PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại tạo ra nhiều bản sao một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.. nhờ kĩ thuật PCR mà với một lượng nhõ
Trang 11. Tổng quan về PCR
1.1 khái niệm
- PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen" PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E coli hay nấm men PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống
1.2 Nguyên tắc
- Kỹ thuật tổng hợp PCR ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao ché DNA trong cơ thể như : Đoạn DNA cần nhân bản phải mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có cặp mồi ( mồi xuôi, mồi ngược),cần nguyên liệu , điều kiện môi trường thích hợp và enyme DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn thay cho helicase kết hợp với enzyme DNA olymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động nhờ kĩ thuật PCR mà với một lượng nhõ DNA ban đầu chúng ta có thể thu nhận được lượng DNA cần thiết để tiến hành thí
nghiệm về DNA
- Một phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mội chu kỳ gồm 3 giai đoạn:giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp và giai đoạn kéo dài chuỗi
1.3 Thực nghiệm PCR
- PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base) DNA là một sợi đôi,
và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base
- Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc
Trang 2nhân lên của DNA - Nucleotides (ví dụ dNTP)là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase
- Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD.
1.4 Ứng dụng PCR
- Vân tay di truyền :Vân tay di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác định một người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu thu được từ hiện trường vụ án có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của người tình nghi Có thể chỉ cần một lượng nhỏ DNA thu
từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc Về lý thuyết thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ
Kiểm tra huyết thống
Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments (1) Father (2) Child (3)
Mother The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint
Trang 3- Mặc dù các kết quả "dấu vân tay" là duy nhất (trừ cặp song sinh giống hệt nhau), mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột,
có thể được xác định từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, có thể được
sử dụng để thử nghiệm quan hệ cha con (Hình 4) Một biến thể của kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng để xác định các mối quan hệ tiến hóa giữa các sinh vật
Chẩn đoán bệnh di truyền
- Phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng phương pháp PCR Mỗi gen trong câu hỏi có thể dễ dàng được khuếch đại qua PCR bằng cách sử dụng các loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến
- Bệnh virus, cũng có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR thông qua khuếch đại của DNA của virus Phân tích này là có thể ngay sau khi nhiễm trùng, có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi các triệu chứng thực tế xảy ra Chẩn đoán sớm như vậy cho các bác sĩ dẫn quan trọng trong điều trị
- Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản toàn bộ một sinh
vật-mô tả quá trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó có thể được chèn vào một vector (vector là một phương tiện chèn một gen vào cơ thể) như một plasmid (một phân tử DNA vòng) (Hình 5) DNA sau đó có thể được chuyển thành một sinh vật khác nhau, nơi gen và sản phẩm của nó
có thể được nghiên cứu chặt chẽ hơn Thể hiện một gen nhân bản (thể hiện một gen có nghĩa là để sản xuất các protein mà nó xác định sản xuất) cũng
có thể là một cách để sản xuất hàng loạt hữu ích ví dụ protein-cho, thuốc men
2.
3. Figure 5: Cloning a gene using a plasmid.
(1) Chromosomal DNA of organism A (2) PCR (3) Multiple copies of a single
Trang 4gene from organism A (4) Insertion of the gene into a plasmid (5) Plasmid with gene from organism A (6) Insertion of the plasmid in organism B (7)
Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B
- Đột biến là một cách để làm thay đổi trình tự của các nucleotide trong DNA Có những tình huống trong đó một là quan tâm đến biến đổi (thay đổi) bản sao của một chuỗi ADN nhất định, ví dụ, khi đánh giá các chức năng của một gen hoặc trong trong ống nghiệm tiến hóa protein Đột biến
có thể được đưa vào trình tự DNA sao chép theo hai cách cơ bản khác nhau trong quá trình PCR Đột biến trang web hướng cho phép người thử
nghiệm để giới thiệu một đột biến tại một địa điểm cụ thể trên sợi DNA Thông thường, đột biến mong muốn được kết hợp trong các mồi sử dụng cho các chương trình PCR Đột biến ngẫu nhiên, mặt khác, dựa trên việc sử dụng các polymerase dễ bị lỗi trong quá trình PCR Trong trường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị trí và tính chất của đột biến không thể kiểm soát Một ứng dụng của đột biến ngẫu nhiên là để phân tích các mối quan hệ cấu trúc chức năng của protein Bằng cách thay đổi một cách ngẫu nhiên một chuỗi DNA, người ta có thể so sánh các protein kết quả với ban đầu và xác định chức năng của từng phần của protein
- Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích ADN đó là hàng ngàn năm tuổi Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên DNA của con người, trong các ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập đến việc xác định một Sa hoàng Nga
1.5 Ưu, nhược điểm của phương pháp PCR
- Ưu điểm : Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm Thực hiện đơn giản và ít tốn kém ( nó được thực hiện đồng thời ) Yêu cầu về độ tinh sạch của mậu không cao
- nhược điểm : cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại
để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn ( do thao tác nhiều lần) Sai sót còn do sử dụng E-Taq-plymerase khoang 104 ( sai sót cho 1 lần chép)