấy Ghi lại lượng cân

- Tiếp tục sấy mẫu ở áp suất thường, 1050C trong 2 giờ, để vào bình hút ẩm chờ nguội và cân lại trọng lượng sau khi sấy Lặp lại nhiều lần, mỗi lần sấy 2 giờ, cho đến khi khối lượng không thay đổi

- Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức sau:

%100)( − ×

−

=

a c b a X

X: độ ẩm mẫu thử (%)

a: khối lượng ban đầu của mẫu thử (g)

b: khối lượng sau cùng của mẫu thử (g)

c: khối lượng bì (g)

2.2.1.2 Xác định độ tro toàn phần [5]

- Nung một chén nung bằng sứ cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội trong

bình hút ẩm và cân khối lượng của chén không

- Cân chính xác 2g mẫu cho vào chén nung Trải đều mẫu dưới đáy chén và đốt

cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói

- Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân và ghi lại lượng cân

- Đặt chén đựng tro vào lò nung và tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa

Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm Cân

- Tiếp tục làm như vậy cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén tro

không chênh lệch quá 0,5 mg

- Tro toàn phần được tính theo công thức:

A: Độ tro toàn phần (%)

a: Khối lượng chén có tro (g)

b: Khối lượng chén không tro (g)

c: Khối lượng mẫu (g)

h: Độ ẩm (%)

2.2.1.3 Xác định độ trong không tan trong acid clohydric [3]

- Lấy chén nung đã xác định tro toàn phần ở trên, thêm vào đó 15ml nước cất và

10 ml HCl 10% Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, đun sôi cẩn thận trong

10 phút Để nguội Rửa mặt kính đồng hồ bằng 5ml nước cất rồi cho vào chén

nung

- Lọc chất không tan bằng giấy lọc không tro Rửa giấy lọc và tro bằng nước cất

nóng cho tới khi dịch lọc trung tính (thử bằng giấy quỳ)

- Cho tất cả giấy lọc và tro trở lại chén nung, sấy khô rồi đốt, nung ở 500 – 6000C

trong 2h Để nguội trong bình hút ẩm và cân

- Nung tiếp cho đến khi giữa hai lần cân liên tiếp, khối lượng không chệnh lệch

nhau quá 1mg

- Tính tỉ lệ phần trăm tro không tan trong acid với tro tan trong acid so với lượng

mẫu đã sử dụng

2.2.1.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật [3], [5], [9], [10]

Dựa vào độ hòa tan của các hợp chất trong dược liệu để tách chúng bằng các

dung môi có độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình, phân cực

mạnh bằng cách chiết lần lượt với các dung môi: dietyl eter, cồn và nước Sau đó

xác định các hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng

Nhóm hợp chất Thuốc thử / cách phát hiện Phản ứng dương tính

Triterpenoid Liebermann – Burchard

Lớp tiếp xúc có màu đỏ nâu, lớp dung dịch trên có màu xanh lục hay tím Alkaloid

Thuốc thử Mayer Thuốc thử Bouchardat Thuốc thử Dragendorff

Tủa trắng – vàng nhạt Tủa nâu đỏ Tủa đỏ cam

dưới đèn tử ngoại 365 nm

2.2.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu phân đoạn cao

2.2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần

Thu cao toàn phần bằng phương pháp chiết ngâm dầm, với dung môi chiết là cồn 96%, theo tỉ lệ 6 : 1

Cân 10 kg lá Chùm ngây tươi cho vào bình ngấm có lót bông ở đáy Rót dung môi vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của mẫu Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một ngày cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất

tự nhiên Thu dịch chiết và tiếp tục rót dung môi mới vào bình Gộp dịch chiết lại,

đem cô giảm áp để thu hồi dung môi và có được cao toàn phần (cao cồn tổng) [5],

[10]

2.2.2.2 Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần [5], [10]

Cao cồn tổng ban đầu chứa hầu hết các hợp chất hữu cơ từ phân cực đến kém

phân cực Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để phân chia cao cồn tổng ban đầu

thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện trong bình lắng gạn, ở điều kiện nhiệt

độ phòng

Hòa tan cao cồn tổng cồn vào một lượng tối thiểu cồn, sau đó rót thêm một

lượng lớn nước

Lắc phân đoạn phần dịch này lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng

dần: Dietyl eter, Cloroform, Etyl acetat Tiến hành lắc cho đến khi không còn chất

hòa tan vào dung môi thì mới chuyển sang dung môi phân cực hơn

Thu các phân đoạn, đem cô giảm áp để loại dung môi Ta thu được 4 phân

đoạn cao: cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và phần dịch lắc còn lại sau cùng

là cao nước [5], [10]

Tóm tắt quay trình theo sơ đồ trong hình 2.1

Các phân đoạn cao thu được sẽ được khảo sát các thành phần hóa học và thử

hoạt tính chống oxi hóa nhằm chọn ra phân đoạn có tiềm năng cao nhất Phân đoạn

này sẽ tiếp tục được phân tích để xác định và tách chiết ra các hợp chất có hoạt tính

chống oxi hóa

2.2.3 Khảo sát các cao phân đoạn

2.2.3.1 Định tính bằng phương pháp hóa học cao phân đoạn

Các phân đoạn cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat, cao nước được đem

phân tích định tính sự hiện diện của các nhóm chất chính đã cho kết quả dương tính

trong phần khảo sát sơ bộ hóa thực vật

• Xác định nhóm Alkaloid:

Hòa mỗi cao phân đoạn trong 4 ml dung dịch acid hydrocloric1% Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ Định tính alkaloid bằng các thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff [3]

Hình 2.1: Quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ lá Chùm ngây tươi

- Thuốc thử Mayer: tủa trắng – vàng nhạt

- Thuốc thử Bouchardat: tủa đỏ nâu

- Thuốc thử Dragendorff: tủa đỏ cam

Lắc phân đoạn

Chiết cồn 96%

Tỉ lệ 6 : 1

Dịch lắc eter

Lá Chùm ngây tươi

10 kg

Bã dược liệu Dịch cồn

Cao cồn tổng

Cô giảm áp

Dịch lắc cloroform etyl acetat Dịch lắc

Dịch nước còn lại

So sánh kết quả với ống chứng không có thuốc thử Nếu dung dịch đục hơn so

với ống chứng hoặc có tủa: có alkaloid

• Xác định nhóm Flavonoid:

¾ Tác dụng với H 2 SO 4 đậm đặc:

Hòa tan mỗi cao phân đoạn vào H2SO4 đậm đặc: flavon và flavonol cho màu

vàng đậm đến vàng cam và có phát huỳnh quang đặc biệt Chalcon, auron cho màu

đỏ hoặc xanh dương – đỏ Flavanon cho màu từ cam đến đỏ

¾ Tác dụng với dung dịch NaOH 1% / etanol:

Nhỏ dung dịch NaOH vào một dung dịch có cao đã hòa tan trong etanol, sẽ có

màu từ vàng đến cam - đỏ Nếu là flavon, isoflavon, chalcon, leucoantocyanidin sẽ

có màu vàng Flavonol cho màu từ vàng đến cam Auron cho màu đỏ đến đỏ tím

¾ Phản ứng cyanidin của Wilstatter:

Chuẩn bị 2 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 2 ml cao chiết hòa tan trong

methanol Ống 1 làm đối chứng Với ống số 2: cho thêm 1 ml alcol tert – butyl,

0.5ml HCl đậm đặc, 3-5 hạt magnesium kim loại Đun nhẹ trong vài phút , sẽ xuất

hiện màu ở lớp alcol phía trên

Nếu cao chiết có chứa flavon, flavanon, flavonol, flavanonol, xanthon dung

dịch trong ống 2 sẽ có màu cam, đỏ hoặc tím Nếu cao chiết có chứa isoflavon,

isoflavanon, auron dung dịch không đổi màu

¾ Tác dụng với FeCl 3 :

Phản ứng cho màu từ xanh lục đến xanh đen

• Xác định nhóm polyphenol:

¾ Anthraquinon:

Phản ứng Liebermann: Hòa cao vào dung dịch NaOH 10% lắc đều và pha loãng

với nước Thêm vào một ít bột kẽm và đun sôi dung dịch Anthraquinon làm dung

dịch có màu đỏ Màu sẽ mất khi lắc dung dịch ngoài không khí và xuất hiện trở lại

khi đun nóng

¾ Coumarin:

Hòa cao trong 2ml cồn 70% Chia đều dịch chiết vào 2 ống nghiệm nhỏ Thêm vào ống thứ nhất 0.5ml KOH10% và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương Đun cách thủy cả 2 ống nghiệm trong 2 phút, để nguội và soi dưới đèn tử ngoại 365nm Dung dịch trong ống một phát huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ 2 là có coumarin

¾ Tannin :

Lấy 2ml dịch lọc, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin – muối, khuấy đều, so sánh với ống chứng chỉ chứa dịch lọc và ống chứng chỉ chứa thuốc thử (dung dịch gelatin – muối) Nếu có tủa bông trắng là có tannin

• Xác định nhóm terpenoid:

¾ Phản ứng Liebermann – Burchard để phát hiện steroid –

triterpenoid:

Anhydrid acetic (1ml), chloroform (1ml), làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt

H2SO4 đđ Cho mẫu vào ở dạng rắn Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, màu này bền không đổi

¾ Phản ứng Rosenthler để phát hiện steroid – triterpenoid:

Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 1% vanilin trong etanol (2 giọt), HCl đậm đặc (1 giọt) Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu xanh lục hay tím

¾ Phản ứng Salkowski để phát hiện steroid:

Hòa tan mẫu thử (1-2mg) trong cloroform (1ml) và nhỏ thêm vào H2SO4 đđ (1ml) Phản ứng dương tính là dung dịch đổi thành màu đỏ đậm, xanh, xanh tím

¾ Phản ứng Carr – Price để phát hiện steroid – triterpenoid:

Dung dịch mẫu thử (1ml), dung dịch 20% SnCl3 trong cloroform (1-2 giọt), nếu

có màu đặc trưng, bền , khi so với ống chứng là dương tính

• Xác định hợp chất saponin:

¾ Thử nghiệm tính tạo bọt:

Hòa tan cao vào 5ml nước nóng Lọc vào một ống nghiệm và để nguội, thêm

nước cho đủ 10ml, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh, dứt khoát

theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và

¾ Thử nghiệm Fontan – Kaudel:

Lấy một lượng cao hòa tan với 10ml nước Chia đều vào 2 ống nghiệm

Ống 1: thêm 2ml HCl 0,5N (pH=1)

Ống 2: thêm 2ml NaOH 0,5N (pH=13)

Lắc trong 1 phút , quan sát và so sánh chiều cao cột bọt giữa 2 ống:

- Nếu cột bọt trong 2 ống tương đương nhau: sơ bộ kết luận dược liệu có

saponin triterpen

- Nếu ống 2 (pH=13) có cột bọt cao hơn ống 1 (pH=1) gấp 2-3 lần: sơ bộ kết

luận dược liệu có saponin steroid

2.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [3], [9]

¾ Chuẩn bị bản mỏng

Sử dụng bản mỏng silicagel – 60 F254, quãng đường di chuyển của dung môi là

8,5 cm

¾ Chuẩn bị dung dịch mẫu

Mẫu được hòa tan trong metanol

¾ Hệ dung môi khai triển

- Hệ 1: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)

- Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27)

¾ Phát hiện

- Soi đèn UV 254 nm

- Soi đèn UV 365 nm

- Thuốc thử FeCl3 5% trong cồn

2.2.3.3 Phương pháp định lượng phenolic tổng

Hàm lượng phenolic tổng được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994) [18]

¾ Nguyên tắc:

Trong thành phần thuốc thử Folin-Ciocalteu có phức hợp phosphomolybdat Phức hợp này sẽ bị khử bởi các hợp chất phenolic tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, hấp thụ cực đại ở bước sóng 758 nm Hàm lượng phenolic có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ màu

- Hút một thể tích xác định mẫu (Chất chuẩn acid gallic hoặc mẫu cần định

lượng được pha loãng ở nồng độ thích hợp) cho vào bình định mức 10 ml

- Thêm 6 ml nước cất vào bình định mức Lắc đều

- Cho vào bình 0,5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu Lắc đều Để yên trong 5

phút

- Thêm vào bình định mức 1,5 ml Na2CO3 Lắc đều

- Thêm nước vào bình cho vừa đủ 10ml Lắc đều

- Để yên trong tối 2h Sau đó tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 758 nm

9 Dựng đường chuẩn acid gallic

Pha dung dịch chuẩn:

Cân 20 mg acid gallic, định mức chính xác đến 10 ml bằng nước cất, được

dung dịch có nồng độ 2 mg/ml Pha loãng tiếp 10 lần được dung dịch có nồng độ

0,2 mg/ml

Từ dung dịch chuẩn này, hút vào bình định mức những thể tích khác nhau để

được giai mẫu có hàm lượng acid gallic là 10 μg, 20 μg, 30 μg, 40 μg, 50 μg

Tiếp tục tiến hành thí nghiệm như trên

Bảng 2.1: Quy trình dựng đường chuẩn acid gallic

9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn

Xác định hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và các cao phân đoạn:

cao Eter, cao Cloroform, cao Etyl acetat và cao nước

Pha nồng độ dung dịch mẫu theo bảng 2.2

Bảng 2.2: Nồng độ các cao phân đoạn đem định lượng

Mẫu Nồng độ

( μg/ml)

Hút vào bình định mức ( μl)

Khối lượng cao định lượng (mg)

Tiếp tục tiến hành thí nghiệm theo các bước nêu trên

Dựa vào đường chẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có trong mẫu Hàm lượng phenolic tổng được tính bằng đương lượng acid gallic (GAE) có trong 1 mg cao đem định lượng, theo công thức:

P: hàm lượng phenolic tổng (μg GAE/mg)

m: khối lượng cao đem định lượng (mg)

f(A): phương trình đường chuẩn

X: độ ẩm cao (%)

2.2.4 Phân lập các hợp chất chống oxi hóa

2.2.4.1 Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sau khi khảo sát các phân đoạn cao, xác định được phân đoạn có tiềm năng chống oxi hóa cao nhất Phân đoạn cao được chọn sẽ được khảo sát tiếp để xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Mẫu cao được hòa trong metanol Tải lên bản mỏng sắc ký có chiều dài 10

cm, đường di chuyển cùa dung môi là 8,5 cm

Hệ dung môi khai triển: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13) Sau khi khai trển, bản mỏng được quan sát dưới đèn UV 254 nm và UV 365

nm Các vết chất được ghi nhận bằng giá trị Rf của chúng

Phun thuốc thử DPPH 0,05% lên bề mặt của bản mỏng Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

Những thành phần có hoạt tính chống oxi hóa sẽ tạo những vạch màu vàng trên nền tím của bản mỏng, do chất chống oxi hóa làm mất màu tím của thuốc thử

DPPH Dựa vào những vạch này, có thể xác định được những thành phần có hoạt

tính chống oxi hóa trong cao phân đoạn

Chứng dương sử dụng trong thí nghiệm này là vitamin C So sánh bằng mắt

thường độ mất màu của vạch chứng dương và các vạch có hoạt tính khác để xác

định mức độ mạnh yếu của hoạt tính

Những vạch có hoạt tính chống oxi hóa được ghi nhận lại bằng giá trị Rf của

chúng

2.2.4.2 Sắc ký cột nhanh – cột khô

Với những cao chiết từ cây có có nhiều hợp chất khác nhau, ít có phương

pháp sắc ký cột hiệu quả chỉ một lần mà tách ra được các đơn chất nên phải thực

hiện nhiều lần sắc ký cột Đối với lượng mẫu cao lớn thì phải tốn nhiều thời gian

(nhiều ngày) thực hiện sắc ký cột Việc gián đoạn để nghỉ có thể làm xáo trộn vị trí

sắp xếp của các chất trong quá trình sắc ký Sắc ký nhanh cột khô được áp dụng để

khắc phục những nhược điểm này [5], [9]

Sau khi tiến hành khảo sát phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao (phân

đoạn etyl acetat), xác định được Rf của các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa

Tiến hành sắc ký nhanh – cột khô để bước đầu tách thành những phân đoạn có độ

phân cực khác nhau, thành phần đơn giản hơn Từ những phân đoạn đơn giản này,

dễ dàng phân lập tiếp các chất có hoạt tính chống oxi hóa bằng sắc ký cột cố điển

một cách hiệu quả hơn

- Nén chặt chất hấp phụ bằng cách gõ cột, kết hợp với áp suất hút ở phía dưới

cột và nén cơ học trên định cột Đặt phía trên bề mặt chất hấp phụ một miếng giấy lọc để ổn định mặt cột

¾ Nạp mẫu:

- Khối lượng mẫu 20 g

- Nạp mẫu ở dạng bột khô Cho hết lượng mẫu khô phủ lên trên đầu cột, vừa

khỏ nhẹ thành ngoài của phễu vừa dùng muỗng để trải đều phần bột này để

có một lớp mỏng Đặt lên trên bề mặt cột một miếng giấy lọc để bề mặt không bị xáo trộn khi rót dung môi

¾ Triển khai sắc ký:

- Cho máy bơm hoạt động Rót một thể tích dung môi lên bề mặt phễu Dung

môi được hút xuống bình tam giác bên dưới Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung môi vừa giải ly ra

- Hệ dung môi giải ly:

- Cloroform 100%

- Etyl acetat 100%

- Etyl acetat – metanol (50 : 50)

- Thể tích phân đoạn giải ly: 500 ml

- Kiểm tra các phân đoạn:

- Sắc ký lớp mỏng kiểm tra các phân đoạn Hệ dung môi khai triển là etyl

acetat – metanol – nước (100: 17: 13)

- Các phân đoạn giống nhau được gộp chung Cô đến cắn và cân khối lượng

2.2.4.3 Sắc ký cột cổ điển [11],[ 24]

Sau khi sắc ký cột nhanh, thu được các phân đoạn đơn giản hơn Lựa chọn phân đoạn phù hợp, có thành phần đơn giản, chứa những hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa để tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập các chất tinh khiết

Thể tích mỗi phân đoạn 20 ml

2.2.5 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa

2.2.5.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH

Phương pháp quét gốc tự do DPPH là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện. 

Phương pháp này dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng

chống oxi hóa của mẫu nghiên cứu trong thử nghiệm ban đầu

¾ Nguyên tắc:

DPPH là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử Gốc

tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đôi Chất có tác dụng chống oxi hóa

sẽ làm giảm màu của DPPH Sự mất màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp

với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử Hoạt tính quét

gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH Xác định bằng

cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 516 nm [8]

¾ Chuẩn bị thuốc thử và mẫu:

- Dung dịch DPPH: Pha dung dịch DPPH 0,6mM trong metanol bằng

cách hòa tan 5,915mg DPPH vào 17,5ml MeOH cho vào bình định mức sau

đó thêm nước cho đủ 25ml

- Mẫu thử: Khảo sát hoạt tính quét gốc DPPH của các mẫu: cao tổng,

cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước Chứng dương là vitamin

C Các mẫu thử được tiến hành khảo sát ở 7 nồng độ khác nhau theo bảng

2.4 Bảng 2.4: Dãy nồng độ của các phân đoạn cao đem thử hoạt tính quét gốc tự

- Hút 0,5 ml mẫu thử vào ống nghiệm

- Thêm vào 3 ml metanol

- Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch DPPH Lắc đều

- Mẫu được giữ trong tối, ở nhiệt độ phòng Sau thời gian 30 phút, tiến

hành đo độ hấp thu ở bước sóng 516 nm

- Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo công thức:

100)(

ODc ODt ODc HTCO

ODc: Mật độ quang của dung dịch DPPH và MeOH

ODt: Mật độ quang của DPPH và mẫu thử

Từ HTCO (%) và nồng độ mẫu dựng được đường chuẩn Dựa vào đường

chuẩn tính được IC50 (khả năng đánh bắt 50% DPPH của mẫu) Giá trị IC50 càng

thấp tương ứng với HTCO càng cao và ngược lại

Bảng 2.5: Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH

Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia vào

phản ứng oxi hóa khử Khi xác định năng lực khử ta cũng xác định được năng lực

kháng oxy hóa của một chất

¾ Nguyên tắc:

Xác định năng lực khử theo phương pháp của Yen và Duh (1993) [4] Trong

đó, chất khử (chất có hoạt tính oxi hóa) sẽ khử potassium ferricyanid (K3[Fe(CN)6])

thành potassium ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]) Ion Fe3+ trong phân tử potassium

ferricyanid bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanid

X + K3[Fe(CN)6] → K4[Fe(CN)6]

X + [Fe(CN)6]3+ → [Fe(CN)6]4+

Khi bổ sung Fe3+, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành một phức

hợp ferric ferrocyanid màu xanh dương có công thức Fe4[Fe(CN)6]3 Phức hợp này

có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 700 nm

4 [Fe(CN)]4+ + 3 [Fe(CN)]4+ → Fe[Fe(CN)] (Màu xanh)

Cường độ màu tỉ lệ thuận với hàm lượng ion ferrocyanid được tạo thành Do

đó cường độ màu càng cao chứng tỏ năng lực khử của mẫu thử càng cao

¾ Tiến hành thí nghiệm:

- Pha mẫu thử theo dãy nồng độ từ 200 μg/ml đến 1000 μg/ml

- Hút 1 ml mẫu thử vào mỗi ống nghiệm

- Thêm 2,5 ml đệm sodium phosphat 0,2 M pH 6,6 Lắc đều

- Thêm 2,5 ml dung dịch potassium ferricyanid 1% Ủ ở 500C trong 20 phút

- Thêm 2,5 ml dung dịch acid tricloacetic 5% (TCA) để ngừng phản ứng

- Lắc đều hỗn hợp, tiến hành ly tâm hoặc lọc, thu dịch lọc

- Hút 1 ml dịch lọc vào các ống nghiệm khác, thêm 2 ml nước cất và 0,5 ml

dung dịch FeCl3 1% Lắc đều

- Sau 5 phút, tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 700 nm

2.2.5.3 Phương pháp thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do

Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định theo phương pháp của Li

và cộng sự (2007) [38]

¾ Nguyên tắc:

Hoạt tính kháng gốc hydroxyl tự do được xác định trên nguyên tắc của phản

ứng Fenton Phản ứng Fenton là phản ứng hydroperoxid (H2O2) với ion Fe2+ H2O2

sẽ gây oxi hóa Fe2+ để tạo thành Fe3+, một ion hydroxyl (OH-) và một gốc hydroxyl

tự do (OH•)

Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- + OH• Các chất có khả năng quét gốc hydroxyl tự do sẽ phân hủy các gốc hydroxyl

mới sinh ra từ phản ứng Fenton Hàm lượng gốc hydroxyl còn lại sẽ làm giảm

cường độ màu của thuốc thử Safranin-O Cường độ màu của thuốc thử Safranin-O

càng cao thể hiện khả năng quét gốc hydroxyl tự do của mẫu càng cao

¾ Tiến hành thí nghiệm

- Pha mẫu thử thành các dãy nồng độ từ 200 μg/ml đến 1000 μg/ml

- Hút 1 ml mẫu vào ống nghiệm

- Thêm vào 1,7 ml đệm sodium phosphat 0,15 M pH 7,4 Lắc đều

- Hút vào 1 ml dung dịch EDTA – Fe2+ 20 mM

- Thêm 0,3 ml dung dịch Safranin-O 1,14 mM vào ống nghiệm Lắc đều

- Hút 1 ml H2O2 3% vào ống nghiệm để bắt đầu phản ứng

- Ổn định phản ứng ở nhiệt độ 370C trong thời gian 30 phút

- Đo độ hấp thu của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng 520 nm

- Hiệu quả kháng gốc hydroxyl tự do của mẫu thử được tính theo công thức

Hoạt tính quét gốc OH•

A mẫu: độ hấp thu của mẫu thử ở bước sóng 520 nm

Mẫu thử không là mẫu mà trong đó chất thử nghiệm được thay bằng đệm

Mẫu đối chứng là mẫu mà HOvà EDTA – Fe2+ được thay bằng đệm

Bảng 2.7: Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu

3.1.1 Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu

9 Xác định giảm khối lượng do sấy khô

Bảng 3.1: Kết quả giảm khối lượng do sấy khô

Khối lượng nguyên liệu (g) 2,0078 2,0393 2,0306

9 Xác định tro không tan trong HCl

Bảng 3.5: Độ tro không tan trong HCl Nguyên liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3

3.1.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật

Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng, đã xác định được một số nhóm chất

Phản ứng dương tính

Kết quả định tính dịch chiết

Kết quả chung Eter Cồn Nước

Acid béo Nhỏ dung dịch

lên giấy Vết trong mờ

++ ++ + ++

UV365 nm

+ - - +

Polyphenol Dung dịch FeCl3 Màu xanh rêu +++ +++ +++

Flavonoid Mg, HCl đậm đặc Màu hồng tới

Chú thích: (-) âm tính (+) có ít (++) có (+++) có nhiều

(++++) có rất nhiều

Kết quả phân tích sơ bộ hóa thực vật cho thấy trong lá Chùm ngây có chứa:

tinh dầu, acid béo, carotenoid, triterpen, alkaloid, anthraquinon, coumarin,

tanin, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu cơ và polyuronic Trong số đó

flavonoid, tanin, carotenoid, chất khử có với lượng nhiều

3.2 Chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn

3.2.1 Kết quả chiết xuất cao toàn phần

Thu nhận cao toàn phần theo phương pháp ngâm lạnh 10kg lá Chùm ngây

tươi được loại bỏ tạp, sâu, bụi…cho vào bình ngấm kiệt Dung môi chiết là cồn

96% (theo tỉ lệ 6:1) Lượng dung môi sử dụng là 60 lít

Kết quả thu được 600 g cao tổng

Bảng 3.7: Hiệu suất thu cao toàn phần từ lá Chùm Ngây Mẫu Khối lượng

mẫu (kg)

Khối lượng cao (g)

Độ ẩm cao (%)

Hiệu suất chiết

Lá Chùm Ngây

3.2.2 Kết quả chiết cao phân đoạn

Từ cao cồn tổng ban đầu, tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi

có độ phân cực tăng dần: eter, cloroform, etyl acetat Thu được các dịch lắc phân đoạn có tính phân cực khác nhau, cô giảm áp các dịch lắc và phần dịch nước còn lại sau cùng ta thu được các cao eter, cao clorofom, cao etyl acetat, và cao nước

Bảng 3.8: Kết quả thu cao phân đoạn bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng Phân đoạn Khối lượng cao (g) Độ ẩm cao (%) Hiệu suất chiết

Cao cloroform có khối lượng nhỏ nhất cho thấy các chất có độ phân cực gần với độ phân cực của cloroform chiếm hàm lượng thấp trong lá Chùm Ngây

Hình 3.1: Quy trình chiết cao cồn tổngvà thu cao phân đoạn từ lá Chùm Ngây

Việc phân lập các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học của một đối tượng

nghiên cứu nào đó thường bắt đầu từ việc khảo sát các đặc điểm hóa học quan trọng

và hoạt tính sinh học trên các phân đoạn cao thu được Nhằm định hướng cho việc

phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây, chúng tôi

tiến hành khảo sát các phân đoạn cao Mỗi phân đoạn cao sẽ được tiến hành xác

định các nhóm hợp chất chính có mặt trong phân đoạn, định lượng phenolic tổng,

định tính bằng sắc ký lớp mỏng và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa Từ kết quả thu

được sẽ lựa chọn ra phân đoạn có tiềm năng nhất để tiến hành tách chiết các hợp

chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm Ngây

Với EtOAc Với cloroform

Nhóm hợp chất

Phản ứng định tính Hiện tượng

Cao phân đoạn Eter Cloro-form

Etyl acetat Nước Alkaloid

Flavonoid

triperpenoid

So sánh bọt trong cột acid/kiềm - - Ngang

nhau

Ngang nhau Chú thích: (-) âm tính (+) có ít (++) có (+++) có nhiều

Kết quả định tính cho thấy:

- Trong phân đoạn cao eter có các hợp chất: Flavonoid, anthraquinon,

coumarin, steroid – triterpenoid

- Trong phân đoạn cao cloroform có mặt của các hợp chất: alkaloid, flavonoid,

anthraquinon, coumarin, steroid – triterpenoid

- Phân đoạn cao etyl acetat có các hợp chất: flavonoid, anthraquinon,

coumarin, saponin triperpen Thành phần không đa dạng như trong cao

cloroform nhưng phản ứng rõ ràng hơn Tập trung nhiều nhất là các hợp chất

flavonoid

- Phân đoạn nước có flavonoid, coumarin, saponin steroid Flavonoid phần lớn

đã được giữ lại trong phân đoạn etyl acetat Tuy nhiên một số flavonoid có

gắn với phần tử đường nên độ phân cực của hợp chất tăng lên và nằm trong

phân đoạn dịch nước còn lại

3.3.2 Kết quả định lượng phenolic

Cao cồn tổng và các cao phân đoạn được tiến hành định lượng phenolic tổng

bằng phương pháp Folin – Ciocalteu

9 Lập phương trình đường chuẩn acid gallic

Bảng 3.10: Mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD 758 nm

Hàm lượng acid gallic ( μg) OD trung bình (758 nm)

Hình 3.2: Đường chuẩn acid gallic

9 Định lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn

Dựa vào đường chuẩn acid gallic để xác định hàm lượng phenolic tổng có

trong các phân đoạn cao Phương trình hồi quy: y = 0,014x – 0,0021 R 2 = 0,9955 Bảng 3.11: Hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng và cao phân đoạn

Mẫu Khối lượng

cao (mg) OD 758 nm

Hàm lượng phenolic tổng ( μg GAE/mg)

lá Chùm Ngây có chứa hàm lượng phenolic khá cao, vì vậy có tiềm năng là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên dồi dào

Theo kết quả định lượng, trong các cao phân đoạn, hàm lượng phenolic tập

trung nhiều nhất trong cao etyl acetat, 271,822 μg GAE/mg, chiếm khoảng 22,2%

khối lượng cao Đối chiếu với kết quả định tính hóa học phân đoạn có thể thấy các

hợp chất có trong phân đoạn này là flavonoid, coumarin là những hợp chất thuộc

nhóm phenolic Vì thế, hàm lượng phenolic tổng trong phân đoạn etyl acetat cao

nhất

Phân đoạn cloroform có hàm lượng phenolic tổng cao thứ hai, 110,914 μg

GAE/mg Phân đoạn này cũng chứa khá nhiều các hợp chất phenolic, tuy nhiên các

hợp chất phenolic này có độ phân cực kém hơn so với hợp chất phenolic trong cao

etyl acetat Dựa vào kết quả định tính chóa học các phân đoạn có thể dự đoán

chúng là các anthraquinon và flavonoid dạng tự do

Cao eter có hàm lượng phenolic tổng thấp nhất, 44,528 μg GAE/mg Như

vậy ngoài những thành phần như chlorophyl, tạp, chất béo, phân đoạn này cũng có

chứa một lượng ít các hợp chất phenolic kém phân cực Các hợp chất này có thể là

flavonoid, antraquinon, coumarin ở dạng tự do

3.3.3 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn tổng các cao phân đoạn

¾ Hệ 1: Etyl acetat – metanol – nước (100 : 17 : 13)

UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử FeCl 3

Hình 3.3: Sắc ký lớp mỏng cao cồn tổng và cao phân đoạn (hệ 1)

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

1: Cao cồn tổng 2: Cao eter 3: Cao cloroform

• Dưới đèn UV 254 nm :

- Cao cồn tổng có 4 vết chất tắt quang với Rf lần lượt là: 0,11; 0,28; 0,43;

0,82

- Phân đoạn cao eter có 1 vết chất, Rf = 0,82

- Cao cloroform không có vết chất

- Cao EtOAc là nhiều vết chất nhất, các vết chất này tương đồng với các vết

trong cao tổng, nhưng đậm hơn và rõ hơn vì trong phân đoạn này, các chất

đã được giàu hóa

- Cao nước có 2 vết chất với Rf là 0,29 và 0,12

• Dưới đèn UV 365 nm:

- Cao cồn tổng chỉ quan sát thấy 1 vết phát quang màu xanh dương có Rf =

0,34 Các vết còn lại nằm tập trung ở phía trên của sắc đồ, có màu cam Đây

là các chlorophyl Vì cao cồn tổng được chiết từ lá nên lượng chlorophyl trong cao tổng là rất lớn

- Cao eter có vết chất phát quang màu cam, tương ứng với các chlorophyl

trong cao tổng

- Cao chloroform có 1 vết chất phát quang màu xanh dương Rf = 0,47

- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất (giá trị Rf trình bày trong mục 3.4.1)

- Cao nước có các 4 vết phát quang màu xanh dương có Rf lần lượt là 0,70 ;

0,47 ; 0,35 ; 0,23

• Thuốc thử FeCl 3 :

- Thuốc thử FeCl3 dùng để phát hiện phần lớn các hợp chất phenolic Quan sát sắc đồ ta thấy các vết chất bắt màu rêu với thuốc thử chủ yếu tập trung trong phân đoạn etyl acetat Vì thành phần các chất này trong cao tổng ít hơn rất nhiều so với chlorophyl nên không thể quan sát thấy các vết chất này ở sắc

đồ của cao tổng Chỉ đến phân đoạn etyl acetat, chúng được giàu hóa và có thể hiện rõ trên sắc đồ

- Trong phân đoạn cao eter, vết Rf = 0,82 có bắt màu rêu với thuốc thử, cho

thấy ngoài chlorophyl, còn có các hợp chất phenolic khác Vì đây là các

phenolic ở dạng tự do nên độ phân cực của chúng thấp, và hệ 1 là hệ khai

triển có tính phân cực cao nên các chất này tập trung lại ở phần trên của sắc

đồ, trùng lắp với các chlorophyl

¾ Hệ 2: Etyl acetat – acid formic – acid acetic – nước (100 : 11 : 11 : 27)

UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử FeCl 3

Hình 3.4: Sắc ký lớp mỏng cao tổng và cao phân đoạn (hệ 2)

So với hệ 1, hệ 2 cho sắc đồ không trãi dài từ vùng kém phân cực đến phân

cực nhưng không rõ bằng, các chất phân tách không rõ ràng, có hiện tượng kéo vệt

• Dưới đèn UV 254 nm :

- Cao tổng có có 2 vết nhạt, Rf lần lượt là 0,12; 0,29; 0,35

- Cao eter các vết tập trung ở vùng trên của sắc đồ

- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất Các vết có Rf lần lượt là 0,85 ; 0,59 ; 0,35

nằm ở phần trên cùa sắc đồ, không có những vệt tương ứng trong cao tổng

Vì trong cao tổng, các chất này chiếm tỷ lệ nhỏ, đến phân đoạn EtOAc chúng

mới được giàu hóa Các vết có Rf là 0,29 ; 0,12 phân bố ở phần dưới của sắc

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

đồ, có vệt to, đậm, và tương ứng với những vệt trong cao tổng Chúng là những hợp chất có độ phân cực lớn và chiếm tỉ lệ cao trong phân đoạn này

• Dưới đèn UV 365 nm :

- Cao eter có các vết chất phát quang màu đỏ, đó là các tạp chlorophyl

- Cao cloroform có 4 vết chất phát quang màu xanh dương, có Rf lần lượt là

0,80 ; 0,64 ; 0,41 ; 0,31

- Cao EtOAc có nhiều vết chất nhất Vết chất Rf = 0,29 tắt quang ở bước sóng

254 nm, cũng tắt quang ở bước sóng 365 nm Các vết chất còn lại có màu xanh dương, không nhìn thấy dưới đèn 254 nm, chúng có Rf lần lượt là 0,80

3.3.4 Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa các cao phân đoạn

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn cao bằng phản ứng quét gốc tự do DPPH Chúng tôi lựa chọn phương pháp này vì đây là phương pháp đơn giản, tiến hành nhanh, và đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn Khả năng chống oxy hóa của một chất càng mạnh khi khả năng cho proton

H+ của chất đó sang tác nhân oxy hóa, một gốc tự do, càng cao Trong phản ứng này, DPPH được xem như một gốc tự do cần H+ DPPH sẽ mất màu tím khi đã nhận thêm được 1 H+, nghĩa là gốc tự do đã bị loại trừ nhờ chất chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của cao cồn tổng và các cao phân đoạn được khảo sát trên nhiều nồng độ khác nhau, từ đó xác định được khoảng tuyến tính giữa nồng

độ với khả năng chống oxy hóa của từng loại cao chiết

Bảng 3.12: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cồn tổng

Mẫu cao cồn tổng Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Hình 3.5: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng

Bảng 3.13: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao eter

Mẫu cao eter Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Bảng 3.14: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao cloroform

Mẫu cao cloroform Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Hình 3.7: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cloroform

Bảng 3.15: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao etyl acetat

Mẫu cao etyl acetat Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Bảng 3.16: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao nước

Mẫu cao nước Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Hình 3.9: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao nước

Bảng 3.17: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitamin C

Chứng dương vitamin C Ống Nồng độ ( μg/ml)

OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng

Dựa vào phương trình hồi quy, tính được giá trị IC50 là nồng độ quét được

50% gốc tự do DPPH Các mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính chống oxy hóa

Hình 3.11: Giá trị IC 50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng và

các cao phân đoạn

- Theo kết quả ở bảng 3.17 và hình 3.9, IC50 của cao cồn tổng là 95,26

μg/ml, của vitamin C là 7,41 μg/ml cho thấy cao cồn tổng từ lá Chùm Ngây có hoạt tính chống oxy hóa khá cao

- Trong các cao phân đoạn, cao etyl acetat là có hoạt tính chống oxy

hóa mạnh nhất 24,59 μg/ml, tiếp đó là cao phân đoạn cloroform 148,35 μg/ml Theo kết quả định lượng phenolic tổng, đây cũng là phân đoạn tập trung nhiều hợp chất phenolic nhất Những hợp chất phenolic có nhiều nhóm OH tự do, các OH tự do này thường dễ dàng nhường proton H+ cho các chất oxy hóa Khả năng này tạo nên hoạt tính trung hòa các gốc tự do, do đó các cao chiết có chứa càng nhiều các hợp chất phenolic thì hoạt tính chống oxy hóa theo cơ chế quét gốc tự do cần H+ càng cao Trong hai phân đoạn này thì phân đoạn etyl acetat có IC50 thấp hơn nhiều lần so với phân đoạn cloroform

- Cao eter có giá trị IC50 cao nhất 287,79 và thứ hai là cao nước 206,69 thể hiện hoạt tính rất yếu, hoạt tính quét gốc tự do DPPH là do các phenolic và flavonoid ở dạng tự do Vì hàm lượng phenolic trong phân đoạn cao eter thấp nên có hoạt tính chống oxy hóa yếu Tương tự với phân đoạn nước, chứa chủ yếu là các đường khử, polyuronic Có thể xem hai phân đoạn này không có hoạt tính chống oxy hóa

- Như vậy etyl acetat là phân đoạn chủ đạo quyết định hoạt tính chống

oxy hóa của cao tổng Hoạt tính chống oxy hóa ở lá Chùm Ngây liên quan trực tiếp đến nhóm hợp chất phenolic Nhóm phenolic là thành phần chủ đạo và quy định hoạt tính chống oxy hóa trong cao phân đoạn etyl acetat lá Chùm Ngây Giá trị IC50 của phân đoạn etyl acetat chỉ cao gần 2 lần so với chứng dương vitamin C, điều này chứng tỏ các hợp chất trong phân đoạn này có hoạt tính chống oxy hóa rất cao