Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu một số cơ sở khoa học nhằm bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững một số loài trong chi kim tuyến (anoectochilus blume) ở việt nam

Trong vòng ba thập kỷ lại đây, với những bước nhảy vọt của các hoạt động khoa học đã dẫn đến sự đánh giá đúng tầm quan trọng và giá trị dược liệu của các loài Kim tuyến, nâng cao nhận th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHAN XUÂN BÌNH MINH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG

MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus

Blume) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHAN XUÂN BÌNH MINH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CƠ SỞ KHOA HỌC NHẰM BẢO TỒN, PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG BỀN VỮNG

MỘT SỐ LOÀI TRONG CHI KIM TUYẾN (Anoectochilus

Blume) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành : Thực vật

Mã số : 9 42 01 11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Minh Hợi

TS Phạm Hương Sơn

HÀ NỘI - 2019

: Indol butyric acid : International Union for Conservation of Nature : Knudson

: Light Emitting Diode (Điốt phát quang) : Murashige & Skoog

: α- Naphthaleneacetic Acid : Nuclear Magnetic Resonance : Thidiazuron

: Thin layer chromatography : Vacin& Went

: World Health Organization : World Wide Fund For Nature

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được cảm ơn tới sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của hai thầy hướng dẫn khoa học PGS TS Trần Minh Hợi - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và TS Phạm Hương Sơn - Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ Khoa học & Công nghệ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Ban lãnh đạo, phòng đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể học tập nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ tận tình và những ý kiến đóng góp của PGS TS Nguyễn Tiến Đạt, TS Dương Đức Huyến, cùng sự động viên giúp đỡ tận tình của toàn thể cán bộ Trung tâm Sinh học Thực nghiệm- Viện Ứng dụng Công nghệ, phòng Hoạt chất Sinh học – Viện Hoá sinh biển, phòng Tài nguyên Thực vật – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến cácVQG, KBTTN và các địa phương đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện những nghiên cứu khảo sát điều tra và thu thập mẫu vật

Tôi cũng xin cảm ơn nhiệm vụ bảo tồn và phát triển nguồn gen “Khai thác và

phát triển nguồn gen Lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.) và Bạch Tật Lê (Tribulus terrestris L.) làm nguyên liệu sản xuất thuốc, đề tài nghiên

cứu khoa học cơ bản mã số 106 – NN 99- 2013 41 cùng toàn thể các nhà khoa học thuộc nhiệm vụ và đề tài nói trên đã hỗ trợ kinh phí, cung cấp mẫu vật giúp tôi hoàn thành luận án Sau cùng không thể không nhắc tới, đó là sự động viên khích lệ cùng

sự giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp tôi có thêm nghị lực để hoàn thành đề tài luận án này

Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tất cả sự giúp đỡ trên

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Nghiên cứu sinh

Phan Xuân Bình Minh

LƠI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào Các số liệu tham khảo có trích dẫn nguồn rõ ràng

Nghiên cứu sinh

Phan Xuân Bình Minh

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU 15

1 Tính cấp thiết của đề tài luận án 15

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài luận án 16

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 16

4 Những điểm mới của luận án 16

5 Bố cục của luận án 17

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 18

1.1 Khái quát về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 18

1.1.1.Vị trí phân loại của chi Kim tuyến 18

1.1.2 Điều kiện sống và vùng phân bố 21

1.1.3 Giá trị của chi Kim tuyến: 22

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) trên thế giới 24

1.2.1 Đa dạng loài 24

1.2.2 Thành phần hoạt chất và giá trị dược liệu của chi Kim tuyến 27

1.2.3 Nhân giống, nuôi trồng và bảo tồn các loài thuộc chi Kim tuyến 33

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến ở Việt Nam 40

1.3.1 Đa dạng loài 40

1.3.2 Giá trị dược liệu 42

1.3.3 Tình hình nhân giống nuôi trồng và bảo tồn ở Việt Nam 43

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 46

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 46

2.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 46

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 46

2.2 Nội dung nghiên cứu 47

2.3 Phương pháp nghiên cứu 48

2.3.1 Phương pháp thu thập số liệu ngoài thực địa 48

2.3.1.1 Điều tra thực địa và thu thập mẫu vật 48

2.3.1.2 Phương pháp phỏng vấn người cung cấp thông tin quan trọng 48

2.3.1.3 Phương pháp đánh giá nhanh nông thôn (PRA) 48

2.3.2 Phương pháp phân loại và giám định tên loài 48

2.3.3 Phương pháp xác định các hợp chất có hoạt tính sinh học 48

2.3.3.1 Phương pháp chiết tổng 48

2.3.3.2 Phương pháp phân lập 49

2.3.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 51

2.3.4 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy in vitro 51

2.3.4.1 Phương pháp nhân giống in vitro từ chồi 51

2.3.4.2 Phương pháp nhân giống in vitro từ hạt 52

2.3.4.3 Phương pháp lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp. 52

2.3.4.4 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu 53

2.3.5 Phương pháp nuôi trồng ex vitro 53

2.3.5.1 Phương pháp nuôi trồng trong nhà lưới 53

2.3.5.2 Phương pháp nuôi trồng dưới tán rừng 53

2.3.5.3 Phương pháp xử lý và thống kê số liệu 54

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 Đặc điểm hình thái, phân bố của chi Kim tuyến ở Việt Nam 55

3.1.1 Đặc điểm hình thái 55

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của Kim tuyến trung bộ (A annamensis Aver.) 57

3.1.1.2 Hình thái của Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver.) 59

3.1.1.3 Đặc điểm hình thái của Giải thuỷ tím (Anoectochilus elwesii C.B Clarke ex Hook.) 62

3.1.1.4 Đặc điểm hình thái của Lan sứa (A lylei Rolfe ex Downie.) 64

3.1.1.5 Đặc điểm hình thái của Kim tuyến tơ (A setaceus Blume) 68

3.1.2 Khảo sát phân bố của 5 loài thuộc chi Kim tuyến 71

3.1.2.1 Phân bố của Kim tuyến trung bộ (A annamensis Aver.) 73

3.1.2.2 Phân bố của Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver.) 74

3.1.2.3 Phân bố của Giải thuỳ tím (A elwesii C.B Clarke ex Hook.) 74

3.1.2.4 Phân bố của Kim tuyến lyle (A lylei Rolfe ex Downie) 74

3.1.2.5 Phân bố của Kim tuyến tơ (A setaceus Blume) 75

3.2 Thành phần hoá học của hai loài Kim tuyến (A setaceus Blume và A annamensis Aver.) 77

3.2.1 Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất trong Kim tuyến tơ ( A setaceus) 78

3.2.1.1 Phân lập các hợp chất 78

3.2.2 Phân lập và xác định cấu trúc hoá học của các chất trong cây Kim tuyến trung bộ ( A annamesis) 89

3.2.2.1 Các hợp chất được phân lập 89

3.2.2.2 Cấu trúc các hợp chất 91

3.3 Hiện trạng khai thác, sử dụng và buôn bán các loài thuộc chi Kim tuyến 99

3.3.1 Hiện trạng khai thác 100

3.3.2 Hiện trạng sử dụng và buôn bán và quản lý các loài Kim tuyến tại địa phương 103

3.4 Giải pháp bảo tồn và phát triển các loài thuộc chi Kim tuyến

(Anoectochilus Blume) 106

3.4.1 Giải pháp nhân giống và nuôi trồng ba loài Kim tuyến (Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle) 106

3.4.1.1 Giải pháp nhân giống ba loài Kim tuyến Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 107

3.4 1.2 Giải pháp nuôi trồng Kim tuyến 133

3.4.2 Giải pháp quản lý và tuyên truyền 143

3.4.2.1 Giải pháp quản lý 143

3.4.2.2 Giải pháp tuyên truyền 144

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 146

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 148

TÀI LIỆU THAM KHẢO 149

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Hiện trạng phân bố của 5 loài trong chi Kim tuyến( Anoectochilus Blume) 72

Bảng 3.2: Danh sách các chất phân lập từ Kim tuyên tơ (A setaceus) 87

Bảng 3.3: Danh sách các chất phân lập được từ Kim tuyến trung bộ 97

Bảng 3.4: Sản lượng khai thác và thu mua Kim tuyến tại 16 điểm khảo sát 101

Bảng 3.5: Tỷ lệ các hộ khai thác và sử dụng các loài thuộc chi Kim tuyến 103

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến khả năng sinh mầm của Kim tuyến tơ, Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 4 tuần 107

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ đến giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu của hai loài Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 4 tuần nuôi cấy 109

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và chất kích đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến trung bộ nuôi cấy in vitro 111

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và nồng độ BAP đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến lyle khi nuôi cấy in vitro 113

Bảng 3.10: Ảnh hưởng của môi trường khoáng và nồng độ BAP đến khả năng nảy mầm của hạt Kim tuyến tơ khi nuôi cây in vitro 115

Bảng 3.11: Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến giai đoạn nhân nhanh của hai loài Kim tuyến trung bộ và Kim tuyến lyle sau 8 tuần nuôi cấy 118

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên quá trình sinh nhân nhanh trưởng 3 loài Kim tuyến Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy 121

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng lên sự sinh trưởng và phát triển của mầm Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy 124

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của NAA; IBA đền Kim tuyến trung bộ ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy 128

Bảng 3.15: Ảnh hưởng của NAA; IBA đền Kim tuyến lyle ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy 129

Bảng 3.16: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình ra rễ của ba loài Kim tuyến (Kim tuyến trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ) sau 6 tuần nuôi cấy 131

Bảng 3.17: Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Kim tuyến

trung bộ, Kim tuyến lyle và Kim tuyến tơ sau 16 tuần nuôi trồng 134

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của mùa vụ trồng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của Kim tuyến tơ sau 16 tuần nuôi trồng ngoài tự nhiên 136 Bảng 3.19: Mức độ gây hại của các loại sâu bệnh hại chính trên cây Kim tuyến tơ (03/2014- 2/2015) 139 Bảng 3.20: Đề xuất các địa điểm bảo tồn các loài thuộc chi Kim tuyến (Anoectochilus

Blume) 130

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Anoectochilus koshunensis: a Hoa; b Cây mọc trong tự nhiên 21

Hình 1.2: Anoectochilus zhejiangensis: a Cây mọc trong tự nhiên; b Hoa 21

Hình 1.3: Anoectochilus trong tự nhiên 22

Hình 1.4: Một số sản phẩm từ A formosanus 33

Hình 1.5: Mô hình nhân giống và nuôi trồng A formosanus tại Đài Loan 38

Hình 1.6: Một số sản phẩm từ Kim tuyến của Việt Nam 43

Hình 3.1: Hình ảnh mô tả phác hoạ chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) 56

Hình 3.2 : Hình thái Kim tuyến trung bộ (A annamensis Aver.) 58

Hình 3.3 : Kim tuyến trung bộ A annamensis Aver.- 59

Hình 3.4 : Hình thái Kim tuyến đá vôi (A calcareus Aver ) 61

Hình 3.5 : Kim tuyến đá vôi Anoectochilus calcareus Aver 62

Hình 3.6: Hình thái Giải thuỳ tím (A elwesii C.B Clarke ex Hook.) 64

Hình 3.7: Anoectochilus elwesii C.B Clarke ex Hook.- Hình thái Giải thuỳ tím 64

Hình 3.8 : Hình thái Kim tuyến lyle (A lylei Rolfe ex Downie) 67

Hình 3.9: Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie - Kim tuyến lyle 68

Hình 3.10: Hình thái Kim tuyến tơ (A setaceus Blume ) 70

Hình 3.11: Kim tuyến tơ (Anoectochilus setaceus Blume) 71

Hình 3.12 : Các loài Kim tuyến mọc ngoài tự nhiên: 76

Hình 3.13: Sơ đồ phân bố năm loài thuộc chi Kim tuyến 77

Hình 3.14: Cấu trúc hợp chất ARE3.5 80

Hình 3.15: Cấu trúc hợp chất ARW10.1 81

Hình 3.16: Cấu trúc hợp chất ARW4.5 82

Hình 3.17: Cấu trúc hợp chất ARW11.4 83

Hình 3.18: Cấu trúc hợp chất ARW5.2 84

Hình 3.19 Cấu trúc hợp chất ARW12.2 85

Hình 3.20: Cấu trúc hợp chất stigmasterol 86

Hình 3.21: Cấu trúc hợp chất benzyl-β-D-glucopyranoside 86

Hình 3.22: Cấu trúc hợp chất methylarbutin 87

Hình 3.23: Cấu trúc của hợp chất AAH9.10 91

Hình 3.24: Cấu trúc của hợp chất AAE14.13 và các tương tác chính HMBC (→),COSY (▬)NOESY ( ) 92

Hình 3.25a: Phổ 1H NMR của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) 92

Hình 3.25b: Phổ 13C NMR của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 150 MHz) 93

Hình 3.25c: Phổ DEPT của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 150 MHz) 93

Hình 3.25d: Phổ HSQC của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) 94

Hình 2.25e: Phổ HMBC của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) 95

Hình 3.25f: Phổ NOESY của hợp chất AAE14.13 (CD3OD, 500 MHz) 95

Hình 3.26: Cấu trúc của hợp chất AAH8.2 95

Hình 3.27: Cấu trúc của hợp chất AAH10.9 96

Hình 3.28: Cấu trúc của hợp chất AAH8.15 97

Hình 3.29: Thực trạng khai thác và mua bán Kim tuyến ở Việt Nam 106

Hình 3.30: Sự phát triển của mầm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường 110

Hình 3.31: Hạt và mầm Kim tuyến trung bộ 116

Hình 3.32: Mầm Kim tuyến trung bộ sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 119

Hình 3.33a: Mầm Kim tuyến lyle sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung: a 0,5 mg TDZ; b 1 mg BAP 120

Hình 3.33 b: Mầm Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung; a 0,5 mg TDZ; b 1 mg BAP 120

Hình 3.34: Mầm Kim tuyến tơ sau 8 tuần nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc 80 vòng/phút 123

Hình 3.34: Sử dụng hệ thống chiếu sáng đèn LED trong nuôi cấy in vitro 127

Hình 3.35: Kim tuyến sau 8 tuần nuôi cấy dưới hệ thống chiếu sáng đèn LED có bước sóng λ= 470- 510 nm 128

Hình 3.36: Kim tuyến trung bộ sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung: a, 0.5 mg NAA; b, 0.5 IBA mg 129

Hình 3.37: Kim tuyến lyle sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung: 131

Hình 3.38: Kim tuyến lyle sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5mg/l

NAA: 133

Hình 3.39: Kim tuyến sau 14 tuần nuôi trồng trong nhà lưới 135

Hình 3.40: Kim tuyến sau 14 tuần nuôi trồng ngoài tự nhiên 137

Hình 3.41: Một số hình ảnh của nhện đỏ son hại Kim tuyến tơ 140

Hình 3.42: Ốc sên hại Kim tuyến và vết cắn trên cây 141

Hình 3.43: Sên trần 142

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài luận án

Chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) thuộc họ Lan (Orchidaceae Juss.),

trên thế giới có khoảng 50 loài Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tiến Bân và cộng sự (2005) chi Kim tuyến có 12 loài [2] Trong đó năm loài có tên trong Sách đỏ Việt

Nam, đó là: Anoectochilus acalcaratus Aver., Anoectochilus calcareus Aver., A

chapaensis Gagnep., A setaceus Blume, A tridentatus Seidenf ex Aver.) Theo

Averyanov L (2008), chi Anoectochilus Blume ở Việt Nam có 7 trong tổng số 30 loài của khu vực châu Á nhiệt đới [36] Chi này nằm trong Danh mục Thực vật rừng

nguy cấp, quý hiếm (nhóm IA) của Nghị định số 32/2006/NĐ- CP ngày 30/3/2006 của Chính phủ nghiêm cấm khai thác, sử dụng vì mục đích thương mại Cần bảo tồn các phần quần thể nhỏ còn sót lại ở các Vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên Bên cạnh đó cần nghiên cứu nhân giống để phát triển vùng trồng tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo tồn nguồn gen Tuy nhiên, bằng nhiều cách khác nhau các loài thuộc chi Kim tuyến vẫn bị khai thác tận diệt để bán ra thị trường nước ngoài qua đường tiểu ngạch Cũng giống như Việt Nam, các loài thuộc chi Kim tuyến trên thế giới cũng bị thu hái ngoài tự nhiên trong các cánh rừng nguyên sinh và rừng đã khai thác tầng cây ưu thế để buôn bán trên thị trường dược liệu Hiện tại, nguồn tài nguyên này đang bị đe doạ nghiêm trọng bởi môi trường sống bị suy thoái, diện tích rừng

đã bị biến đổi, khai thác quá mức nguồn Kim tuyến ngoài tự nhiên Nhiều loài có ý

nghĩa khoa học (đa dạng về nguồn gen, tính đặc hữu) như: Anoectochilus

koshunensis, Anoectochilus sandvicensis, Anoectochilus zhejiangensis và giá trị sử

dụng cao (đặc biệt dùng làm thuốc) như: Anoectochilus setaceus, Anoectochilus

formosanus, Anoectochilus koshunensis …đang đứng trước nguy cơ bị tuyệt chủng

trong tự nhiên Trong vòng ba thập kỷ lại đây, với những bước nhảy vọt của các hoạt động khoa học đã dẫn đến sự đánh giá đúng tầm quan trọng và giá trị dược liệu của các loài Kim tuyến, nâng cao nhận thức rằng nhân giống và nuôi trồng các loài Kim tuyến là một khả năng hiện thực để bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững các loài Kim tuyến Ở Việt Nam cho đến nay, các nghiên cứu về chi Kim tuyến còn rất hạn chế Vì vậy cần thiết phải tìm giải pháp bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững chi Kim tuyến, đặc biệt là các loài có giá trị Đó cũng là lý do thực hiện đề tài

luận án “Nghiên cứu một số cơ sở khoa học nhằm ảo tồn, phát triển và sử

dụng ền vững một số loài trong chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) ở Việt Nam” nhằm đánh giá thực trạng và giá trị của các loài thuộc chi Kim tuyến và đề

xuất các giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững các loài này là rất cần thiết, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài luận án

Nghiên cứu đặc điểm hình thái, phân bố, hiện trạng, thành phần hoá học và phương pháp nhân giống và nuôi trồng của một số loài thuộc chi Kim tuyến làm cơ

sở để đề xuất giải pháp bảo tồn, phát triển và sử dụng bền vững các loài thuộc chi Kim tuyến ở Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Ý nghĩa khoa học

Cung cấp, bổ sung dẫn liệu khoa học mới về chi Kim tuyến (Anoectochilus

Blume) ở Việt Nam như phân bố 5 loài, thành phần hoạt chất của 2 loài

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Là cơ sở khoa học cho việc phát triển và sử dụng bền vững một số loài trong

chi Kim tuyến ( Anoectochilus Blume) ở Việt Nam

4 Những điểm mới của luận án

- Đây là công trình khoa học nghiên cứu tương đối đầy đủ và mang tính hệ thống (các đặc điểm sinh học, sinh thái, phân bố) về 5 loài Kim tuyến có giá trị ở

Việt Nam (Anoectochilus annamensis, A calareus, A elwesii, A lylei và A

+ 6 hợp chất từ loài A annamensis, trong đó có 1 hợp chất mới là 4‟,

5-dihydroxy-3,3‟, 7- trimethoxyflavone 4‟-O-α-L-rhamnopyranosyl- glucopyranoside

(1→6)-β-D Nghiên cứu xác định các căn cứ khoa học, để nhân giống thành công 3 loài

A annamensis, A lylei và A setaceus bằng phương pháp nuôi cấy in vitro từ hạt và

chồi

- Đề xuất một số giải pháp ban đầu, mang tính khả thi nhằm nhân giống, nuôi trồng để bảo tồn ở điều kiện chuyển chỗ (ex situ) kết hợp với bảo tồn tại chỗ (in

situ) về 3 loài A annamensis, A lylei và A setaceus

- Điều tra, đánh giá, thu thập được một số thông tin về hiện trạng khai thác,

buôn bán, tiêu thụ một số loài Kim tuyến tại 3 VQG, 2 KBTTN và một vài khu vực

- Chương 1: Tổng quan các vấn đề nghiên cứu: 30 trang

- Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu: 9 trang

- Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận: 94 trang

- Kết luận và kiến nghị: 2 trang

- Tài liệu tham khảo: 17 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume)

Chi Kim tuyến (Anoectochilus) bao gồm khoảng 40 - 50 loài thảo mộc nhỏ

trên mặt đất khác nhau từ dãy Himalaya ở Ấn Độ đến các dãy núi của Đông Nam Á, miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia, và một số quần đảo Thái Bình Dương Tên Anoectochilus xuất phát từ tiếng Hy Lạp để chỉ những loài cây có hoa nhỏ nhưng có cánh môi lớn mở rộng và chia thành hai thuỳ Ngoài ra, nhiều loài thuộc chi này còn có đặc trưng bởi những đường vân lá cầu kỳ nổi bật lấp lánh màu hồng, bạc hoặc vàng Ở mức độ địa phương, Kim tuyến được biết đến là một loại dược liệu quý có tác dụng bồi bổ sức khoẻ, trị rắn cắn và các bệnh gan, phổi Những người dân địa phương sử dụng Kim tuyến mọc trong rừng như một món quà thiên nhiên ban tặng để tăng cường sức khoẻ

Vị trí phân loại của chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) Chi Kim

tuyến (Anoectochilus) được Carlvon Blume mô tả lần đầu tiên năm 1825, là

một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan (Orchidaceae) Trên thế giới, chi này có khoảng gần 50 loài [160; 161]

Danh sách các loài thuộc chi Kim tuyến (nguồn: https://www.theplantlist.org)

1 Anoectochilus albolineatus E.C.Parish & Rchb.f

2 Anoectochilus albomarginatus Loudon

3 Anoectochilus annamensis Aver

4 Anoectochilus baotingensis (K.Y.Lang) Ormerod

5 Anoectochilus brevilabris Lindl

6 Anoectochilus burmannicus Rolfe

7 Anoectochilus calcareus Aver

8 Anoectochilus chapaensis Gagnep

9 Anoectochilus daoensis Gagnep

10 Anoectochilus dewildeorum Ormerod

11 Anoectochilus elatus Lindl

12 Anoectochilus emeiensis K.Y.Lang

13 Anoectochilus falconis Ormerod

14 Anoectochilus flavescens Blume

15 Anoectochilus formosanus Hayata

16 Anoectochilus geniculatus Ridl

17 Anoectochilus grandiflorus Lindl

18 Anoectochilus hainanensis H.Z Tian, F.W Xing& L.Li

19 Anoectochilus imitans Schltr

20 Anoectochilus insignis Schltr

21 Anoectochilus integrilabris Carr

22 Anoectochilus kinabaluensis (Rolfe) J.J.Wood & Ormerod

23 Anoectochilus klabatensis (Schltr.) S Thomas

24 Anoectochilus koshunensis Hayata

25 Anoectochilus longicalcaratus J.J.Sm

26 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie

27 Anoectochilus monicae J.J Wood

28 Anoectochilus narasimhanii Sumathi & al

29 Anoectochilus nicobaricus N.P Balakr & P Chakra

30 Anoectochilus papuanus (Schltr.) W.Kittr

31 Anoectochilus pectinatus (Hook.f.) Ridl

32 Anoectochilus petelotii (Gagnep.) Seidenf

33 Anoectochilus pingbianensis K.Y Lang

34 Anoectochilus reinwardtii Blume

35 Anoectochilus rhombilabius Ormerod

36 Anoectochilus sandvicensis Lindl

37 Anoectochilus setaceus Blume

38 Anoectochilus sikkimensis King & Pantl

39 Anoectochilus subregularis (Rchb.f.) Ormerod

40 Anoectochilus sumatranus (J.J.Sm.) J.B.Comber

41 Anoectochilus tetrapterus Hook.f

42 Anoectochilus tridentatus Seidenf

43 Anoectochilus xingrenensis Z.H.Tsi & X.H.Jin

44 Anoectochilus yatesiae F.M.Bailey

45 Anoectochilus zhejiangensis Z.Wei & Y.B.Chang

Trong đó có 3 loài có tên trong danh lục đỏ của thế giới, đó là: Anoectochilus

koshunensis, Anoectochilus sandvicensis và Anoectochilus zhejiangensis [162]

Anoectochilus koshunensis được tác giả Hayata mô tả và phân loại năm

1914 nhưng không có chú thích về mẫu vật (Synonyms: Odontochilus koshunensis

(Hayata) Ying S.S.1996) Loài này được tìm thấy ở quần đảo Ryukyu và Đài Loan trong các cánh rừng lá rộng, thường xanh ở độ cao từ 700 đến 2000 m Cây thân thảo nhỏ, ít lá 3-6 lá mọc so le, lá mặt trên màu xanh đậm có đường vân kim tuyến màu vàng hoặc màu trắng Cây ra hoa vào mùa hè và đầu mùa thu, hoa màu trắng

A koshunensis bị đe doạ tuyệt chủng do tình trạng khai thác quá mức Cho đến nay,

Đài Loan đã nhân giống và nuôi trồng được chúng nhưng các thông tin còn chưa được cập nhật đầy đủ

Anoectochilus sandvicensis Lindl là loài phổ biết nhất trong ba loài hoa

phong lan đặc hữu ở quần đảo Hawaii Loài này phân bố hầu hết trên các hòn đảo chính dưới tán cây râm mát Thân thảo nhỏ, lá màu xanh, hoa màu vàng xanh Mối đe dọa chính của loài này là các loài xâm hại, đặc biệt là loài ốc sên

Anoectochilus zhejiangensis & Y.B.Chang là loài thân thảo nhỏ cao khoảng

8-16cm, cây có 2-6 lá hình trứng, mặt trên màu xanh đen, mặt dưới màu đỏ nâu, hoa màu trắng Cây ra hoa từ tháng 7- 9 Loài này phân bố trong những khu rừng rậm ở độ cao 700- 1200 m ở các tỉnh Phúc Kiến, Quảng Tây, Chiết Giang Trung Quốc Loài này có nguy cơ tuyệt chủng do vùng phân bố hẹp và bị khai thác quá mức [80]

Hình 1.1: Anoectochilus koshunensis mọc tự nhiên tại Đài Loan:

a Hình thái hoa; b Cây mang hoa

( Ảnh: Lan Fu Wang)

Hình 1.2: Anoectochilus zhejiangensis mọc tự nhiên tại Chiết Giang:

a Cây mang hoa; b hình thái hoa

( Ảnh: C.H Lamoureux)

1.1.2 Điều kiện sống và vùng phân bố

Hầu hết các loài Kim tuyến sống dưới tán rừng rậm có độ che phủ cao 80-90%, trên tầng mùn, dưới gốc cây, trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to, trên những thân cây mục trong rừng ẩm, rừng mưa nhiệt đới, rừng lá rậm thường xanh, rừng tre nứa ở độ cao 400-1.700 m Các loài thuộc chi này đa phần ưa

độ ẩm cao và ưa bóng râm, kỵ ánh sáng, yêu cầu đất nhiều mùn, tơi xốp, thoáng khí Vùng phân bố: Các loài Kim tuyến phân bố trên một khu vực khá rộng, từ vùng Himalaya đến Đông Nam Á, miền Nam Trung Quốc, Úc, Papua New Guinea và

một số hải đảo, quần đảo thuộc Thái Bình Dương

Theo Alec M và cộng sự (2003), chi Anoectochilus bao gồm khoảng 30 loài cây

nhỏ trên mặt đất, trên lớp mùn hoặc rêu đá trong những cánh rừng rậm nhiệt đới thuộc các quốc gia: Sri Lanka, Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Đài Loan- Trung Quốc, Myanma, Lào, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippin, Nhật Bản, Indonesia, Papua New Guinea, các quần đảo Solomon, Vanuatu, New Calidonia, Fiji và Samoa [33]

Hình 1.3: Phân ố của Anoectochilus trong tự nhiên

a A burmannicus mọc trên đá; b A setaceus dưới tán rừng ẩm;

c A albolineatus mọc trên tầng đất mùn trong tự nhiên

(Ảnh: Daylily SLP)

1.1.3 Giá trị của chi Kim tuyến:

Ngoài giá trị làm cảnh, một số loài thuộc chi Kim tuyến được ví như thần dược nhờ công dụng chữa bệnh phong phú và đa dạng Theo y học cổ truyền, Kim

tuyến được mô tả là cây thân thảo nhỏ mọc từ đất, có vị ngọt, hơi chát, tính mát Bộ

c

phận dùng là toàn thân, được thu hái quanh năm, rửa sạch, dùng tươi hoặc khô Cây

có tác dùng chữa thần kinh suy nhược, tăng cường sức khỏe, chữa bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; còn có tác dụng

bổ máu, giải nhiệt Theo dược điển của Đài Loan, Kim tuyến chữa trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; còn có tác dụng

bổ máu, giải nhiệt Kim tuyến có tác dụng tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn, chữa các bệnh viêm khí quản Cách điều trị là đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương và chỗ rắn cắn Trong sách “Thạch thảo gia đình tư liệu” của Trần Đào Thích viết Trẻ em hay khóc đêm dùng loài thảo mộc này sắc uống sẽ khỏi Theo Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào (1958) Kim tuyến là một trong những dược thảo quý giá, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan Trong nghiên cứu điều tra của Cam Vĩ Tùng (1964) cũng cho thấy Kim tuyến là một vị thuốc rất quý giá trong các tiệm thuốc bắc Đài Loan, là cây thuốc mang tính mát và có vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chủ trị lục phủ ngũ tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận

Những người dân miền núi thường dùng Kim tuyến sắc uống, giúp chữa trị đau bụng, đau ruột, sốt cao, hoặc đắp bên ngoài chỗ vết thương bị rắn cắn, các chỗ sưng Trẻ em hay khóc dùng kim tuyến liên sắc uống sẽ khỏi Kim tuyến có tính kháng khuẩn, giúp chữa các bệnh viêm gan mãn tính, bệnh viêm khí quản Ngoài ra, cây thuốc còn có công dụng trị các bệnh như thần kinh suy nhược, đau lưng, phong thấp, chữa ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận, làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, chữa di tinh Kim tuyến dùng cả cây tươi hoặc khô sắc uống Liều dùng trong ngày khoảng 20g tươi hoặc 5g khô Có thể dùng cả cây tươi giã nát đắp chỗ vết thương sưng đau

Một số bài thuốc từ Kim tuyến của phòng khám đông y Thọ Xuân Đường như sau:

1) Bài thuốc chữa thần kinh suy nhược, mất ngủ: 25g lan gấm, 12g hoa nhài, 10g hoa thiên lý, 8g tâm sen, 8g ngưu tất, 15g mạch môn, 10g huyền sâm, 20g quyết minh tử, 8g cam thảo đất, 12g hoài sơn, sắc uống Mỗi ngày sắc 1 thang, chia

làm 3 lần trong ngày, dùng 3 – 5 thang

2) Bài thuốc chữa kém ăn: 25g lan gấm, 8g liên nhục, 6g sơn tra, 5g trần bì, 20g huyền sâm, 5g quyết minh tử, 10g hoài sơn, sắc uống Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang

3) Bài thuốc chữa ho khạc ra máu: 30g lan gấm, 15g ngưu tất, 15g quyết

minh tử, 20g hoài sơn, 20g huyền sâm, 25g mạch môn, sắc uống Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang

Y học hiện đại đã phân tích và xác định được Anoectochilus chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kì quan trọng bao gồm: Flavonoid (quercetin, isorhamnetin), steroid (24 ~ isopropenyl cholesterol, sterol, ergosrol, stigmasterol, campesterol, sitosterol β-), trierpenoids (friedelin, axít succinic, axít coumaric, axít ferulic, daocosterol, axít palmitic, axit aleanolic, axít bearberry) và đường (polysaccharides 13,32%, oligosacharides 11,24%, đường đơn 9,73%), alkaloid, glycoside tim mạch, este, taurine, axít amin, các chất khoáng đa lượng và vi lượng….Thành phần polysaccharide, taurine, axít amin và các chất khoáng đa vi

lượng có trong Anoectochilus còn cao hơn cả loài nhân sâm mọc hoang dã nên còn

được xưng tụng là Nam Trùng Thảo

1.2 Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) trên thế

giới

Những kết quả nghiên cứu về chi Kim tuyến trên thế giới chủ yếu tập trung ở Trung Quốc, ngoài ra, còn có các quốc gia như Ấn Độ, Thái Lan và các nước Đông Nam Á khác Nhưng nghiên cứu về chi Kim tuyến đi theo ba hướng chính là nghiên cứu về đa dạng thực vật (thành phần loài, vùng phân bố, thực trạng…), nghiên cứu

về giá trị dược liệu, nghiên cứu về giải pháp nhân giống và nuôi trồng

1.2.1 Đa dạng loài

Chi Kim tuyến (Anoectochilus) với khoảng 40- 50 loài trên thế giới được

phân bố ở khắp các vùng lục địa Châu Á, Úc, Papua, New Guinea và một số hải đảo thuộc quần đảo Thái Bình Dương Các kết quả nghiên cứu thành phần loài, vùng phân bố hay đặc điểm hình thái, sinh thái của các loài thuộc chi Kim tuyến tập trung

ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á, nơi có số lượng các loài Lan nói chung và chi Kim tuyến nói riêng phong phú và đa dạng vào bậc nhất

trên thế giới [153, 155]

Tại Trung Quốc, các loài thuộc chi Anoectochilus phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Đông Nam, phía Nam và đảo Hải Nam Theo Chen SC và cộng sự (2008), ghi nhận có 11 loài thuộc chi Anoectochilus phân bố ở nhiều vùng khác nhau đó là: A

pingbianensis Lang phân bố trong những cánh rừng ẩm ở độ cao 1500m tại tỉnh Hồ

Nam; A burmanicus Rolfe phân bố ở độ cao 1000- 2200 m tại tỉnh Hồ Nam và trên thế giới tại các nước như Lào, Myanma, Malaysia và Thái Lan A koshunensis Hayata phân bố trong những cánh rừng rậm thường xanh ở độ cao 700-2000 m tại Đài Loan; A xingrenensis Z.H.Tsi & X.H Jin phân bố ở độ cao 1200 m tại Quảng Châu; A baotingensis (Lang) Ormerod phân bố ở độ cao 300- 400m trên các sườn

đá trong rừng tại đảo Hải Nam; A formosanus Hayata phân bố trong những khu

rừng rậm thường xanh và rừng tre nứa ở độ cao 500-1500m tại Đài Loan và đảo

Ryukyu (Nhật Bản); A hainanensis Tian, Xing & Li phân bố trong các khu rừng ẩm ướt tại đảo Hải Nam A roxburghii (Wallich) Lindley là loài có vùng phân bố

tương đối rộng trong các khu rừng ẩm ở độ cao từ 100-1600m tại nhiều tỉnh ở Trung Quốc như Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Nam, Hải Nam, Hồ Nam, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang… Ngoài ra, trên thế giới còn phân bố ở Bangladesh,

Bhutan, Ấn Độ, Nhật Bản, Nê Pan, Lào, Thái Lan; A chapaensis Gagnep phân bố

ở độ cao 1300-1400m tại Vân Nam Trung Quốc và Việt Nam; A zhejiangensis Wei

& Chang phân bố ở độ cao 700- 1200m tại các tỉnh Chiết Giang, Phúc Kiến, Quảng

Tây; A emeiensis Lang phân bố trong các khu rừng rậm ở độ cao 900m của tỉnh

Tứ Xuyên [45] Tuy nhiên ngay sau đó, Chen WH và cộng sự (2010) đã ghi nhận

và công bố loài mới A malipoensis phân bố tại tỉnh Vân Nam [46], tiếp đó Tian

HZ và cộng sự (2014) tiếp tục công bố loài mới là A longilobus có hình thái tương

tự như A zhejiangensis Wei & Chang và A chapaensis Gagnep nhưng hoa và lá có

kích thước lớn hơn và chúng phân bố trong các khu rừng rậm ở độ cao 1550m tại Vân Nam [133] Ngoài ra, Hu C và cộng sự (2012) còn chỉ ra rằng, vùng

phân bố của A lylei không chỉ có ở Thái Lan, Việt Nam mà chúng còn được

mở rộng đến Vân Nam Trung Quốc [70] Những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy thành phần loài và vùng phân bố của các loài thuộc chi Kim tuyến được mở rộng tại Trung Quốc nhưng trữ lượng của các loài này trong tự nhiên

đang bị suy giảm mạnh do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó có nguyên nhân khai thác tận diệt làm dược liệu

Tại Ấn Độ, theo ghi nhận của Mira S (2007) họ Lan (Orchidaceae) có 1331 taxon và 185 chi phân bố trên toàn lãnh thổ, trong đó có chi Kim tuyến

(Anoectochilus) chủ yếu phân bố ở phía Đông và phía Tây của dãy Himalaya và các

tỉnh phía Nam [109] Theo Kumar CK & Manilal KS (1994) chi này tại Ấn Độ có

16 loài trong đó có 7 loài đặc hữu [89] Sau đó Sumathi R và cộng sự (2013) đã

công bố một loài mới có tên khoa học là Anoectochilus narasimhanii Sumathi,

Jayanthi, Karthigeyan & Sreek vùng phân bố của loài là quần đảo Andaman, Ấn

Độ trong các khu rừng thường xanh ở độ cao 650m, mẫu vật được các nhà khoa học thu được tại Vườn quốc gia Saddle Peak [130] Năm 2015, Singh B phát hiện thêm

vùng phân bố cho loài Anoectochilus papillosus Aver được tác giả mô tả và phân

loại năm 2007, vùng phân bố là Mai Châu, Hoà Bình ở Việt Nam đến phía tây dãy Hymalaya Ấn Độ Loài này được tìm thấy trong các khu rừng nhiệt đới và á nhiệt đới ở độ cao 700- 1350m tại Meghalaya, phía Tây Khasi Hills, Mawthabah, Ấn Độ [128, 36] Còn tại các quốc gia Đông Nam Á cũng được ghi nhận là có khoảng hơn

20 loài thuộc chi Kim tuyến trong đó số lượng loài lớn là ở Thái Lan và Việt Nam Tại những quốc gia này, các nghiên cứu về thành phần loài và vùng phân bố cũng

đã có nhưng chưa được quan tâm nhiều như tại Trung Quốc và Ấn Độ [142]

Ngoài những nghiên cứu đa dạng loài bằng phương pháp hình thái học còn

có những nghiên cứu đa dạng loài bằng phương pháp sinh học phân tử Tác giả

Cheng KT và cộng sự (1998) đã dựa trên các chỉ thị RAPD để phân biệt 02 loài A

formosanus và A koshunensis và các loài lai giữa chúng nhanh và chính xác Trong

khi sự khác biệt về hình thái của hai loài trên có nhiều điểm giống nhau khó nhận biết Trong nghiên cứu này, 40 đoạn mồi (primer) ngẫu nhiên được sàng lọc qua đó thu được 19 chỉ thị RAPD đặc trưng loài từ phản ứng chuỗi (PCR), cùng với 08

primer ngẫu nhiên Trong 19 chỉ thị đặc trưng, 09 chỉ thị đặc chưng cho A

formosanus và 10 chỉ thị đặc trưng A koshunensis Các chỉ thị RAPD có thể được

áp dụng cho cả việc xác định các loài A formosanus và A koshunensis và để đánh

giá mức độ lai tạo ở các giống lai giữa chúng rất có ích cho việc nuôi trồng và phát triển hai loài Kim tuyến nói trên [47] Zeng Xu và cộng sự (2016) cũng đã giải mã

hoàn chỉnh trình tự lục lạp của A setaceus Bộ gen của lục lạp (cpDNA) ^ có chiều

dài 152.802 bp, chứa một cặp lặp lại 52.728 bp được phân tách bằng một vùng đơn sao chép lớn và một vùng sao chép đơn nhỏ tương ứng là 82.641 bp và 17.433 bp

Bộ gen của lục lạp mã hóa 116 gen dự đoán, bao gồm 81 gen mã hóa protein, bốn gen RNA ribosome và 31 gen RNA vận chuyển, trong đó có 25 gen được sao chép

ở các vùng lặp lại đảo ngược [153] Một nghiên cứu khác Lv T (2015) và cộng sự

cũng đã dựa trên mã vạch DNA, để xác định chính xác và nhanh chóng A setaceus

và các loài liên quan chặt chẽ với nó [103]

1.2.2 Thành phần hoạt chất và giá trị dƣợc liệu của chi Kim tuyến

Công dụng lớn nhất của các loài Kim tuyến được biết đến là sử dụng làm dược liệu Từ xa xưa người dân địa phương ở các vùng núi hay các quần đảo nơi có sự phân bố của các loài thuộc chi Kim tuyến đã biết sử dụng các loài này

để chữa rắn cắn, mất ngủ Đặc biệt, tại Trung Quốc một số loài Kim tuyến phổ

biến như: A formosanus Hayata hay A setaceus Blume được coi như những vị

thuốc quý không thể thiếu trong rất nhiều bài thuốc chữa các bệnh khác nhau Trong cuốn Hoa lan làm thuốc Châu Á có chỉ ra rằng, các loài thuộc chi Kim tuyến được nhiều quốc gia sử dụng làm dược liệu, đặc biệt là các quốc gia

Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal, Malayxia, Thái Lan và Việt Nam…[132]

Đối với y học hiện đại, giá trị dược liệu của một số loài thuộc chi Kim tuyến

đã được các nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam khẳng định Kim tuyến được coi là một loại “thần dược” vì có tác dụng chữa bệnh đa dạng, cây có tính mát, vị ngọt, thanh nhiệt, thanh huyết, bổ phổi, giải trừ u uất, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, chữa trị lục phủ ngũ tạng đẩy lùi tâm hỏa, nóng gan, bệnh phổi, thổ huyết, ho hen, đau ngực, đau lá lách, đau cuống họng, cao huyết áp, trẻ con chậm lớn, suy thận, như dùng sắc uống để trị bệnh đường ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị các chỗ sưng vết thương, mất ngủ [65]

Theo Hu SY và cộng sự (1971), A formosanus Hayata có tác dụng chữa

bệnh đau tức ngực, viêm phế quản [71] Tác giả Chiu NY và Chang Cs (1995) cho rằng, uống trà làm từ loài kim tuyến này chữa các chứng bệnh gan, phổi, tiểu đường, viêm thận và kháng vi rút [49] Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Kan WS

(1986) cho thấy loài này rất tốt cho người huyết áp cao, yếu sinh lý, gan, rối loạn lá lách, viêm màng phổi, phòng ngừa u bướu và chữa các bệnh tim mạch [83] Nghiên

cứu của Mak OT và công sự (1990) cũng cho thấy A formosanus chứa các chất ảnh

hưởng đến arachidonic chuyển hóa axit, có liên quan đến chức năng của hệ tim mạch [105] Nghiên cứu của Lin JM và cộng sự (1993) thì cho thấy dịch chiết từ loài Kim tuyến này có khả năng kháng viêm rất tốt [97] Ngoài ra các nghiên cứu

khác cũng cho thấy dịch chiết A formosanus có khả năng kháng virus, kháng sưng

viêm, bảo vệ gan và tăng cường sức khỏe [99, 98], Wang SY và cộng sự (2002) đã

chiết xuất từ A formosanus các hợp chất: 4-hydroxycinnamic acid, sitosterol,

β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid là những chất có khả năng chống

ô xy hóa mạnh [141], Wang LF và cộng sự (2002) đã phân lập được một hợp chất mới là kinsenone và một số flavonoid glycosides đã biết như quercetin và

isorhamnetin từ dịch chiết A formosanus có đặc tính chống oxy hóa mạnh [138] Tại Nhật Bản, Ikeuchi M và cộng sự (2005) đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết A

formosanus trên chuột, kết quả cho thấy dịch chiết này có tác dụng làm giảm đáng

kể sự tích lũy chất béo trong gan, dạ dày và cơ bắp nhờ cơ chế kích hoạt việc sử dụng lipid nhiều hơn glucose để tạo thành nguồn năng lượng cho hiệu suất [79]

Theo Lin WC (2007), A formosanus Hayata đã được sử dụng làm thuốc kháng

viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ thể và kháng virus cúm A Nhiều nghiên cứu đã

phát hiện A formosanus Hayata chứa hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên

quan đến chức năng tim mạch [98] Kết quả nghiên cứu của Wang LF và công sự

(2005) cũng đã cho thấy dịch chiết của A formosanus chất chống oxy hóa mạnh

[138] Năm 2006 tác giả Tseng CC và công sự đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết của

A formosanus cho hoạt động ức chế tế bào ung thư đại tràng trên chuột kết quả cho

thấy sau 12 ngày sử dụng liên tục tỷ lệ hạn chế khối u là 40,5% ở liều 50mg/con/ngày Ngoài ra dịch chiết này còn có tác dụng tăng cường miễn [135] Nghiên cứu của Hsieh CC và công sự năm (2010) đã chứng minh dịch chiết của loài

A formosanus có khả năng điều chỉnh bài tiết cytokine và tế bào T bằng cách điều

chỉnh sự xâm nhập của tế bào viêm và điều chỉnh phản ứng dị ứng trong hen suyễn

dị ứng và làm tăng khả năng ức chế miễn dịch trong viêm phổi dị ứng và thâm nhiễm viêm đường hô hấp [69] Những nghiên cứu của Shih CC và công sự (2004,

2005) cho thấy dịch chiết của loài này có tác dụng điều trị các bệnh gây tổn thương gan, cải thiện các thay đổi và thúc đẩy tái tạo tế bào gan, sử dụng trong điều trị xơ gan [125, 126] Tiếp theo đó nghiên cứu của Hsiao HB và cộng sự

(2011) cho thấy kinsenoside được phân lập từ dịch chiết A formosanus còn có

thể hạn chế việc sản xuất chất trung gian gây viêm và tăng cường chống viêm thế hệ cytokine Do đó, kinsenoside có thể làm giảm bớt các nguy cơ viêm cấp tính [72] Ngoài ra kết quả nghiên cứu của Wu JB và cộng sự (2006) cũng cho thấy kinsenoside cũng là hợp chất hoạt động mạnh nhất trong hoạt động ức chế viêm gan mạn tính gây ra bởi CCl4 ở chuột [143] Hợp chất 3(R)-3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide có tên thương mại là Kinsenoside được chiết xuất từ

các loài A formosanus, A koshunensis và A setaceus có giá trị dược liệu rất cao,

những nghiên cứu thử nghiệm chất này đã được tiến hành trên chuột cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, đặc biệt là khả năng bảo vệ gan Trên

mô hình gây độc cho tế bào gan BALB/c bởi H2O2 cho thấy, cho chuột uống kinsenosid làm tăng rõ rệt các giá trị LD50 của H2O2 so với mẫu đối chứng Carbon tetrachloride (CCL4) là nguyên nhân gây viêm gan mãn, dẫn tới sự gia tăng hydroxyprolin trong gan, trọng lượng lá lách, hàm lượng GPT trong huyết thanh và làm giảm hàm lượng albumin trong huyết tương, những nghiên cứu cũng cho thấy

sử dụng cao chiết từ A formosanus có tác dụng ức chế viêm gan mãn tính gây ra

bởi CCL4 [148] Tác giả Shyur LF và cộng sự (2015) cũng đã chứng minh rằng, chất chiết xuất từ A formosanus hoạt động gây độc tế bào với cơ chế cụ

thể, trên các tế bào khối u, có liên quan đến sự cảm ứng của apoptosis (chu kỳ

tự chết của tế bào), tương tự như các cách thức và cơ chế tác dụng apototic trên

tế bào ung thư gây ra bởi thuốc chống ung thư Nghiên cứu này đã được cấp

dịch chiết A setaceus bằng ethanol, kết quả có năm hợp chất được phân lập từ

phần hòa tan CHCl-3, được xác định là: p-Hydroxybenzaldehyde, axit ferulic,

quercetin, daucosterol và cirsilineol Tất cả các hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ thực vật [64] Sau đó He CN và cộng sự (2006) đã phân lập được tám hợp

chất từ các phần etyl axetat và n-butanol - hòa tan của chiết xuất etanol trong cây A

setaceus Trên cơ sở các phương pháp quang phổ, cấu trúc của các hợp chất này

được xác định là: quercetin-7 ‐ O-β ‐ D‐ [6 ”‐O‐ (trans-feruloyl)] - glucopyranoside (hợp chất 1), 8 ‐ C ‐ p‐ Hydroxybenzylquercetin (hợp chất 2), isorhamnetin ‐ 7 ‐ O ‐

β ‐ D ‐ glucopyranoside (hợp chất 3), isorhamnetin ‐ 3 ‐ O ‐ β ‐ D ‐ glucopyranoside (hợp chất 4), kaempferol ‐ 3 ‐ O ‐ β ‐ D ‐ glucopyranoside ( hợp chất 5), kaempferol

‐ 7 ‐ O ‐ β ‐ D ‐ glucopyranoside (hợp chất 6), 5 ‐ hydroxy ‐ 3 ′, 4 ′, 7 ‐ trimethoxyflavonol ‐ 3 ‐ O ‐ β ‐ D ‐ rutinoside (hợp chất 7) và isorhamnetin ‐3 ‐ O ‐

β ‐ D ‐ rutinoside (hợp chất 8) Trong số các hợp chất được phân lập, hợp chất 1 là một glucoside flavonoid mới và có hoạt tính chống oxy hóa Các hợp chất 2 và 8 là hợp chất lần đầu tiên thu được trong chi Kim tuyến [63] Những nghiên cứu tiếp

theo của Cai JY và cộng sự (2007, 2008) đã phân lập được 10 hợp chất có trong A

setaceus là: β–D–glucopyranosyl- (3R)–hydroxybutanolide, stearic acid, palmitic

acid, β-sitosterol, succinic acid, p-hydroxy benzaldehyde, daucosterol, methy1 4–β–D–glucopyranosyl–butanoate; p–hydroxy cinnamic acid và o–hydroxy phenol Trong đó các hoạt chất β–D–glucopyranosyl- (3R)–hydroxybutanolide, daucosterol

và o–hydroxy phenol là các hợp chất được phân lập lần đầu tiên [39, 40] Tác giả Han MH và cộng sự (2008) cũng đã phân lập được hai hợp chất este mới là

sorghumol 3–O–Z–p–coumarate và sorghumol 3–O–E–p–coumarate và một hợp

chất alkaloid mới là triterpenoid Cấu trúc của các hợp chất này được xác định dựa trên việc phân tích các dữ liệu phổ NMR hai chiều (1H–1H COSY, HSQC and HMBC) [62]

Tác giả Huang LY và cộng sự (2007) đã sử dụng phương pháp chiết siêu tới hạn (Quá trình chiết được thực hiện bằng cách sử dụng CO2 làm chất lỏng siêu tới hạn và etanol làm chất bổ trợ) để chiết Axit oleanolic và axit ursolic là hai hợp chất

hoạt tính sinh học quan trọng có tác dụng kháng viêm trong dịch chiết A setaceus

[74] Sau đó Huang LY và cộng sự (2011) đã sử dụng phương phá sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao để chiết 02 hợp chất Ergosterol và stigmasterol là hai hợp

chất sterol chính của loài A Setaceus được chứng minh là những hợp chất có hoạt

tính sinh học rất quan trọng Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp này hiệu

quả hơn nhiều so với các phương pháp thông thường [75] Kết quả nghiên cứu của

Cai WY (2008) cho thấy chiết xuất của A setaceus có khả năng kháng khuẩn thông

qua cơ chế ức chế sự trao đổi chất, ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn [41] Cui SC và cộng sự (2013) cũng đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết và chống

oxy hóa của dịch chiết nước từ A setaceus trên chuột với chuột đái tháo đường liều

2 g/kg/ngày trong 14 ngày đã làm giảm đáng kể đường huyết và gia tăng đáng kể trong các hoạt động của các chất chống oxy hóa enzyme trong gan và thận của chuột tiểu đường [50] Tác giả Liu Q và cộng sự (2014) đã phân lập được dẫn xuất 3-hydroxybutanolide có tên kinsenbenol và một flavonoid glucoside mới có tên

roxburoside từ A setaceus Kết quả nghiên cứu này làm bổ sung các chất có hoạt tính chống oxy hoá của A setaceus [101] Tác giả Wang XX và các cộng sự (2011)

đã sử dụng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân và phổ sắc ký lỏng khối phổ để

xác định thành phần hoạt chất trong dịch chiết A setaceus Kết quả đã xác định

được tám flavonoid, bốn axit hữu cơ và p-hydroxybenzaldehyde, trong đó năm hoạt

chất lần đầu tiên được công bố trong A setaceus Các hợp chất này đã được chứng

minh là các chất hoạt tính sinh học chính chịu trách nhiệm cho các hoạt động dược

lý như thuốc trị đái tháo đường, chống đông máu, chống viêm, kháng virus, bảo vệ gan, bảo vệ thận, điều hòa miễn dịch, thuốc giảm đau, thuốc an thần và hiệu ứng

chống ung thư Vì vậy một loạt các dạng bào chế của A setaceus hiện đang được áp

dụng cho bệnh nhân bị tăng acid uric máu, đái tháo đường type 2, viêm gan B mãn

tính, nhiễm Helicobacter pylori, hen suyễn ho và các bệnh khác[140]

Ngoài những công bố về thành phần hoạt chất và giá trị dược liệu của hai loài Kim tuyến kể trên còn có những công bố về thành phần hoạt chất và giá trị dược liệu của các loài khác Kết quả nghiên cứu của Ito A và cộng sự (1994) cũng

cho thấy các hợp chất được phân lập từ A koshunensis là: glucoside megastigmane

; 2'-deoxyadenosine; 26-methylstigmasta-5,22,25 và (27) -trien-3 β-ol là các chất

có giá trị [75] Zeng SJ và cộng sự (1993) cũng đã phân lập được glucoside aliphat

3- (R) -3-β-d-glucopyranosyloxybutanolide (kinsenoside) từ A koshunensis [152]

Một nghiên cứu khác của tác giả Cai JY và cộng sự (2014) được tiến hành trên

chuột cũng chỉ ra rằng số hoạt chất có trong A chapaensis Gagnep có khả năng

chống tăng đường huyết và chống ô xy hoá cao, đặc biệt là khả năng đề kháng insulin [41] Ngoài ra, tác giả và các cộng sự (2015) đã phân lập được một flavonol triglycosid mới, isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranosyl (1 → 2) -α-Lrhamnopyranosyl(1 → 6) -β-D-glucopyranoside, được gọi là elwesoside A, cùng

với sáu chất Flavonols đã biết là isorhamnetin, isorhamnetin-3-O-β-D-glucosid, isorhamnetin-3-O-β-D-rutinosid, kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl (1→2)-α-L-

rhamnopyranosyl, (1→6)-β-D-glucopyranosid, quercetin và rutin, đã được phân lập

từ loài A elwesii Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng phân tích dữ liệu

phổ kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo Tất cả các hợp chất đều lần đầu tiên

được phân lập từ loài A elwesii và hai trong số đó (flavonol triglycosid và

(1→6)-β-D-glucopyranosid) là những flavonol triglycosid lần đầu tiên được phân lập từ

chi Anoectochilus Các hợp chất này được đánh giá trên các tế bào HepG2 kháng

insulin để kích thích hoạt động hấp thu glucose Tất cả các hợp chất trên là kết quả lần đầu tiên trong cây này và trong đó, có hai hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ chi Anoectochilus, hai hợp chất này có khả năng kích thích sự hấp thụ glucose trong tế bào HepG2 kháng insulin ở người [42] Tại Thái Lan nghiên cứu của Truong TK và công sự (2014) cũng cho thấy các hoạt tính chống oxy hoa của

A.burmannicus cũng tương tự như ở A setaseus [134] Tiếp theo đó nghiên cứu của

Budluang B và cộng sự (2017) cũng đã khẳng định dịch chiết nước của

A.burmannicus có các hoạt tính sinh học là: chống oxy hóa, chống viêm và kháng

insulin Bên cạnh đó, dịch chiết cải thiện đáng kể sự hấp thu glucose trong yếu tố hoại tử khối u Ngoài ra, ở nồng độ lên tới 200 μg / mL dịch chiết cũng không gây độc đối với tế bào đơn nhân máu ngoại biên của con người (PBMCs) và không gây

đột biến Vì vậy có thể bổ sung dịch chiết nước A burmannicus như tác nhân chống

viêm, kháng insulin, hoặc bổ sung thực phẩm để phòng ngừa các bệnh mãn tính [37] Tất cả những nghiên cứu trên cho thấy giá trị và tầm quan trọng của các loài thuộc chi Kim tuyến Hiện nay trên thị trường thế giới cũng có rất nhiều những sản phẩm có nguồn gốc từ các loài Kim tuyến như: Kim tuyến khô, trà kim tuyến, các hoạt chất chiết từ các loài Kim tuyến … vì vậy những nghiên cứu nhằm đưa ra giải pháp bảo tồn, khai thác và sử dụng hợp lý các loài thuộc chi Kim tuyến là cần thiết

Hình 1.4: Một số sản phẩm từ A formosanus

a Kim tuyến khô; b Thực phẩm chức năng từ Kim tuyến;

c Trà Kim tuyến; d trà Sâm và Kim tuyến

2 Nhân giống, nuôi trồng và bảo tồn các loài thuộc chi Kim tuyến

Do nhiều nguyên nhân khác nhau như: Sự biến đổi khí hậu, diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp, mất cân bằng của hệ sinh thái và quan trọng hơn là do sự khai thác quá mức của con người vì mục đích thương mại dẫn đến trữ lượng của các loài Kim tuyến trong tự nhiên bị suy giảm mạnh, trong đó, có những loài rất hiếm gặp trong

tự nhiên như: A chapaensis, A kosshunesis, A sandvicensis, A zhejiangensis…

[80] Tại Trung Quốc, chi Kim tuyến được đưa vào danh mục các loài thực vật cần được bảo tồn và phát triển theo chương trình cử chính phủ [134] Các nhà khoa học

Trung Quốc đã sớm nhận ra được giá trị và tầm quan trọng của chi Anoectochilus

nên từ những năm 90 của thế kỷ trước tại các quốc gia này đã có những kết quả

nghiên cứu về nhân giống và nuôi trồng một số loài thuộc chi này như A

formosanus và A setaceus…

Đa số các loài Kim tuyến phát triển theo mùa, phát triển mạnh vào mùa xuân

và mùa hè và tàn lụi vào mùa đông, cây đơn thân, dễ bị tác động do các yếu tố ngoại cảnh Thêm vào đó là cây có thể tái sinh bằng chồi và hạt trong tự nhiên, nhưng quá trình tái sinh từ chồi diễn ra rất chậm, còn quá trình tái sinh từ hạt lại ít được thấy ngoài tự nhiên Do đặc tính sinh học, sinh thái của các loài Kim tuyến là quá trình nảy mầm của hạt phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường nên chúng chỉ diễn

ra trong điều kiện môi trường sinh thái rất thuận lợi và có sự hỗ trợ của vi sinh vật

Vì vậy những giải pháp bảo tồn nguyên vị gặp nhiều khó khăn

Sớm nhận thấy giá trị dược liệu của các loài Kim tuyến, các nhà khoa học Trung Quốc đã chú trọng đến các giải pháp nhân giống, nuôi trồng nhằm bảo tồn nguồn gen quý hiếm này Khởi đầu cho những nghiên cứu này là Chow HT và cộng

sự (1982) đã nhân giống thành công A formosanus bằng môi trường MS [49] Tiếp theo, Shiau YJ và cộng sự (1996) đã thử nghiệm nhân giống in vitro từ hạt A

formosanus trong môi trường khoáng MS cho kết quả khả quan, năm 2002 tác giả

và cộng sự đã chỉ ra rằng quy trình tối ưu cho sản xuất nhân giống A formosanus sử dụng hạt giống như sau những cây A formosanus thu được từ môi trường tự nhiên

được đưa về nuôi trồng trong điều kiện môi trường có kiểm soát, sau khi ra hoa sẽ tiến hành thụ phấn nhân tạo Hạt giống được 7 tuần tuổi tiến hành nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung than hoạt tính và chuối cho tỷ lệ nảy mầm là 77,9% Sau khi hạt nảy mầm phát triển tốt khi nuôi cấy trong môi trường ½ MS có bổ sung 2 mg/l

BA và 0,2% than hoạt tính, 8% dịch chuối Môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh là môi trường ½ MS có bổ sung BA 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l Cây khi ra vườn ươm được nuôi trong điều kiện môi trường thích hợp bằng giá thể rêu

và than bùn có tỉ lệ cây sống khá cao khoảng 80% [123, 124]

Những nghiên cứu tiếp theo của Chang CN và cộng sự (2007) gieo hạt trên môi trường Hypronex có bổ sung các chủng nấm được phân lập từ rễ các loài lan giúp tăng tỉ lệ nảy mầm và tăng sinh khối trong quá trình nhân nhanh, tác giả cũng

đã đưa ra giải pháp bổ sung các chủng nấm và trồng A formosanus trong môi

trường bao gói bằng túi nhựa được gọi là phương pháp PBCM (Plastic bag cultivation) đem lại hiệu quả và năng suất cao, phòng chống được các loại nấm bệnh sau 6-8 tháng sẽ cho thu hoạch [43] Kết quả nghiên cứu của Lee GC (2001)

nhân giống in vitro A formosanus từ tế bào lá, rễ có bổ sung các chủng nấm cộng sinh đem lại hiệu quả cao [90] Kết quả nghiên cứu của Zhou Y và cộng sự (2009)

cho thấy, môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh là môi trường MS được bổ sung thêm 0,1mg/l TDZ, 5% dừa và 3% đường MS với BA 0,1mg/l, IBA 0,5mg/l,

và 2g/l than hoạt tính là môi trường thích hợp cho quá trình ra rễ Trong nuôi trồng rêu là chất nền tốt nhất và Hyponex có thành phần (N: P: K = 20: 20: 20) là dung

dịch dinh dưỡng tối ưu đối với cây con A formosanus [157]

Kết quả nghiên cứu của Zhang F và cộng sự (2013) cho thấy các chủng nấm không chỉ thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ mà còn làm gia tăng hàm lượng các hoạt chất Nghiên cứu này sử dụng chủng nấm F-23

(chi Mycena) bổ sung cho môi trường nuôi cấy A formosanus, kết quả sau 10

cộng sinh tác cộng sinh: tăng chiều chồi, trọng lượng chồi và số lượng lá lần lượt là 16,6%, 31,3% và 22,5%; tăng hàm lượng kinsenosides, isorhamnetin-3-O-β-d-rutinoside, và isorhamnetin-3-O-β-d-glucopyranoside lần lượt là 85,5%,

226,1% và 196,0% [154] Đến nay tại Đài Loan Trung Quốc loài A formosanus đã

được nhân giống, nuôi trồng và khai thác phục vụ mục đích thương mại Để đáp

ứng nhu cầu cho nghành dược và giảm áp lực khai thác nguồn tự nhiên cho loài A

formosanus tác giả Yoo YJ và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu

tố ảnh hưởng đến việc sản xuất sinh khối A formosanus Những yếu tố này bao

gồm mật độ chồi, nồng độ sucrose ban đầu, môi trường nuôi cấy, cường độ ánh sáng Mật độ chồi 8 g/L phù hợp nhất cho sự phát triển của chồi; tích tụ sinh khối được tối ưu hóa khi môi trường được bổ sung 3% sucrose so với môi trường không

có đường sucrose hoặc môi trường có nồng độ 6% hoặc 9%, cường độ chiếu sáng là

50 μmol/ m2/ s , thành phần môi trường thích hợp là: môi trường khoáng HY có

bổ sung nước dừa (50 mL/ L ) và than hoạt tính (0,5 mg/ L) Đây là để thiết lập hệ

thống sản xuất sinh khối A formosanus [147]

Bên cạnh những kết quả nghiên cứu nhân giống, nuôi trồng A formosanus thì những nghiên cứu nhân giống nuôi trồng A setaceus cũng được thực hiện, Tác

giả Fan ZN và cộng sự (1997) nhân giống thành công loài này bằng cánh sử dụng

biện pháp nuôi cấy in vitro từ đốt thân trong môi trường có pH thích hợp là 5,4- 5,6,

môi trường khoáng thích hợp là MS [57] Tác giả Gao WW và Guo SX (2002) cũng

đã nghiên cứu bổ sung các chủng nấm nhằm gia tăng sinh khối trong nhân giống in

vitro A setaceus [60] Wang YJ và cộng sự (2009), cũng đã sử dụng các loại nấm

được phân lập từ rễ của các loài thuộc họ Lan cho cấy cộng sinh vào cây giống

A.setaceus Kết quả cho thấy, cây tăng trưởng 2,04 lần so với đối chứng [139] Tác

giả Shiau và cộng sự (2002) cũng cho thấy rằng, khi cấy cộng sinh chủng nấm

Bacillus subtilis BS87 vào hai loài A setaceus và A formosanus không những làm

gia tăng năng suất mà còn gia tăng hàm lượng flavonoid, steroid và tinh dầu [125]

Tác giả Tang MJ và cộng sự (2008) cũng nghiên cứu ảnh hưởng của nấm

Epulorhiza sp đối với sự phát triển của A setaceus bằng cách bổ sung loài nấm

này vào môi trường nuôi trồng kết quả cho thấy cấy đạt tỷ lệ sống là 100% Trọng lượng tươi và khô của cây tăng lần lượt là 1,83và 1,28 lần so với đối chứng không

bổ sung nấm [131] Nghiên cứu của Li B và cộng sự (2012) cho thấy nấm

Mycorrhizal được phân lập tử rễ của A setaceus trong tự nhiên khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro cây này sau 60 ngày nuôi cấy cây phát triển rõ rệt

nhờ sự thúc đẩy sự tăng của nấm [94] Tác giả Dan Y và công sự (2011) đã sử dụng 42 chủng nấm được phân lập từ rễ của các cây họ Lan nuôi cấy cộng sinh

trong môi trường nhân giống in vitro A setaceus sau 40 ngày nuôi cấy đã sàng lọc

được 8 chủng nấm giúp cây chủ sinh trưởng và phát triển So với cây đối chứng, các cây con được cấy trong môi trường có bổ sung 8 chủng nấm nói trên có tỷ lệ tăng từ 25,61-59,76% chiều cao và tương ứng là 33,33-61,67% trọng lượng Kết

quả nghiên cứu này là tiền đề để thiết lập hệ công sinh nấm trong nhân giống A

setaceus để phát triển vùng trồng [52] Nhưng tác giả Zhang A và cộng sự (2015)

lại cho rằng phương pháp bổ sung nấm vào môi trường nhân giống in vitro

A.setaceus khi triển khải thực nghiệm trên quy mô lớn không phải phương pháp

hiệu quả Kết quả nghiên cứu của tác giả và công sự cho thấy phương pháp hiệu quả khi thực hiện nhân giống trên quy mô lớn là sử dụng chồi đốt thân của cây A setaceus đã được thuần hóa cấy trong môi ½ Murashige và Skoog (MS) bổ sung 1,5 mg/LBA cho tỷ lệ hình thành chồi là 91,67% Chồi tiếp tục được cấy trong môi trường ½ MS có bổ sung 3,0 mg/L BA, 1,0 mg/L Kn, 0,5 mg/L NAA và các chất phụ gia cho hệ số nhân chồi là 4,33 Môi trường ra rễ thích hợp cho cây là ½

MS có bổ sung 0,6 mg/L NAA, 0,3 mg/L IBA và 100 mg/L dịch chuối cho tỉ lệ

cây ra rễ là 93,33% Những cây con đã ra rễ đã được đưa ra ngoài trồng trên giá thể hỗn hợp đất cát và than bùn vô trùng theo tỉ lệ 1: 2, và bề mặt được bao phủ bởi rêu sống cho tỷ lệ sống của cây con là 90,2% Đây là phương pháp sử dụng hiệu quả để phát triển quy mô lớn nhằm bảo tồn Loài cây thuốc, cây cảnh đang nguy cấp này [149] Để phát triển vùng trồng Shao QS và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chỉ số hình thái của cây con bao gồm chiều cao cây, đường kính gốc, lượng lá, trọng lượng tươi của cây và tỷ lệ chiều cao của đường kính được đo và các thành phần chính được phân tích để xác định chỉ số phân loại cây giống Thí nghiệm được đặt để theo dõi các chỉ số về tăng trưởng và phát triển của cây trồng, năng suất và chất lượng Kết quả cho thấy rằng chiều cao

và đường kính gốc được xác định là chỉ số chất lượng của việc phân loại tiêu chuẩn cây giống Kết quả cho thấy việc phân loại cây giống đã ảnh hưởng đến sự phát triển và năng suất của cây nhưng không có ảnh hưởng rõ ràng đến chất lượng của cây Kết quả của nghiên cứu này đã cung cấp cơ sở cho việc xây dựng tiêu

chuẩn cây giống của A setaceus [119] Từ những kết quả nghiên cứu thu được hiện nay tại Đài Loan – Trung Quốc đã có những nhà vườn nhân giống và nuôi trồng A

formosanus trên quy mô lớn

Hình 1.5: Mô hình nhân giống và nuôi trồng A formosanus tại Đài Loan,

a Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt in vitro; b Nuôi trồng bằng phương

pháp bao màng nilon

Ngoài những kết quả về giá thể, chế độ dinh dưỡng, các chủng nấm cộng sinh, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm…, các nhà khoa học Trung Quốc đã đưa ra kết quả nghiên cứu về cường độ chiếu sáng thích hợp Ma Z và cộng sự (2010) đã cho

thấy, A formosanus trồng dưới cường độ ánh sáng thấp, mật độ Photon (PPF) từ 30

đến 50μmol/m2/s cho cả sự tăng trưởng và tổng flavonoid là cao nhất [107] Shenyi

Y và cộng sự (2017) đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng khác nhau là ánh sáng đỏ, ánh sáng xanh, ánh sáng đèn huỳnh quang và ánh sáng tự nhiên, sau

tám tháng nuôi A setaceus, kết quả cho thấy ở chế độ chiếu sáng ánh sáng xanh

đường kính thân cây, trọng lượng tươi, diện tích lá, tần suất đóng mở khí khổng, hàm lượng chlorophyll (Chl a, Chlb, Chl a + b), hoạt động của enzyme chống oxy hoá và các hợp chất hoạt tính (polysaccharides, flavones) đều lớn hơn đáng kể so với các chế độ chiếu sáng khác, còn ở chế độ chiếu sáng ánh sáng đỏ cho thấy chiều cao cây và hàm lượng phenol lớn nhất Những kết quả này cho thấy, ánh

sáng xanh không chỉ giúp cho A setaceus gia tăng sinh khối mà còn cải thiện chất

lượng [122] Kỹ thuật này có lợi cho việc sản xuất bền vững các vật liệu cây trồng

có chất lượng cao như dược liệu, rau ăn Không chỉ trong khâu nuôi trồng mà còn trong khâu nhân giống, hệ thống chiếu sáng là một nhân tố quan trọng tác động

mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây in vitro Ngày nay, trên thế giới

đã sử dụng các nguồn ánh sáng nhân tạo đèn LED (Light-emitting diode) tiết kiệm

điện trong nuôi cấy mô và đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trong đó đặc biệt

là nguồn chiếu sáng đơn sắc từ đèn LED đang được quan tâm [53, 51] Theo nghiên cứu của các nhà khoa học, việc tạo ra nguồn sáng đơn sắc theo mong muốn

là hoàn toàn thực hiện được bằng thay đổi vật liệu chế tạo và nguồn điện áp

Ngoài hiệu quả về hiệu suất hấp thu, dễ điều chỉnh cường độ sáng, đèn LED còn

có nhiều ưu điểm như: kích thước nhỏ, tuổi thọ cao, vùng quang phổ có thể kiểm soát được, ít hao tốn điện năng và ít tỏa nhiệt Việc sử dụng ánh sáng đơn sắc trong

nuôi cấy in vitro có thể khắc phục được các nhược điểm mà hệ thống chiếu sáng

truyền thống đang gặp phải [88] Hơn nữa, hệ thống chiếu sáng đơn sắc này có thể cải thiện được chất lượng cây trồng, có nhiều ưu thế hơn đến sự sinh trưởng, phát triển và các phản ứng sinh lý tích cực đối với nhiều loại cây trồng khác nhau Đối

với A setaceus, Zhou S và cộng sự (năm 2016) đã chỉ ra rằng khi sử dụng hệ

thống chiếu sáng 80% ánh sáng xanh lam và 20% ánh sáng đỏ giúp cho các chồi sinh trưởng tốt, đường kính chồi và trọng lượng chồi cao hơn so với ánh sáng trắng [150] Yen HC và cộng sự (2011) cũng cho thấy kết hợp đèn huỳnh quang

và đèn LED đỏ để chiếu sáng cho A formosanus nuôi cấy mô đem lại hiệu quả

cao và tiết kiệm năng lượng [146] Tác giả Charoensuwan J và cộng sự (2016) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đèn LED đến sự sinh

trưởng và phát triển của A roxburghii nuôi cấy in vitro kết quả nghiên cứu cho thấy với điều kiện chiếu sáng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của A

roxburghii là hệ chiếu sáng bao gồm LED xanh và đỏ với tỉ lệ 1:1[44]

Tại Ấn Độ, Gangprasad và cộng sự (2000) đã thành công khi nhân giống hai

loài được cho là có giá trị quan trọng về phong thủy của chi Anoectochilus bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Mẫu A sikkimensis King&Pantl thu được từ Sikkim

ở phía Đông dãy Himalaya và A regalis BL thu thập từ Tây Ghats ở miền Nam Ấn

Độ được nuôi trồng trong điều kiện vườn ươm, sau đó sử dụng các đốt thân nuôi cấy trong môi trường WPM, sau 12 tuần thu được hiệu suất thành công là 95% và 98% và hệ số nhân chồi là 4,8 và 5,6 cho hai loài tương ứng Sau khi nhân giống thành công, tiến hành trồng cây trong nhà kính 6 tháng sau đó chuyển đến nơi sinh sống trong tự nhiên của cây sau 12 tháng cây trưởng thành Tất cả các cây trưởng thành đều có hình thái giống với cây mẹ, không có bất kỳ sự đột biến hay khiếm khuyết nào [59] Tại Thái Lan Nitipong và cộng sự (2016) nghiên cứu ảnh hưởng

của chất điều hòa sinh trưởng Paclobutrazol đến quá trình nhân giống in vitro A

burmanicus trong môi trường khoáng Vacin và Went có bổ sung các chất phụ gia

chuối, khoai tây và nước dừa Kết quả sau 14 tuần nuôi cấy cho thấy bổ sung Paclobutrazol nồng độ 2mg/L chiều cao cây và rễ không phát triển nhưng đường kính thân gốc, độ dày lá và độ xanh lá lại gia tăng đáng kể Điều này giúp chất lượng cấy giống tốt hơn [68] Những kết quả trên đã chứng minh vai trò và giá trị của các loài thuộc chi Kim tuyến

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Kim tuyến ở Việt Nam

Nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm, Việt Nam có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng 11.000 loài thực vật trong đó có khoảng gần 4.000 loài dược liệu [3] Cộng đồng các dân tộc Việt Nam cũng có nhiều kinh nghiệm độc đáo trong việc sử dụng các loài cây cỏ để làm thuốc Trước năm 1945, đã có một số công trình nghiên cứu về cây cỏ như: Thực vật chí đại cương Đông Dương, do một số nhà thực vật người Pháp thu thập, trong

đó ghi nhận nhiều loài thực vật có giá trị làm thuốc Từ năm 1954 đến nay, công tác điều tra nghiên cứu cây thuốc đã có nhiều thành tích đáng kể như “Những cây thuốc

và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi (2000), “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của

Võ Văn Chi (2012) [5] Mặc dù đã được quan tâm điều tra, thống kê và phát hiện loài mới làm cở sở cho công tác bảo tồn nguồn gen, nhưng cho đến nay nguồn tài nguyên cây thuốc đã bị suy giảm cả về số lượng loài và trữ lượng Đó là do việc khai thác ồ ạt, môi trường bị tàn phá, nạn phá rừng làm nương rẫy dẫn đến tình trạng ngày càng cạn kiệt, nhiều loài cây thuốc quý hiếm bị suy giảm trong đó có các loài thuộc chi Kim tuyến [22] Trong khi đó, những kết quả nghiên cứu về chi này ở Việt Nam còn hạn chế, mới chỉ dừng lại ở khâu điều tra, khảo sát, kiểm kê thành phần loài Những nghiên cứu về giá trị dược liệu còn hạn chế, những nghiên cứu về

nhân giống mới chỉ được tập trung vào loài Kim tuyến tơ (A setaceus)

Đa dạng loài

Chi Kim tuyến (Anoectochilus Blume) thuộc họ Lan (Orchidaceae), là họ

thực vật lớn nhất ở Việt Nam với khoảng 900 loài thuộc 154 chi [2, 29] Cùng với

nhiều chi khác thuộc họ Lan, những kết quả nghiên cứu về thành phần loài và vùng phân bố của chi Kim tuyến đã được nhiều tác giả công bố từ những năm 90 đến nay