Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (cinnamomum cassia presl) ở việt nam và đặc tính sinh học của ho

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ Cinnamomum cassia Presl Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN

NỘI SINH TRÊN CÂY QUẾ (Cinnamomum

cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ ĐẶC TÍNH

SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG

Streptomyces cavourensis YBQ59

LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc

Hà Nội, năm 2019

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VŨ THỊ HẠNH NGUYÊN

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG, KHẢ NĂNG

CÂY QUẾ (Cinnamomum cassia Presl) Ở VIỆT NAM VÀ

ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA HOẠT CHẤT TỪ CHỦNG

Streptomyces cavourensis YBQ59

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 9 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Phí Quyết Tiến Viện Công nghệ sinh học

2 PGS.TS Chu Kỳ Sơn

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Hà Nội, năm 2019

L ỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Phí Quyết Tiến, Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS TS

Chu Kỳ Sơn, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học

Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận

án

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Thu Trang, TS Khiếu Thị Nhàn Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học

Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ, hợp tác nghiên cứu đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Gia Hy và các cán bộ phòng Công

nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cám ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt và các cán bộ phòng Hoạt

chất sinh học, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ, hợp tác trong nghiên cứu và hỗ trợ các trang thiết bị kỹ thuật tốt nhất để tôi thực hiện thành công các nghiên cứu thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào

tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình đã luôn bên tôi, cổ vũ và động viên tôi những lúc khó khăn để hoàn thành tốt luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Tác giả

NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 4

1.1.1 Giới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh 4

1.1.2 Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật 6

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược 7

1.1.4 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 9

1.2 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 11

1.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật 11

1.2.2 Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh 12

1.2.3 Đánh giá đa dạng sinh học của xạ khuẩn theo sản phẩm trao đổi chất thứ cấp 15

1.3 Sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về loài Streptomyces cavourensis 17

1.3.1 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 17

1.3.2 Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn 19

1.3.3 Nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh 24

1.3.4 Một số cấu trúc kháng sinh sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn 26

1.3.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh 27

1.3.6 Một số nghiên cứu về xạ khuẩn Streptomyces cavourensis 30

1.4 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tại Việt Nam và tiềm năng khai thác xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) 31

1.4.1 Tình hình nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh ở Việt Nam 31

1.4.2 Đặc điểm của cây quế (Cinnamomum sp.) 33

1.4.3 Tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum sp.) 34

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu 37

2.1.1 Mẫu nghiên cứu, chủng giống vi sinh vật và các dòng tế bào ung thư 37

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 37

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.1 Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu quế 38

2.2.2 Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 40

2.2.3 Phân loại các chủng xạ khuẩn dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 42

2.2.4 Xác định đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 43

2.2.5 Tách chiết, giải trình tự và phân tích hệ gen của chủng xạ khuẩn YBQ59 44

2.2.6 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp cho xạ khuẩn 46

2.2.7 Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn 47

2.2.8 Xử lý thống kê 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 48

3.2. Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 48

3.2.1 Đánh giá đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 49

3.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn nội sinh 553.2.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh sinh kháng sinh 573.2.4 Khuếch đại gen mã hóa polyketide synthases (PKS-I, PKS-II) và

nonribosomal peptide synthetase (NRPS) tham gia sinh tổng hợp kháng sinh 613.2.5 Khả năng sinh chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 62

3.3 Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của

chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 63

3.3.1 Đặc điểm sinh học của chủng S cavourensis YBQ59 64

3.3.2 Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh

của chủng S cavourensis YBQ59 67

3.3.3 Lựa chọn môi trường thích hợp sinh kháng sinh của chủng S cavourensis

YBQ59 703.3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến khả năng sinh kháng sinh 713.3.5 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S

4.1 Đa dạng và khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây

quế (C cassia Presl) 86

4.1.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) 86

4.1.2 Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 89

4.1.3 Phân tích trình tự gen 16S rDNA của xạ khuẩn nội sinh kháng sinh 92

4.2 Đặc điểm sinh học và điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 93

4.2.1 Đặc điểm sinh học của chủng S cavourensis YBQ59 93

4.2.2 Đặc điểm di truyền và một số gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 94

4.2.3 Lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 96

4.3. Tách chiết, tinh sạch và đặc tính của các hoạt chất thứ cấp từ chủng S cavourensis YBQ59 102

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114

NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 116

LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 116

TÀI LIỆU THAM KHẢO 125

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ

khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu 13

B ảng 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược

liệu 16

B ảng 1.3 Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng

trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp 22

Bảng 3.1 Số liệu thống kê hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 297 chủng xạ

khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế 56

B ảng 3.2 Kết quả phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình,

Lai Châu và Yên Bái dựa trên kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA 58

B ảng 3.3 Sự phân bố của các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây quế 60

Bảng 3.4 So sánh đặc điểm phân loại của chủng Streptomyces cavourensis YBQ59

với các chủng S cavourensis với các chủng tham chiếu 65

Bảng 3.5 Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của chủng S cavourensis YBQ59 66

Bảng 3.6 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chủng S cavourensis YBQ59 76

B ảng 3.7 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của từ dịch lên men của chủng

YBQ59 77

Bảng 3.8 Tổng hợp các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng S cavourensis YBQ59 80

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn các hợp chất tinh sạch từ chủng S cavourensis

YBQ59 84

B ảng 3.10 Hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các chất tách được từ

chủng S cavourensis YBQ59 (IC50, μM) 85

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊHình 1.1 Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S galbus MBR-5 trên lá

đỗ quyên sau 60 ngày quan sát 6

Hình 1.2 C ấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6) 18

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun

riêng biệt A synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mã hóa

bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loại

PKS-I B Mỗi mô đun có mặt trên một protein của loại PKS-II 21

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi

hai gen khác nhau Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide 22

Hình 1.5 Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline

DOX, DNR, EPI và IDA 27

Hình 1.6 Một số bộ phận của cây quế đơn (C cassia Presl) 33

Hình 3.1 Khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) tại

Hòa Bình (A), Lai Châu (B) và Yên Bái (C) phân lập trên một số môi trường đặc hiệu sau 4-6 tuần nuôi cấy 49

Hình 3.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các bộ phận của cây quế (C cassia Presl): số

liệu tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy

mẫu (B) 50

Hình 3.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh trên các môi trường phân lập khác nhau: số liệu

tổng hợp tại ba vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 51

Hình 3.4 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh theo nhóm mầu khuẩn ty: số liệu tổng hợp tại ba

vùng lấy mẫu (A); số liệu thống kê theo vùng lấy mẫu (B) 53

Hình 3.5 Đa dạng di truyền của 16 chủng xạ khuẩn nội sinh dựa trên phân tích đa

hình sản phẩm phản ứng BOX-PCR Giếng M: Thang DNA chuẩn (100

bp); Giếng 1÷16 lần lượt là: HBQ7; HBQ8; HBQ9; HBQ10; HBQ11; HBQ16; HBQ19; HBQ33; HBQ40; HBQ43; HBQ46; HBQ47; HBQ49; HBQ55; HBQ56; HBQ62 54

Hình 3.6 Hoạt tính kháng C albicans ATCC 10231 (A), P vulgaris (B), P

aeruginosa (C), S epidermidis kháng methicillin (D) tại Hòa Bình; hoạt

tính kháng S Typhimurium (E), S epidermidis kháng methicillin (F) tại

Lai Châu P vulgaris (G), S epidermidis kháng methicillin (H) tại Yên Bái 55

Hình 3.7 Số lượng xạ khuẩn kháng vi sinh vật kiểm định phân bố theo vị trí rễ,

thân, lá trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái 57

Hình 3.8 Số liệu thống kê khuếch đại gen mã hóa PKS-I, PKS-II, NRPS của 96

chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây quế Hòa Bình, Lai Châu và Yên Bái 62

Hình 3.9 Sự thay đổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng xạ khuẩn A: bổ

sung acid; B: bổ sung kiềm 63

Hình 3.10 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng tuyển chọn ở Hòa

Bình, Lai Châu và Yên Bái 64

Hình 3.11 Hình thái khu ẩn lạc (A) trên môi trường ISP2 và hình ảnh chuỗi bào tử

và bề mặt chuỗi bào tử của chủng YBQ59 được quan sát dưới kính kiển

vi điện tử quét (SEM) với độ phóng đại 3000 X (B) và 20.000 X (C) 65

Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại dựa trên quan hệ di truyền giữa các trình tự

gen 16S rRNA của chủng S cavourensis YBQ59 và các chủng xạ khuẩn

đại diện Bootstrap = 1000 lần lặp; Bar = 0,02 đại diện cho sự thay thế cho mỗi nucleotide 67

Hình 3.13 Cấu trúc gen/nhóm gen tham gia quá trình sinh tổng hợp kháng ung thư

bleomycin (ctg328_1), jamaikamide (ctg328_1) (A) và kháng sinh macrotetrolide (ctg1114_1) (B) 69

Hình 3.14 Hoạt tính kháng S Typhimurium ATCC 14028 và MRSE ATCC 35984

của chủng S cavourensis YBQ59 trên các môi trường lên men khác nhau 71

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến hoạt tính kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 72

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 72

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 73

Hình 3.18 Ảnh hưởng của độ thông khí bề mặt (A) và tỷ lệ tiếp giống (B) đến khả năng sinh kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 74

Hình 3.19 Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng S cavourensis YBQ59 75

Hình 3.20 Sơ đồ phân lập và tinh chế các chất sạch từ chủng S cavourensis YBQ59 78

Hình 4.1 C ấu trúc hợp chất M2B5.1: 1-monolinolein (1) (C21H38O4) 103

Hình 4.2 C ấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất M2B5.0: bafilomycin D (2) (C 35 H 56 O 8 ) 105

Hình 4.3 C ấu trúc hợp chất M2B9.8: nonactic acid (3) (C10H18O4) 106

Hình 4.4 C ấu trúc hợp chất M2B8.3: 4’,7-dihydroxyisoflavone (daidzein (4)) (C15H10O4) 107

Hình 4.5 C ấu trúc hợp chất M2B7.5: 3'-hydroxydaidzein (5) (3',4',7-trihydroxyisoflavone) (C15H10O5) 107

Hình 4 6 C ấu trúc hợp chất M2B3.8: 5,11-Epoxy-10-cadinanol (6) (C15H26O2) 108

Hình 4.7 C ấu trúc hợp chất M2B4.3: prelactone B (7) (C9H16O3) 109

Hình 4.8 C ấu trúc hợp chất M2B6.17: daucosterol (8) (C35H60O6) 110

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

26-L5 Ung thư ruột kết ở người

A549 Tế bào ung thư phổi ở người

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DEPT Detortionless enhancement by polarization transfer (Phổ

DEPT)

DO Lượng oxy hòa tan

ESI-MS Khối phổ lượng ion hóa phun mù điện tử

FT-IR Phổ hồng ngoại Fourtier

GC-MS Sắc ký khí-khối phổ

GISA Glycopeptides intermediate và Staphylococcus aureus

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HepG2 Tế bào ung thư gan ở người

Hep3B Tế bào ung thư gan ở người

HGT Chuyển gen ngang (Horizontal gene transfer )

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation (Phổ HMBC)

HSQC Heteronuclear single quantum coherence (Phổ HMQC)

IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm

IPH Isatin-3-phenylhydrazone

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

ISP Chương trình xạ khuẩn quốc tế

ITC Isatin-3-thiosemicarbazone

GEGG Kyoto encyclopedia of genes and genomes

MDA-MB-435 Tế bào ung thư tuyến vú ác tính ở người

ME-180 Tế bào ung thư cổ tử cung

MIC Nồng độ ức chết tối thiểu (Minimum inhibitory concentration)

MRSA Staphylococcus aureus kháng methicillin

MRSE Staphylococcus epidermidis kháng methicillin

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide N50 Đánh giá chất lượng lắp ráp

NCBI Ngân hàng cơ sở dữ liệu

NRPS Nonribosomal peptide synthetase

PCP Peptidyl carrier protein

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) PGAP Prokaryotic genome annotation pipeline

PKS-I Polyketide synthase type I

PKS-II Polyketide synthase type II

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SEM Kính hiển vi điện tử quét

SK-BR-3 Tế bào ung thư vú ở người

SK-LU-1 Tế bào ung thư phổi ở người

M Ở ĐẦU

Một trong những thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh

và kháng vi sinh vật (VSV) Cho đến nay, sử dụng kháng sinh là phương thức quan

trọng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm do VSV gây ra Tuy nhiên việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã trở thành yếu tố chính dẫn tới xuất hiện các chủng VSV gây

bệnh kháng đa thuốc (Singh, 2012) Theo Demain và Sanchez (2009), VSV đã và đang thay đổi tính kháng với các thuốc kháng sinh hiện đang sử dụng trong điều trị

nhờ xuất hiện các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền Vì vậy, hướng nghiên cứu và phát triển các tác nhân kháng khuẩn mới là ưu tiên của nhiều nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới (Alekshun, 2007) Bên cạnh điều

trị các bệnh truyền nhiễm do VSV, việc tìm kiếm và phát hiện các hợp chất có hoạt tính sinh học như có hoạt tính kháng tế bào ung thư, kháng viêm cũng là những vấn

đề mang tính toàn cầu

Trong khoảng 20 năm gần đây, nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh (XKNS) trên cây dược liệu đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học, công ty dược phẩm do XKNS cho thấy tiềm năng lớn sinh tổng hợp các chất kháng sinh, kháng u, chất kích thích tăng trưởng thực vật, các loại enzym và chính XKNS cũng có thể góp

phần tăng cường sức sống của cây chủ cũng như mang lại những tính chất dược lý cho cây dược liệu Theo Bérdy (2012), khoảng 70% chất kháng sinh có nguồn gốc

tự nhiên được sử dụng trong lâm sàng được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn Trong số 33.500 hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ VSV, xạ khuẩn thuộc chi

Streptomyces đóng vai trò quan trọng và cho thấy đã sinh tổng hợp 10.400 hợp chất

Vì vậy, sự đa dạng của xạ khuẩn trong tự nhiên nói chung và XKNS nói riêng rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh

học sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn trong nhiều lĩnh vực của đời sống Ngoài ra, nhiều

chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn được sinh tổng hợp bởi các enzyme polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) nên

việc nghiên cứu những gen pks, nrps liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp

rất hữu ích trong việc đánh giá tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng sinh (CKS) từ

xạ khuẩn (Ayuso và cs., 2005) Cho đến nay, rất ít nghiên cứu về tài nguyên XKNS trên cây dược liệu Việt Nam được công bố và cần được nghiên cứu nhằm bảo tồn, lưu giữ và khai thác nguồn gen VSV bản địa

Trong y học cổ truyền Việt Nam tinh dầu của cây quế (Cinnamomum sp.) đã

được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống ung thư (Singh và cs., 1995; Tariq và cs., 2006) nhưng các nghiên cứu về XKNS trên cây quế chưa được công bố nhiều Trong nghiên cứu này, các XKNS được phân lập trên các môi trường chọn lọc và đa dạng sinh học của XKNS được đánh giá qua đặc điểm sinh học, phân bố, khả năng sinh kháng sinh và đặc điểm di truyền Các chủng XKNS có hoạt tính kháng VSV kiểm định, ức chế phát triển tế

bào ung thư phổi, mang các gen chức năng pks-I, pks-II, nrps được sàng lọc Từ đó,

nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy phù hợp và tách chiết, tinh sạch các hợp

chất và giải trình tự, lắp ráp de novo, dự đoán và chú giải hệ gen của XKNS được

tuyển chọn để tìm kiếm thông tin về những gen liên quan đến quá trình tổng hợp kháng sinh Từ những lý do trên nghiên cứu sinh thực hiện đề tài: “Nghiên c ứu sự

đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế

(Cinnamomum cassia Presl) ở Việt Nam và đặc tính sinh học của hoạt chất từ

chủng Streptomyces cavourensis YBQ59”

M ỤC TIÊU

Đánh giá được sự đa dạng, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (Cinnamomum cassia Presl) thu thập tại miền Bắc Việt Nam và tinh

sạch được một số cấu trúc hóa học có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư và các

gen liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces cavourensis

YBQ59

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CHO LUẬN ÁN

- Là nghiên cứu đầu tiên, có hệ thống về đa dạng, sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh trên cây quế (C cassia Presl) tại miền Bắc Việt Nam

- Sàng lọc được chủng Streptomyces cavourensis YBQ59 sinh kháng sinh phổ

rộng và phân lập được 8 hợp chất kháng sinh: 1-monolinolein (1), bafilomycin (2), nonactic acid (3), daidzein (4 ), 3′-hydroxydaidzein (5), 5,11-epoxy-10-cadinanol (6), prelactone B (7), daucosterol (8 ), trong đó các hợp chất 1, 3-8 được phát hiện

lần đầu từ loài S cavourensis và hợp chất 1, 2 có hoạt tính kháng vi khuẩn kháng

kháng sinh cao (MIC50 8,5-30,3 µg/ml) và ức chế phát triển ba dòng tế bào ung thư A549, MCF, Hep3B (IC50 3,6-24,7 µM)

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 T ổng quan về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

1.1.1 Gi ới thiệu về vi sinh vật và xạ khuẩn nội sinh

Thuật ngữ nội sinh “endophytic” lần đầu tiên được định nghĩa bởi de Bary năm 1866, “VSV nội sinh là những VSV sống bên trong các mô thực vật và có sự khác biệt đáng kể so với những loại VSV được tìm thấy trên bề mặt thực vật” (de Bary, 1866) Khái niệm khác về XKNS được đưa ra khi Smith (1957) phân lập thành công chủng xạ khuẩn Micromonospora sp có khả năng ức chế nấm gây bệnh

Fusarium oxysporum trong mô cây cà chua không nhiễm bệnh Tuy nhiên, định nghĩa được các nhà VSV học thừa nhận rộng rãi nhất của Bacon và White (2000)

“VSV nội sinh là VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra những

hiệu ứng xấu tới cây chủ”; VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, chống côn trùng,

miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất (Staniek và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017) Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ XKNS được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như các chất

kiểm soát sinh học, chất kháng VSV gây bệnh, kháng nấm, ức chế phát triển tế bào ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ, chất kích thích sinh trưởng (Bacon và White, 2000; Qin và cs., 2011; Kaishing và cs., 2018) Nấm, vi khuẩn và XKNS đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh

học như alkaloid, steroid, terpenoid, peptide, polyketone, flavonoid, quinol, phenol

và thuốc trừ sâu tự nhiên azadirachtin cũng được sản xuất bởi VSV nội sinh hiện đang được ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y dược (Li và cs., 2008; Molina và cs., 2012; Golinska và cs., 2015; Ganapathy và Natesan, 2018; Singh và Dubey, 2018)

Vi khu ẩn: hơn 200 chi từ 16 ngành vi khuẩn đã được công bố là nội sinh

trong thực vật, phần lớn các loài thuộc ngành Actinobacteria, Proteobacteria và

Firmicutes (Golinska và cs., 2015) Vi khuẩn nội sinh thuộc nhóm vi khuẩn Gram

dương và Gram âm: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus,

Brevibacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Enterobacter, Gluconobacter… (Sun và cs., 2013) Saini và cs (2016) đã phân lập được 166

chủng vi khuẩn nội sinh từ rễ của các loại cây lương thực như: đậu hồi (Cicer

arietinum ), đậu (Pisum sativum), lúa mì (Triticum aestivum) và yến mạch (Avena

sativa) Vi khuẩn nội sinh đa dạng trong tự nhiên và có khả năng sinh các chất chuyển hóa sinh học khác nhau có hoạt tính kháng khuẩn và chống tế bào ung thư

X ạ khuẩn: Trong những năm gần đây, XKNS thu hút sự quan tâm của các

nhà khoa học, nhiều báo cáo khoa học về XKNS trên nhiều loại thực vật khác nhau

đã được công bố như các loại từ cây lương thực như lúa mì, ngũ cốc, gạo, cà chua,

cà rốt và khoai tây, cam quýt (Araújo và cs., 2000; Coombs và Franco, 2003) đến các cây dược liệu (Taechowisan và cs., 2003; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017) XKNS phân lập được chủ yếu thuộc chi Streptomyces,

Microbispora, Micromonospora, Nocardioides, Nocardia và Streptosporangium

XKNS được chứng minh mang lại nhiều lợi ích như cải thiện hoặc thúc đẩy quá trình tăng trưởng thực vật, làm giảm các triệu chứng bệnh thực vật thông qua một

loạt các cơ chế như sinh tổng hợp các hoạt chất thứ cấp có khả năng tiêu diệt các

loại mầm bệnh do nấm hay côn trùng gây ra (Igarashi và cs., 2002) Nhiều chất kháng sinh mới được tìm thấy do xạ khuẩn Streptomyces spp sinh tổng hợp như

alnumycin, munumbicin A, D hay coronamycin (Castillo và cs., 2007; Nalini và Prakash, 2017) Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu về việc tìm kiếm XKNS mới

đã được công bố (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017)

Vì vậy, XKNS được kỳ vọng như một nguồn cung cấp tiềm năng trong việc phát

hiện ra các hợp chất có hoạt tính sinh học mới

N ấm nội sinh: trong 10 năm qua, các nhà khoa học đã công bố khoảng 770

loại nấm nội sinh đã được phân lập Các loài đã được định tên nhiều nhất là:

Altenaria spp.; Altenaria infectoria; Aspergillus spp.; Colletrotrichum spp.; C gloeosporioides; Guignardia spp.; Nigrospora oryzae; N sphaerica; Penicillium

spp.; Phomopsis spp.; Rhizoctonia spp.; Xylaria spp Gần đây, Daisy và cs (2002)

đã phân lập được hai chủng nấm nội sinh mới là chủng Muscodor albus từ cây quế (Cinnamomun zeylanicum) và Muscodor roseus từ hai cây trong rừng nhiệt đối tại

Úc Hai chủng nấm sản sinh một số hợp chất trao đổi thứ cấp hoạt tính ức chế, tiêu

diệt nấm và vi khuẩn hại cây

1.1.2 Tương tác giữa xạ khuẩn nội sinh và thực vật

Nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự xâm nhập của các xạ khuẩn trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSV

nội sinh vẫn là một ẩn số (Sardi và cs., 1992)

Hình 1.1 Quá trình xâm nhập vào lỗ khí và gian bào của S galbus MBR-5 trên lá

đỗ quyên sau 60 ngày quan sát

( Nguồn: Clark và Mattews, 1987) Ghi chú: (a) quá trình xâm nhập vào lỗ khí Khuẩn ty được gắn trên vật liệu electron (G: tế bào bảo vệ) (b) các tế bào hệ sợi (mũi tên) trong khoang gian bào bên dưới lớp biểu bì (E: tế bào biểu bì; IS: khoang gian bào; M: tế bào mesophyll)

Suzuki và cs (2005) đã chứng minh quá trình xâm nhập vào mô lá và thân cây

đỗ quyên của chủng S galbus MBR-5 bằng cách quan sát qua kính hiển vi điện tử,

cho hệ khuẩn ty của chủng S galbus MBR-5 vào lá thông qua các lỗ khí nhưng

không thông qua lớp biểu bì, vì lớp biểu bì còn nguyên vẹn (Hình 1.1) Ngoài ra,

chủng MBR-5 được chứng minh là có khả năng sinh các enzyme thủy phân như xylanase, cellulase và pectinase VSV nội sinh đã tự thích nghi trong suốt thời gian dài cùng với sự đồng tiến hóa của cây chủ qua gen điều hòa (Qin và cs., 2010) Một

giả thuyết được đưa ra rằng gen mã hóa cho các chất có hoạt tính sinh học được sinh ra từ quá trình trao đổi giữa VSV và thực vật thông qua chuyển gen ngang (HGT - horizontal gene transfer) VSV nội sinh sản sinh ra một số hợp chất để duy

trì mối quan hệ cộng sinh với cây chủ, thúc đẩy sự phát triển của cây chủ và giúp chúng tồn tại được trong cây chủ (Golinska và cs., 2015)

1.1.3 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trong công nghệ sinh học và y dược

Trong thời gian gần đây, XKNS liên quan đến thực vật, đặc biệt là cây dược

liệu đã được chứng minh là tạo ra các hợp chất có giá trị trị liệu cao (Singh và Dubey, 2018) Các nghiên cứu về XKNS đã xác định được nhiều sản phẩm tự nhiên

mới, đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học như: 9-hydroxybafilomycin D, hydroxybafilomycin D, bafilomycin D, bafilomycin E, bafilomycin A1, bafilomycin B1, bafilomycin B2, bafilomycin C1, bafilomycin C2, bafilomycin C1 amide, bafilomycin C2 amide; caryolane-1,7α-diol, 1,6,11-eudesmanetriol, 11-eudesmene-1,6-diol, 7,4 dihydroxy-8-(hydroxymethyl)-1 methoxy-isoflavones, tripstretine… (Qin và cs., 2011; Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017)

29-• Các ch ất kháng ung thư và chống viêm từ xạ khuẩn nội sinh

Hoạt chất paclitaxel từ Kitasatospora sp được phân lập từ cây thanh tùng Ý (Taxus baccata) (Caruso và cs., 2000; Janso và Carter, 2010) là báo cáo đầu tiên về

sản xuất taxol từ XKNS có hoạt tính kháng tế bào ung thư Trong số các hợp chất có

hoạt tính chống ung thư, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn tự nhiên khác naphthomycin K (dẫn xuất của kháng sinh ansamycin có gắn thêm nhóm chức chlorine) được phân lập đầu tiên từ

chủng Streptomyces sp CS nội sinh trên cây mỹ đăng mộc (Maytenus hookeri) –

loại cây thuốc có tác dụng điều trị hung thư, hoạt huyết… Kết quả kiểm tra hoạt tính sinh học của naphthomycin K cho thấy, hoạt tính gây độc với hai dòng tế bào ung thư: ung thư bạch cầu (P388) và ung thư phổi (A549) ở người với giá trị IC50

thấp là 0,07 và 3,17 μM, nhưng không có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và

vi khuẩn lao (Lu và Shen, 2007) Năm hợp chất macrolide 16 thuộc họ bafilomycin cũng được phân lập từ XKNS và cho thấy hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư vú

ở người (MDA-MB-435) bằng in vitro (Li và cs., 2010) Hai hợp chất

anthraquinone mới là lupinacidin A và B được chiết từ dịch lên men của chủng xạ

khuẩn Micromonospora lupine Lupinacidin có khả năng ức chế sự phát triển của tế

bào ung thư biểu mô ruột kết ở người 26-L5 (Igarashi và cs., 2007) Kim và cs (2006) đã phân lập được hoạt chất 2 6-alkylsalicylic acid mới là salaceyin A và B từ

chủng S laceyi MS53 nội sinh trên cây thầu dầu Các kết quả khảo sát hoạt tính

chống ung thư cho thấy, salaceyin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư

vú ở người (SK-BR-3) với IC50 thấp lần lượt là 3,0 và 5,5 μg/ml Mặt khác,

pterocidin được phân lập từ chủng S hygroscopicus TP-A0451, cho thấy hoạt tính

gây độc với một số dòng tế bào ung thư ở người với giá trị IC50 trong khoảng 7,1 µM (Igarashi và cs., 2006)

2,9-Trước đây, hai hợp chất 5, phenylcoumarin và 5, p-methoxylphenylcoumarin có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh, thường thu

7-dimetoxy-4-nhận từ nhiều loài thực vật khác nhau Nhưng gần đây, Chủng S aureofciens

CMUAcl30 phân lập từ cây gừng (Zingiber officinale Rose) có khả năng sinh tổng

hợp các hợp chất kháng nấm và chống ung thư như 4-arylcoumarin (5, dimethoxy-4-p-methoxylphenylcoumarin và 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin) Hơn nữa, hoạt chất 4-acrylocoumarin có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Lewis (LLC) ở chuột BDF-1, bằng cách tiêm hoạt chất này vào ổ bụng

7-của chuột Giá trị ức chế sự tăng trưởng của khối u (T/C treatment-to-control) của

5, 7 dimhoxy1-4-p methoxylphenylcoumarin là 80,8 và 50,0% ở liều 1 và 10 mg/kg, trong đó 5, 7-dimethoxy-4-phenylcoumarin là 81,6 và 44,9% ở liều 1 và 10 mg/kg Hai hợp chất chống ung thư này có độc tính thấp trong đường ruột ở chuột và chỉ gây độc với các dòng tế bào ác tính và không gây độc tế bào thường (Taechowisan

và cs., 2007)

• Ho ạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Ngày nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới được tổng hợp từ XKNS trên cây dược liệu có khả năng kháng khuẩn, nấm và virus Năm 2005, Guan và cs đã phân

lập được ba nhóm hoạt chất mới có khả năng kháng khuẩn là p-aminoacetophenic

của 7-(4-aminophenyl)-2,4-dimethyl-7-oxo-hept-5-enoic acid,

(9-(4-aminophenyl)-7-hydroxy-2,4,6-trimethyl-9-oxo-non-2-enoic acid và hydroxy-6-(1-hydroxyethyl)-7,9-dimethyl-12-oxo-dodeca-2,4 dienoic acid từ chủng

12-(4-aminophenyl)-10-S griseus subsp., n ội sinh trên cây ngập mặn (Kandelia candel) (Guan và cs.,

2005) Taechowisan và cs (2005) đã công bố một số chất có hoạt tính kháng khuẩn

từ chủng S aureofaciens CMUAc130 nội sinh trên cây gừng (Zinger officinale) như

5,7-dimethoxy-4-(p-methoxy)-phenylcoumarin, 5,7-dimethoxy-4- phenylcoumarin, vanillin, 3-methoxy-4-hydroxytoluene và các chất kháng sinh kaempferol, isoscutellarin, umbelliferone và cichorii từ chủng Streptomyces sp Tc052 nội sinh

trên cây giềng nếp (Alpinia galangal)

1.1.4 Phân l ập xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Năm 1886, chi xạ khuẩn Frankia đã được phân lập từ nốt sần của một cây

không thuộc họ đậu (Okazaki, 2003) Tiếp đó, Baker và cs (1980) lần đầu tiên phân

lập được XKNS từ rễ cây Elaeagnus umbellate Như vậy, số lượng XKNS phân lập

được phụ thuộc vào cây thực vật, độ tuổi, loại mô, phân bố địa lý, môi trường sống, mùa lấy mẫu, cách khử trùng bề mặt, lựa chọn môi trường và điều kiện nuôi cấy (Coombs và Franco, 2003; Hallmann và cs., 2006) Theo các công bố, quá trình phân lập XKNS cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề

mặt Thông thường, việc xử lý bề mặt được thực hiện bằng cách xử lý các mô thực

vật với chất oxy hóa hoặc chất khử trùng nói chung trong một khoảng thời gian, sau

đó mô thực vật được rửa với nước cất khử trùng Các chất khử trùng sử dụng phổ

biến là ethanol (70-95%), NaClO (3-10%) và H2O2 Một số chất hoạt động bề mặt như tween 20, tween 80 và triton X-100 có thể được thêm vào để tăng hiệu quả khử trùng bề mặt (Hallmann và cs., 2006) Việc phân lập bao gồm một quy trình ba bước như được mô tả bởi Coombs và Franco (2003) Qin và cs (2009) đề xuất quy trình 5 bước và thêm dung dịch Na2S2O3 sau khi được xử lý bằng NaClO để trung hòa NaClO dư trên bề mặt thực vật, giúp cho quá trình phân lập không bị ảnh hưởng bởi chất khử trùng bề mặt Sau khi xử lý, các mô thực vật có thể được ngâm trong dung dịch NaHCO3 10% (Nimnoi và cs., 2010) Sau mỗi lần xử lý, phải kiểm tra xác nhận khử trùng bề mặt để chứng minh rằng các VSV ký sinh trên bề mặt đã

được khử trùng hoàn toàn và VSV phân lập được là nội sinh, có thể được chứng

thực bằng cách trang nước rửa cuối cùng vào đĩa môi trường tương tự Việc bổ sung các kháng sinh như nalidixic acid và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide là

cần thiết để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc

của xạ khuẩn, vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm (Qin và cs., 2009)

Li và cs (2012) áp dụng cách xử lý nhiệt khô và xử lý mẫu thực vật với nitơ

lỏng, đã phân lập được 228 chủng xạ khuẩn từ cây thanh hao hoa vàng (Artemisia

annua L.) trong đó 31 chủng có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, 07 chủng có hoạt tính amylase mạnh, 10 chủng sinh protease cao, 01 chủng sinh lipase cao và 19

chủng có hoạt tính ức chế sự phát triển của cây lồng vực (Echinochloa crusgalli) Cùng trên đối tượng cây lồng vực (Echinochloa crusgalli) tại tỉnh Vân Nam, Trung

Quốc, nhóm nghiên cứu đã sử dụng các cách xử lý bề mặt khác và các loại môi trường khác đã phân lập được 312 chủng XKNS (Qin và cs., 2012) Waheeda và Shyam (2017) đã phân lập được 32 chủng XKNS trên 3 loại cây: cây húng quế

(Ocimum basillicum), sâm Ấn Độ (Withania somnifera) và cây ba gạc bốn lá (Rauvolfa tetraphylla)

Các loại môi trường phân lập XKNS đã được mô tả bởi các tác giả về thành

phần môi trường như môi trường tinh bột casein (Küster và Williams, 1964), tinh

bột casein nitrat (SCNA), đậu tương (Williams và Davies, 1965), chitin-vitamin B (Hayakawa và Nonomura, 1987), môi trường cao nấm men (TWYE) (Qin và cs., 2009); humic acid vitamin B (HV), cao nấm men casamino acid (YECA), tổng hợp (Mincer và cs., 2002), Gause cải tiến (Ivantiskaya và cs., 1978) và glycine-glycerol (Küster, 1959) Machavariani và cs (2014) đã cải tiến phương pháp phân lập là tiền

xử lý lá với dung dịch heteroauxin và zircon, giúp tăng số lượng XKNS hiếm từ cây dược liệu Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng sử dụng môi trường bổ sung humic acid và vitamin để phân lập xạ khuẩn hiếm thường cho hiệu quả cao (Tiwari và Gupta, 2013) Bên cạnh đó, một số môi trường được bổ sung amino acid (arginine, asparagine và proline) làm nguồn nitơ và cellulose, natri propionat, natri succinat và

xylan như các nguồn carbon, cũng cho hiệu quả phân lập cao đối với một số loại xạ khuẩn hiếm (Qin và cs., 2009) Zhao và cs (2011) đã nhấn mạnh sự cần thiết của

việc sử dụng các phương pháp và môi trường phân lập mới để phát hiện và nghiên

cứu về sự đa dạng của các loài XKNS trên cây dược liệu

1.2 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Như đã đề cập ở trên, XKNS là một trong những nhóm VSV đa dạng và còn ít được nghiên cứu, có khả năng sinh chất có ích cho cây chủ (Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017) Theo quan niệm đó, XKNS có sự đa dạng về thành phần loài, chi về các taxon và về sinh tổng hợp các hợp chất sinh học Mức độ đa dạng XKNS có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu, các loài thực vật khác nhau và phụ thuộc vào phương pháp, môi trường phân lập (Qin và cs., 2011; Nalini và Prakash, 2017)

1.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh trong các mô thực vật

Dựa trên kết quả phân lập của một số nghiên cứu cho thấy, số lượng XKNS được phân lập nhiều nhất từ rễ, tiếp theo là thân và ít nhất trong lá (Qin và cs., 2009; Gangwar và Khushboo, 2014) Sự đa dạng của quần thể XKNS phụ thuộc vào

ba yếu tố chính gồm: loài thực vật, vị trí mô thực vật (rễ, thân, lá) và vị trí địa lý (khí hậu, độ ẩm, dinh dưỡng) (Nimnoi và cs., 2010; Golinska và cs., 2015) Taechowisan và cs (2003) đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn từ 7 cây dược liệu

ở Chiang Mai, Thái Lan, thuộc 4 chi: Streptomyces, Microbispora, Nocardia và

Micromonospora Verma và cs (2009) đã phân lập 55 XKNS từ 20 mẫu cây

Azadirachta indica, trong đó chi Streptomyces thường gặp nhất (49,09%), sau đến

là chi Streptosporangium (14,5%), Microbispora (10,9%), Streptoverticillium (55%), Saccharomonospora (5,5%) và Nocardia (3,6%) Hai mươi sáu cây dược

liệu từ tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc đã phân lập được 60 chủng XKNS, trong đó thuộc chi Streptomyces chiếm 50% số chủng phân lập, các chủng còn lại thuộc các

Rhodococcus (Yuan và cs., 2008; Nalini và Prakash, 2017) So với thân và lá, tập

hợp các chủng xạ khuẩn phân loại từ rễ đa dạng hơn

Các nghiên cứu về số lượng xạ khuẩn trên các bộ phận các loài dược liệu thường mang lại kết quả trái ngược nhau Taechowisan và cs (2003) đã phân lập được 212 chủng xạ khuẩn ở rễ, 97 chủng ở lá và 21 chủng ở thân, tương tự XKNS

từ cây Azadirachta indica cho số lượng XKNS ở rễ là cao nhất 54,6%, thân và lá

lần lượt là 23,6% và 21,8% Verma và cs (2009) Nhưng một số nghiên cứu đưa ra

kết quả, XKNS phân lập từ lá là thấp nhất và trong một vài nghiên cứu khác cho

thấy, không có một chủng xạ khuẩn nào được phân lập từ lá (Zhao và cs., 2011; Akshatha và cs., 2016) Mặt khác một số nghiên cứu phân lập XKNS nhiều nhất từ thân, đặc biệt trên các mô lớn (Castillo và cs., 2002; Castillo và cs., 2003; Bascom-Slack và cs., 2009)

1.2.2 Đa dạng di truyền của xạ khuẩn nội sinh

Sự đa dạng của XKNS trên thực vật rất phong phú được đánh giá từ các nhóm nghiên cứu trên thế giới tại Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Mỹ, Nga… (Bảng 1.1) Kaewkla và Franco (2013) đã đưa ra sự đa dạng XKNS trên thực vật tại Úc cho thấy, đã phân lập được trên 500 chủng XKNS, thuộc 16 chi khác nhau phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA, trong đó chi Streptomyces phổ biến nhất (chiếm trên 50% tổng số XKNS

phân lập được) Tuy nhiên, rất nhiều loài mới, hiếm khác được phát hiện thêm như

Microbispora, Microbacterium, Micrococcus, Micromonospora, Rhodococcus, Streptacidiphilus, Arthrobacter, Dietzia, Herbiconiux, Kitasatospora, Nocardia, Rathayibacter, Tsukamurella, Streptosporangium, Streptoverticillium, Verrucosispora, Isoptericola và Kytococcus (Kaewkla và Franco, 2013; Golinska và

cs., 2015) Tại miền Nam Ấn Độ đã phân lập được 135 chủng XKNS từ bốn cây

dược liệu (Cajanus lineatus, Leucas ciliata Benth., Rauwolfia densiflora Benth và

Gomphostemma heyneanum Wall.) thu ộc các chi Streptomyces (68%), Arthrobacter (15%), Patulibacter (3%), Rhodococcus (9%) và Promicromonospora (5%)

(Akshatha và cs., 2016) Phân bố loài và đa dạng sinh học của VSV nội sinh trên cây dược liệu chịu ảnh hưởng khá nhiều từ môi trường sinh thái (Nalini và Prakash, 2017)

B ảng 1.1 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về đa dạng sinh học của xạ

khuẩn nội sinh trên thực vật và cây dược liệu

Trong hơn 10 năm (từ 2001-2012), nhóm nghiên cứu tại Viện VSV học Vân Nam, Trung Quốc đã tối ưu các điều kiện phân lập và đã phát hiện ra 3 phân bộ (order) mới, 8 họ (family) mới, hơn 30 chi (genus) mới và hơn 200 loài, chiếm khoảng 42% số taxa mới của xạ khuẩn ở Trung Quốc Tại Trung Quốc chiếm 22%

số xạ khuẩn mới trên thế giới, đưa vào bảo tàng giống hơn 5.000 chủng XKNS phân

Qu ốc gia Loài th ực vật Chi x ạ khuẩn Đặc tinh sinh h ọc Tài li kh ệu tham ảo

Ấn Độ Cây húng quế, cây sâm Ấn

Độ, cây gạc bốn lá Streptomyces Kháng khuẩn (Waheeda và Shyam, 2017)

Ai Cập 10 cây họ hoa cúc (Achillea

fragrantissima Forssk)

Streptomyces, Kitasatospora, Saccharopolyspora, Intrasporangium

Irelan 7 cây dược liệu Streptomyces, Brevibacterium, Microbacterium, Leifsonia Kháng khuẩn, nấm (Passari và cs., 2015)

Indonesia Cây họ la bố ma, cây nghệ,

cây lỗ danh, cây dung lá táo Streptomyces Kháng khuẩn (Sunaryanto và cs., 2014)

Malaysia 4 cây dược liệu Streptomyces Kháng khu ẩn (Zin và cs., 2010)

Hàn Quốc Cây cải thảo (Chinese

cabbage)

Microbispora, Streptomyces, Micromonospora

Kháng khuẩn, nấm (Lee và cs., 2008)

Mỹ 21 loài thực vật nhiệt đới Streptosporangiaceae,

Sphaerisporangium, Planotetraspora, Nonomuraea, và Microbispora

Kháng khuẩn, nấm (Janso và Carter, 2010)

Nga 20 loài cây dược liệu Streptomyces,

Micromonospora, Nocardiopsis

Kháng khu ẩn, nấm (Machavariani và cs., 2014)

Nhật Bản Pueraria candollei Streptomyces, Verrucosispora, Microbispora, Micromonospora,

Nonomura và Plantactinospora

S-adenosyl-N-

acetylhomocys teine (kháng khuẩn)

(Panitch và cs., 2017)

Kháng khuẩn,

u

(Salam và cs., 2017)

Phần Lan 13 loài cây dược liệu Streptomyces và Micromonospora Kháng khuẩn,

Úc 5 loài cây thực vật Streptomyces, Microbispora Kháng khuẩn (Misk và

Franco, 2011)

lập từ hơn 100 loài thực vật (Qin và cs., 2011) Zhao và cs (2005) đã phân lập được

560 chủng xạ khuẩn từ 26 cây dược liệu khác nhau tại vùng cao nguyên Panxi, Trung Quốc Các chủng XKNS phân lập được thuộc nhiều chi khác nhau như

Streptomyces, Micromonospora, Oerskovia, Nonomuraes, Promicromonospora, Rhodococcus, trong đó, 60 chủng có hoạt tính kháng ít nhất một loại VSV kiểm

định (chiếm 10,7%), 15 chủng có hoạt tính kháng mạnh với S aureus, 38 chủng

kháng ít nhất 5 loại VSV gây bệnh và tất cả các chủng có hoạt tính kháng khuẩn đều thuộc chi Streptomyces Tỷ lệ XKNS mang gen pks-I, pks-II, nrps liên quan tới quá

trình sinh tổng hợp kháng sinh chiếm tỷ lệ cao, đạt lần lượt 53%, 82%, 53% (Zhao

và cs., 2011)

Tại Trung Quốc đã điều tra và lấy mẫu trên 90 cây dược liệu cho thấy, XKNS phân lập được khá đa dạng về mức độ loài và chi (Streptomycetes, Pseudonocardia,

Nocardiopsis, Micromonospora) (Qin và cs., 2009) Kết quả phân lập cho thấy, một

số chủng XKNS thuộc các chi hiếm như Lentzea, Tsukamurella, Gordonia, Dietzia,

Kineosporia, Janibacter, Kineococcus, Dactylosporangium, Nonomuraea, Herbidospora và Glycomyces spp Từ năm loài thực vật rừng ngập mặn tại Khu bảo

tồn thiên nhiên quốc gia Beilun Estuang ở Trung Quốc, đã phân lập được 101 chủng thuộc 7 bộ, 15 họ và 28 chi gồm Streptomyces, Curtobacterium, Mycobacterium,

Micrococcus, Brevibacterium, Mycobacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Kocuria, Nocardioides, Kronococcus, Gordonia, Isoptericola, Janibacter, Leucobacter, Nocardia, Nocardiopsis, Pseudokineococcus, Sanguibacter và Verrucosispora Trong đó đã phát hiện 07 loài mới thuộc các chi Nocardioides,

Streptomyces, Amnibacterium, Marmoricola và Mycobacterium Từ 101 chủng XKNS đã tuyển chọn được 31 chủng khả năng kháng ít nhất một chủng VSV kiểm định (Jiang và cs., 2018) Do đó, có thể thấy tính mới, tính đa dạn và các chất có

hoạt tính sinh học sinh tổng hợp bởi các chủng XKNS ứng dụng trong y học, nông nghiệp và môi trường (Singh và Dubey, 2018) XKNS rất đa dạng và mức độ đa

dạng có thể thay đổi giữa các vùng lấy mẫu và các loài thực vật khác nhau Sự đa

dạng về chi và số lượng nuôi cấy XKNS phần lớn phụ thuộc vào phương pháp phân

7 chủng XKNS, thuộc các chi Sphaerisporangium, Kibdelosporangium,

Planomonospora và Actinophytocola Tiếp đó, Matsumoto và Takahashi (2017) đã tách chiết được các chất hoạt tính sinh học từ các chủng XKNS như: actinoallolide (mạch vòng 12-macrolid) từ dịch lên men của chủng Actinoallomurus fulvus MK10-

036; trehangelin bao gồm hai phân tử trehalose và một angelic acid phân lập từ

chủng Polymorphospora rubra K07-0510; spoxazomicin, pyochelin phân lập từ

Streptosporangium oxazolinicum K07-0460T Sự đa dạng các chất trao đổi thứ cấp

từ các chủng XKNS được phân lập trên cây dược liệu được thống kê trong Bảng 1.2 Castillo và cs (2002) đã phân lập được bốn chất kháng sinh mới dạng peptide

có phổ kháng khuẩn rộng là munumbicin A, B, C, D từ Streptomyces NRRL 30562

Từ lá cây dương xỉ (Grevera pteridifolia) đã phân lập được chủng Streptomyces sp

NRRL 30566 nội sinh có khả năng sinh chất kháng sinh kakadumycin (Castillo và cs., 2003) Hoạt chất xiamycin A được phân lập từ chủng Streptomyces sp

HKI0595 nội sinh trên cây vẹt dìa (Kandelia candel) Trong đó, xiamycin A có hoạt tính kháng virus HIV (Ding và cs., 2010) Theo công bố của Ding và cs (2011) ba

hoạt chất indolosesquiterpene mới gồm xiamycin B, indosespene và sespenine, cũng

như xiamycin A được phân lập từ dịch lên men của chủng Streptomyces sp

HKI0595 nội sinh trên cây vẹt dìa (Kandelia candel) có khả năng kháng vi khuẩn

Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) và Enterococcus faecalis kháng

vancomycin (VRE) Như vậy, tiếp tục nghiên cứu, sàng lọc các hợp chất có hoạt

tính kháng sinh kháng vi khuẩn kháng đa kháng sinh, kháng virux và chống ung thư

từ XKNS trên cây dược liệu tự nhiên là hướng nghiên cứu đầy triển vọng

B ảng 1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược

liệu

Sự đa dạng của XKNS trong thực vật là phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng

dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra Tuy nhiên, so với sự đa dạng của thực vật, số lượng các nghiên cứu về XKNS vẫn còn

hạn chế, vì vậy cơ hội để phân lập được các loài xạ khuẩn từ các cây dược liệu hứa

hẹn tiềm năng khai thác trong y học, nông nghiệp, và các ngành công nghiệp khác

1.3 Sinh t ổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh và một số nghiên cứu về

loài Streptomyces cavourensis

1.3.1 Ch ất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

XKNS đã được chứng minh là tạo ra các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính

ở nồng độ thấp, chống lại các VSV Một lượng lớn các hợp chất kháng VSV thuộc các lớp như alkaloid, peptide, steroid, terpenid, phenol, quinines và flavonoid đã nghiên cứu được chiết xuất từ XKNS (Singh và Dubey, 2015) Như vậy, có rất nhiều ứng dụng giá trị để phát triển các loại thuốc kháng sinh từ XKNS Chủng

Streptomyces sp TP-A0595 nội sinh sinh tổng hợp hợp chất 6-prenylindole (1) có

hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trên thực vật Trước đó,

6-prenylindole (1) đã được tinh sạch từ cây rêu tản (Hepaticae) Đây là ví dụ điển

hình về khả năng thu nhận các hợp chất hoặc các dẫn xuất trong thực vật nhờ XKNS (Igarashi, 2004) Ứng dụng của các hợp chất có hoạt tính sinh học được tách

từ XKNS được làm rõ từ các công bố khác và sự đa dạng của xạ khuẩn cũng được nghiên cứu và công bố ở các điều kiện môi trường khác nhau từ điều kiện thường

đến các điều kiện khắc nghiệt

Cho đến nay, nhiều loại thuốc kháng sinh mới đã được phát hiện từ XKNS như gồm munumbicin A-D (Castillo và cs., 2002), celastramycin A-B (Pullen và cs., 2002), kakadumycin (Castillo và cs., 2003) và demethylnovobiocin (Igarashi, 2004) Coronamycin được tách từ dịch lên men của chủng Streptomyces NRRL

30562 có hoạt tính kháng nấm Pythiaceous sp (MIC 2 µg/ml) và Cryptococcus

neoformans (MIC 4 µg/ml) gây bệnh ở người (Ezra và cs., 2004) Hai hợp chất mới

cedarmycin A (2) và B (3) được tách từ dịch lên men của chủng Streptomyces sp

TP-A0456 nội sinh trên cây tuyết tùng (Cryptomeria japonica) Cedarmycin A (2)

cho hoạt tính kháng nấm Candida glabrata với nồng độ ức chế tối thiểu MIC là 0,4 μg/ml (Igarashi, 2004) Chủng Streptomyces sp Tc022 nội sinh trên rễ cây riềng nếp (Alpinia galangal) có hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum

musae và Candida albicans Hoạt chất actinomycin D (4) từ dịch lên men của

chủng Streptomyces sp Tc022 có hoạt tính kháng nấm cao (Hình 1.2) (Taechowisan

và cs., 2006)

Hình 1.2 C ấu trúc hóa học của một số kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh (1-6)

Castillo và cs (2006) đã phân lập được 2 kháng sinh peptide mới là munumbicin E-4 và E-5 từ chủng Streptomyces NRRL 30562 nội sinh trên cây lõi

tiền (Kennedia nigriscans) có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm và Gram dương

Hoạt tính chống sốt rét của hoạt chất munumbicin E-4 và E5 được công bố cao gấp

đôi so với chloroquine Chủng Streptomyces NRRL sinh tổng hợp munumbicin A,

B, C và D với khối lượng phân tử 1269,6; 1298,5; 1312,5 và 1326,5 Da có hoạt tính kháng vi khuẩn Bacillus anthracis đa kháng thuốc, Mycobacterium tuberculosis, MRSA, Staphylococcus aureus (GISA) và kháng nấm gây bệnh trên thực vật Munumbicin A có khả năng kháng VRE Munumbicin B có hoạt tính kháng

Mycobacterium tuberculosis với giá trị IC50 là 10 và 46 ng/ml Munumbicin C có

hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum với nồng độ IC50 là 6,5 ng/ml so với IC50 của chloroquine là 7 ng/ml Munumbicin B và C hoạt tính chống ung thư cao nhất ở các dòng tế bào ung thư ME-180 (ung thư biểu mô cổ tử cung)

với giá trị LC50 là 0,1-0,14 µg/ml (Castillo và cs., 2002) Munumbicin D có hoạt tính chống ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum, có IC50 4,5±0,07 ng/ml

Gần đây, một hợp chất chống nấm mới như saadamycin (5) được tách từ chủng

Streptomyces sp Hedaya48 có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên da và một số nấm gây bệnh khác (El-Gendy và EL-Bondkly, 2010)

Castillo và cs (2003) công bố đã phân lập được dòng kháng sinh thuộc nhóm peptide kakadumycin (kakadumycin A và những hoạt chất liên quan) từ chủng

Streptomyces NRRL 30566 nội sinh trên lá cây dương xỉ có nguồn gốc ở Bắc Úc Kakadumycin A có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt là kháng lại vi khuẩn Gram dương và có hoạt tính cao hơn so với echinomycin Kakadumycin A có hoạt tính

kháng B anthracis với MIC 0,2-0,3 μg/ml, trong khi MIC của echinomycin là

1,0-1,2 μg/ml Cả kakadumycin A và echinomycin (6) đều có hoạt tính chống ký sinh

trùng sốt rét Plasmodium falciparum với IC50 trong khoảng 7-10 ng/ml tương tự như munumbicin (Castillo và cs., 2003) Như vậy, XKNS trong các cây dược liệu được coi như những nguồn sản xuất của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính kháng khuẩn có tiềm năng cao (Castillo và cs., 2007; Passari và cs., 2015)

1.3.2 Các gen mã hóa enzyme tham gia quá trình t ổng hợp kháng sinh của xạ khu ẩn

Polyketide là nhóm đại diện cho các sản phẩm tự nhiên (sản phẩm trao đổi chất thứ cấp) được sản xuất bởi sinh vật như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và thực vật (Rojas và cs., 2012) Các kháng sinh có cấu trúc polyketide được sử dụng rộng rãi như tetracycline, daunorubicin, erythromycin, rapamycin và lovastatin được ứng dụng điều trị các bệnh lâm sàng Nhóm polyketide có thể định nghĩa là các liên kết dạng polyme được cấu thành từ các đơn vị ketide, các hợp chất này được chia thành

2 loại gồm: polyketide synthase (PKS) và nonribosomal peptide synthetase (NRPS) (Gontang và cs., 2010; Mahera và cs., 2013)

1.3.2.1 Gen mã hóa PKS-I, PKS-II tham gia t ạo polyketide đa vòng thơm

Hiện nay, các nhà khoa học chú trọng và quan tâm đến sự có mặt của hai gen

pks-I, pks-II trong xạ khuẩn liên quan đến sinh tổng hợp kháng sinh dạng polyketide Các polyketide đa vòng thơm được hình thành chủ yếu từ quá trình ngưng kết từ các đơn vị acetate, propionate, acyl butyrate và khử nhóm β-carbonyl Sau khi tổng hợp, chuỗi polyketide được sắp xếp lại thành các hợp chất đa vòng thơm Oxytetracycline, actinorhodin và anthracycline là các nhóm CKS kháng ung thư đa vòng thơm được tạo thành từ quá trình trên (Hình 1.3) Gen mã hóa enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp polyketide đa vòng thơm chủ yếu là polyketide synthase type II (PKS-II) Trong quá trình tổng hợp polyketide, các polyketide khác nhau được hình thành từ một hoặc nhiều quá trình ngưng tụ (Hình 1.3) Các chuỗi polyketide tiếp tục phát triển, kéo dài và đóng vòng tạo thành sản

phẩm cuối cùng thông qua 3 quá trình khác nhờ sự hỗ trợ của ketosynthase (KS), acyl transferase (AT) và acyl carrier protein (ACP) Các gen mã hóa enzyme tham gia sinh tổng hợp tạo sản phẩm cuối cùng gọi là polyketide synthase type I (PKS-I) (Arias và cs., 2011; Mahera và cs., 2013)

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn polyketide bởi synthase gồm bốn mô đun riêng biệt A synthase bao gồm một protein đa mô đun đơn được mã hóa bởi một gen duy nhất chứa bốn mô đun enzyme, đặc trưng của loại PKS-I B Mỗi mô đun

có mặt trên một protein của loại PKS-II

Chữ viết tắt: AT: acyltransferase; ACP: acyl carrier protein; KS: ketosynthase; DH:

dehydratase; KR: ketorudactase; TE: thioesterase

(Nguồn: Arias và cs., 2011)

1.3.2.2 Gen mã hóa NRPS tham gia t ổng hợp chuỗi peptide

NRPs (nonribosomal peptides) là một peptide trao đổi thứ cấp, được sản xuất

bởi vi khuẩn và nấm NRPS là nhóm enzyme có khối lượng phân tử lớn, bao gồm 4

phần: vùng A (adenyl hóa), vùng C ngưng tụ hoặc kéo dài, vùng E (epime hóa) và

TE (thioesterase), tham gia sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất thứ cấp không thông qua ribosom tạo dạng peptide (Schwarzer và cs., 2003) Hỗn hợp oligopeptide được tạo thành bởi NRPS nhờ quá trình ngưng tụ các protein và acid amin phi protein Trong quá trình tổng hợp, NRPS chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các acid amin có những sai khác nhờ sự tương tác với vùng epime hóa nhờ methyltransferase và oxidase (Mahera và cs., 2013) Mô đun đầu của NRPS, chỉ

chứa vùng A và PCP, trong khi mô đun cuối chứa vùng TE nhằm giải phóng chỗi peptide (Hình 1.4) (Arias và cs., 2011)

Hình 1.4 Sơ đồ mô tả hình thành chuỗn peptide gồm 4 mô đun và được mã hóa bởi

hai gen khác nhau Sản phẩm tạo ra là tetrapeptide

Chữ viết tắt: A: adenyl hóa; PCP: peptidyl carrier protein; C: ngưng tụ; TE:

thioesterase (Nguồn: Arias và cs., 2011) Nhóm gen mã hóa NRPS cho một loạt các peptide không thông qua ribosome bao gồm: các kháng sinh, các độc tố, siderophore, chất kháng viêm và ức chế miễn

dịch Tầm quan trọng của các hợp chất này đã thúc đẩy sự tìm kiếm rộng rãi những

gen nrps mới từ các chủng VSV phân lập và trong môi trường Mồi suy biến oligonucleotide (degenerate oligonucleotide primers) được thiết kế và sử dụng để

chứng minh sự đa dạng của các gen nrps trong xạ khuấn và nấm nội sinh thực vật

(Janso và Carter, 2010), trong xạ khuẩn (Golinska và cs., 2015; Nalini và Prakash, 2017) và nấm (Zhou và cs., 2011), phân lập từ bọt biển, vi khuẩn lam từ nước ngọt

và cuối cùng là xạ khuẩn biển (Gontang và cs., 2010)

B ảng 1.3 Các chất chuyển hóa được sinh tổng hợp bởi xạ khuẩn được sử dụng

trong y học với các cơ chế sinh tổng hợp

Kháng sinh Cụm gen tham

gia tổng hợp Đặc tính sinh học Xạ khuẩn

erythraea

(Nguồn: Arias và cs., 2011) Nhóm gen mã hóa cho kháng sinh chống ung thư bleomycin được coi là mô hình đại diện cho peptidepolyketide lai Các cơ chế sinh tổng hợp chuyển hóa lai này mở rộng đáng kể sự đa dạng về cấu trúc và chức năng của các sản phẩm tự nhiên (Bảng 1.3) Bleomycin là một kháng sinh chống ung thư tạo thành một phức

hợp sắt trung gian phản ứng với oxy để tạo ra các gốc tự do superoxide tách DNA

Do vậy, nhằm dự đoán cấu trúc của CKS, trình tự acid amin của PKS-I, PKS-II, NRPS được phân lập và so sánh với enzyme có trình tự tương tự tham gia vào quá trình tổng hợp các hợp chất polyketide và chuỗi peptide khác Khuếch đại các gen trên nhằm sàng lọc gen tham gia tổng hợp CKS, kháng viêm cũng như nghiên cứu

đa dạng của các gen pks-I, pks-II, nrps trong xạ khuẩn (Gontang và cs., 2010)

1.3.2.3 Các gen tham gia sinh t ổng hợp chất trao đổi thứ cấp

Mô thực vật bao gồm số lượng lớn các XKNS, tạo thành một phức hợp vi hệ sinh thái (El-Shatoury và cs., 2013) Mặc dù, không có sẵn dữ liệu về trình tự bộ gen của XKNS từ cây dược liệu, nhưng toàn bộ hệ gen đã được biết đến thuộc chi

Streptomyces như S avermitilis MA-4680 (Ikeda và cs., 2003) và S coelicolor

A(3)2 (Bentley và cs., 2002) và các chi khác chứa khoảng 20 hoặc nhiều hơn cụm gen sinh tổng hợp sản phẩm tự nhiên để sinh tổng hợp các chất đã biết hoặc dự đoán các chất chuyển hóa (Goodfellow và Fiedler, 2010) Cụm gen sinh tổng hợp sản

phẩm tự nhiên thường được xác định đặc hiệu bằng cách gắn với quá trình sinh tổng

hợp đích hoặc gen kháng hoặc bằng nhiều chiến lược in vivo như gây đột biến nhờ

gen nhảy (transposon mutagenesis) hoặc tạo các thể đột biến không ảnh hưởng tới

sản phẩm (nonproducting mutants) Nghiên cứu hệ gen cung cấp phương pháp thay

thế trực tiếp và đáng tin cậy, xác định hoặc dự đoán những gen tham gia tổng hợp các sản phẩm tự nhiên mà trước đó chưa có chu trình sinh tổng hợp cụ thể để tham

khảo (Nett và cs., 2009) Ví dụ, kháng sinh thiopeptide là được dự đoán từ hệ gen

của chủng S azureus và S laurentii sản xuất bởi ribosome hoặc nonribosomal

(Bagley và cs., 2005) Năm 1990, nghiên cứu đầu tiên về xác định các cụm gen sinh

tổng hợp thiostrepton không thu được kết quả; năm 2009, hai nhóm nghiên cứu độc

lập đã tìm ra thiostrepton thuộc nhóm bacteriocin Trong nghiên cứu khác, một phần trình tự bộ gen của chủng S laurentii với kích thước 7,26 Mb được lắp ráp từ 3600 đoạn trình tự ngắn, đã chú giải được các gen trên tsrA mã hóa thiostrepton

prepeptide (Kelly và cs., 2009) Ngoài thiostrepton, các cụm gen sinh tổng hợp các

chất bacteriocin thiopeptide khác gần đây cũng được xác định, bao gồm các gen mã hóa sinh tổng hợp siomycin A từ S sioyaensis, thiocillin từ B cereus và

thiomuracin từ chi xạ khuẩn hiếm Nonomuraea Hiện nay, các phương pháp cổ điển

để tìm kiếm và tách chiết các sản phẩm tự nhiên thường mang lại hiệu quả thấp trong việc đánh giá khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học, trong nhiều trường hợp giảm tới 80-90% hiệu suất phân tách Vì vậy, việc giải mã các gen/cụm gen mã hóa các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất tự nhiên cung cấp

giải pháp mới cho việc tìm kiếm các chất hóa học mới cho ngành công nghiệp dược

phẩm

1.3.3 Nghiên c ứu đặc tính và xác định cấu trúc kháng sinh

Việc thu nhận chất kháng sinh tùy thuộc vào CKS có trong sinh khối hay dịch lên men Hiện nay, nhiều nghiên cứu CKS từ xạ khuẩn thường sử dụng phương pháp tách chiết bằng dung môi Các dung môi hay được sử dụng gồm ethyl acetate, chloroform, ethanol, methanol,… (Khan và Patel, 2011) Nhiều nghiên cứu công bố cho thấy, ethyl acetate được sử dụng chủ yếu để tách chiết kháng sinh từ dịch lên men Về cơ bản, dù lựa chọn dung môi tách chiết hay phương pháp tinh sạch nào, quy trình tách chiết và tinh sạch kháng sinh chung đều được sử dụng theo mô tả của El-Naggar và cs (2017)

Theo Hanson, đặc tính hóa học của các hợp chất hữu cơ được nghiên cứu theo các bước: (1) đặc tính sơ bộ (xác định hằng số vật lý, trọng lượng phân tử và xác định các nhóm chức năng), (2) cấu trúc đơn giản (xác định khung C), (3) cấu trúc không gian (vị trí của các nhóm chức và cấu hình tương đối của chúng trong không