Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 729-2006

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 729-2006 về quy trình chẩn đoán bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli áp dụng cho các cán bộ thú y để chẩn đoán bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

 10TCN      TIÊU CHU N NGÀNH Ẩ

10 TCN 729­2006 QUY TRÌNH CH N ĐOÁN B NH PHÙ   L N Ẩ Ệ Ở Ợ

DO VI KHU N E. COLI Ẩ

Hà N i ­ 2006 ộ

TIÊU CHU N NGÀNH       10 TCN  729 – 2006Ẩ

QUY TRÌNH CH N ĐOÁN B NH PHÙ   L N Ẩ Ệ Ở Ợ

DO VI KHU N E. COLI Ẩ

(Ban hành kèm theo Quy t đ nh s        QĐ/BNN­KHCNế ị ố ngày       tháng 5 năm 2006 c a B  trủ ộ ưởng B  Nông nghi p và Phát tri n nôngộ ệ ể  

thôn)

1. Pham vi ap dung: ̣ ́ ̣

Áp dung cho cac can bô thu y đê chân đoan bênh phu   l n do vi khuân ̣ ́ ́ ̣ ́ ̉ ̉ ́ ̣ ̀ở ợ ̉ E.coli gây ra

2. Khai niêm bênh́ ̣ ̣

Bênh phu   l n do vi khuân ̣ ̀ở ợ ̉ E. coli co yêu tô bam dinh F18 va co kha năng san sinh đôć ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ̉ ̉ ̣  

tô verotoxin 2e gây ra.  Khi co ́ ́stress đăc biêt la khi thay đôi chê đô dinh ḍ ̣ ̀ ̉ ́ ̣ ương, nh ng chung̃ ữ ̉  

E.coli  chung co nhân tô bam dinh Fimbriae 18 (F18)̉ ́ ́ ́ ́   nhân lên trong ruôt non va bam vaọ ̀ ́ ̀  thanh ruôt.̀ ̣  Cac vi khuân nay san sinh đôc tô ́ ̉ ̀ ̉ ̣ ́Verotoxin (VT2e), đôc tô nay đ̣ ́ ̀ ược hâp phu vaó ̣ ̀  mau va đên cac tê bao biêu mô cua cac vi mach quan lam ć ̀ ́ ́ ́ ̀ ̉ ̉ ́ ̣ ̉ ̀ ương thâm thâu qua mach quaǹ ̉ ́ ̣ ̉   gây ra phu va cac triêu ch ng thân kinh điên hinh nh : Đi lai loang choang, xiêu veo hay nga,̀ ̀ ́ ̣ ứ ̀ ̉ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ 

co khi co giât.́ ̣

3. May moc ­ dung cu ­ môi tŕ ́ ̣ ̣ ương ­ hoa chât ­ nguyên liêù ́ ́ ̣

3.1 May moc va dung cú ́ ̀ ̣ ̣

­ Tu lanh ̉ ̣

­ Tu âm 37̉ ́ 0C

­ Nôi hâp ̀ ́ ươt́

­ Cân điêṇ

­ Kinh hiên vi phong đai 1000 lâń ̉ ́ ̣ ̀

­ Nôi đun cach thuy (̀ ́ ̉ Water bath)

­ Bô đô mô tiêu gia suc ̣ ̀ ̉ ̉ ́

­ Dung cu thuy tinh: Binh tam giac, ông đong, côc co mo, chai thuy tinh, đia lông, ông̣ ̣ ̉ ̀ ́ ́ ́ ́ ̉ ̉ ̃ ̀ ́   nghiêm, pipet, lam kinh.̣ ́

­ Cac dung cu khac: Panh, keo, dao căt, que cây, đen côn, but viêt kinh, bông thâḿ ̣ ̣ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́  

nươc, bông không thâm ń ́ ươc, khăn bông hoăc giây thâm mêḿ ̣ ́ ́ ̀

­ Dung cu đo pH ̣ ̣

3.2. Hoa chât́ ́

­ Côn ̀ Ethylic 

­ Côn ̀ Methylic – côn ̀ isomylic

­ Xylen

­ Natri hydroxyt

­ Natri bicarbonat

­ Nươc cât ́ ́

­ Dâu soi kinh ̀ ́

­ Bô thuôc nhuôm Gram (xem phu luc 1)̣ ́ ̣ ̣ ̣

­ Thuôc th  ́ ử Kovacs (xem phu luc 1)̣ ̣

­ Thuôc th  ́ ử Voges­Prskauer (xem phu luc 1)̣ ̣

­ Methyl red 

3.3. Môi trương va nguyên liêù ̀ ̣

­ Thach mau c  ban (̣ ́ ơ ̉ Blood agar base)

­ Thach MacConkey (hoăc thach ̣ ̣ ̣ Brilliant green) 

­ Môi trương VP­MR̀

­ Nươ peptone c ́

­ Môi trương ̀ Cimon Citrate

­ Mau bo, bê hoăc c u ́ ̀ ̣ ừ

­ Bô khang huyêt thanh ̣ ́ ́ E.coli chuân cua l n ̉ ̉ ợ

­ Khang nguyên F18́

­ Căp môi (̣ ̀ primer) phat hiên yêu tô bam dinh F18́ ̣ ́ ́ ́ ́

­ Căp môi (̣ ̀ primer) phat hiên gene vt2e (yêu tô đôc l c VT2e)́ ̣ ́ ́ ̣ ự

­ Cac nguyên liêu cân thiêt cho PCŔ ̣ ̀ ́

4. Phương phap chân đoań ̉ ́

S  đô chân đoan bênh phu do vi khuân ơ ̀ ̉ ́ ̣ ̀ ̉ E. coli 

S  đô chân đoan bênh phu do vi khuân ơ ̀ ̉ ́ ̣ ̀ ̉ E. coli

§Æc ®iÓm

dÞch tÔ KiÓm tra l©m sµng

4.1.Đăc điờm dich tẹ̃ ̉ ̣

ư Bờnh tḥ ương xuõt hiờn tr̀ ́ ̣ ươc va sau khi cai s a. ́ ̀ ữ

ư Bờnh xuõt hiờn le te, it lõy lan t  đan nay sang đan khac va tḥ ́ ̣ ̉ ̉ ́ ừ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ương trong điờu kiờǹ ̀ ̣   nuụi dương tụt.̃ ́

ư L n bi bờnh thợ ̣ ̣ ương la nh ng con phat triờn nhanh nhõt trong đan.̀ ̀ ữ ́ ̉ ́ ̀

ư Ti lờ chờt khoang 65%.̉ ̣ ́ ̉

4.2. Triờu ch ng lõm sang̣ ứ ̀

ư Mụt hoăc nhiờu l n bi chờt đụt ngụt ma khụng biờu hiờn triờu ch ng lõm sang. ̣ ̣ ̀ ợ ̣ ́ ̣ ̣ ̀ ̉ ̣ ̣ ứ ̀

ư Thõn kinh rụi loan bao gụm: đi lai loang choang, xiờu veo hay nga, co khi co giõt.̀ ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ ́ ̣

ư Phu   mi măt,   măt, phõn bung phu va s ng to.̀ở ́ ́ ở ̣ ̀ ̣ ̀ ̀ ư

ư Th  kho, kờu khan khan do thanh quan bi phu.ở ́ ̀ ̀ ̉ ̣ ̀

ư L n co biờu hiờn bo ăn, bo bu. Hiờn tợ ́ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ượng nay co the keo dai trong nhiờu ngay. ̀ ́ ̉ ́ ̀ ̀ ̀

ư ia chay, phõn long co khi toan n̉ ̉ ̉ ́ ̀ ươc hoăc lõn cuc mau t́ ̣ ̃ ̣ ́ ươi

ư L n thợ ư ng chờt trong vong t  4 gi  đờn 48 gi  sau khi co triờu ch ng lõm sang. ờ ́ ̀ ừ ờ ́ ờ ́ ̣ ứ ̀

4.3. Bờnh ticḥ ́

ư Phu d̀ ươi da toan thõn.́ ̀

ư Phu   mi măt, kờt mac,  đ̀ở ́ ́ ́ ̣ ương cong l n da day.̀ ớ ̣ ̀

ư Co dich nhõy   d́ ̣ ̀ ở ư i niờm mac da day.ớ ̣ ̣ ̀

Mổ khám Kiểm tra bệnh tích

Phân lập, giám định sinh hoá, KHV

Kết luận

Bệnh phẩm

Định týp huyết thanh Xác định yếu tố độc

lực F18 và VT2

4.4.Phương phap chân đoan trong phong thi nghiêḿ ̉ ́ ̀ ́ ̣

   4.4.1. Lây mâú ̃

­ Dung cu lây mâu: lo thuy tinh, binh tam giac hoăc tui nilông vô trung̣ ̣ ́ ̃ ̣ ̉ ̀ ́ ̣ ́ ̀

­ Bênh phâm: Lây vô trung phu tang, hach mang treo ruôt, ruôt non môi  loai cho vaọ ̉ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ ̀ ̣ ̣ ̃ ̣ ̀ 

t ng lo riêng biêt đây kin va đ a ngay vao phong xet nghiêm cang nhanh cang tôt. Nêu phongừ ̣ ̣ ̣ ́ ̀ ư ̀ ̀ ́ ̣ ̀ ̀ ́ ́ ̀   thi nghiêm   xa, bênh phâm phai đ́ ̣ ở ̣ ̉ ̉ ược bao quan trong đIêu kiên lanh t  2̉ ̉ ̀ ̣ ̣ ừ 0C đên 8́ 0C va g ì ử  

vê phong xet nghiêm châm nhât 48h sau khi lây mâu.̀ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̃

  4.4.2. Nuôi cây, phân lâp giam đinh vi khuâń ̣ ́ ̣ ̉

  4.4.2.1. Nuôi cây, phân lâp ́ ̣

Bênh phâm đ̣ ̉ ược nuôi cây trên môi tŕ ương: Thach mau, thach ̀ ̣ ́ ̣ MacConkey (nêú 

không co thach  ́ ̣ MacConkey thi co thê thay băng thach  ̀ ́ ̉ ̀ ̣ Brilliant green). Nuôi   37ở 0C trong  điêu kiên hiêu khi  24 gi  ̀ ̣ ́ ́ ờ

   4.4.2.2. Giam đinh đăc tinh sinh hoá ̣ ̣ ́ ́

       Môt sô đăc tinh sinh hoa đăc tr ng cua vi khuân ̣ ́ ̣ ́ ́ ̣ ư ̉ ̉ E.coli

­ Trên môi trương thach ̀ ̣ MacConkey khuân lac ̉ ̣ E.coli co mau hông đâm, nham, đ́ ̀ ̀ ̣ ́ ươ  ng̀ kinh 2­4 mm. ́

­ Trên môi trương thach ̀ ̣ Brilliant green khuân lac ̉ ̣ E.coli mau vang va môi tr̀ ̀ ̀ ương tr̀ ở  nên vang chanh. ̀

­ Thach mau: ̣ ́ E. coli gây bênh phu tḥ ̀ ương gây dung huyêt thach mau. Khuân lac maù ́ ̣ ́ ̉ ̣ ̀  trăng xam, tron, bong. ́ ́ ̀ ́

­ Ki m tra hình thái vi khu n trên kính hi n vi:ể ẩ ể

L y que c y ch m vào khu n l c nghi ng  trên th ch máu, hòa vào g ot nấ ấ ấ ẩ ạ ờ ạ ị ước sinh lý  trên phi n kính ho c l y m t vòng que c y canh trùng đã nuôi c y vi khu n giàn m ng trênế ặ ấ ộ ấ ấ ẩ ỏ   phi n kính, đ  khô, r i c  đ nh tiêu b n trên ng n l a đèn c n.ế ể ồ ố ị ả ọ ử ồ

Tiêu b n sau khi đã đả ược c  đ nh, nhu m b ng phố ị ộ ằ ương pháp Gram (Ph  l c 4). Xemụ ụ   tiêu b n b ng v t kính d u 100X.ả ằ ậ ầ

Vi khu n b t m u đ  (màu Gram âm), d ng tr c khu n ng n, c u khu n ho c hìnhẩ ắ ầ ỏ ạ ự ẩ ắ ầ ẩ ặ  

b u d c, đ ng r i rác, không thành chu i.ầ ụ ứ ả ỗ

­ Sau khi ki m tra hình thái trên kính hi n vi, c y khu n l c vào môi trể ể ấ ẩ ạ ường th chạ   McConkey

­ Ch n khu n l c có m u h ng đ m trên th ch McConkey c y vào môi trọ ẩ ạ ầ ồ ậ ạ ấ ường nướ  c

th t hay nị ước peptone đ  ti p t c ki m tra các đ c tính sinh hóa.ể ế ụ ể ặ

­ Phan  ng IMViC ̉ ứ

IMViC = sinh Indol, methyl red (MR), Voges­Proskauer (VP) va citrate)̀

Vi khuân̉ Indol MR VP Citrate Lactose Dung 

huyêt́

T  nh ng khuân lac co mau hông đâm trên thach  ừ ữ ̉ ̣ ́ ̀ ̀ ̣ ̣ MacConkey  va gây dung huyêt trêǹ ́   thach mau, tiên hanh lam phan  ng IMViC.̣ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ứ

Vi khuân ̉ E. coli co IMViC=  +/ + / ­/­́

+ Sinh  Indol: cây khuân lac vao môi tŕ ̉ ̣ ̀ ương ǹ ươ peptone  hay môi trc  ́ ương co ch à ́ ư  ́ tryptophan, nuôi   37ở 0C t  18 gi  đên 24 gi  Nho 0,2 ml đên 0,3 ml thuôc th   ừ ờ ́ ờ ̉ ́ ́ ử Kovacs vaò 

môi trương đa nuôi cây vi khuân, nêu trên bê măt môi tr̀ ̃ ́ ̉ ́ ̀ ̣ ương co vong mau đo   la phan  ng̀ ́ ̀ ̀ ̉ ở ̀ ̉ ư  ́

dương tinh.   ́

+ VP: Cây khuân lac nghi ng  vao môi tŕ ̉ ̣ ờ ̀ ương ǹ ươc VP­MR, nuôi   37́ ở 0C sau 24 gi  nhoờ ̉  vao môi tr̀ ương nuôi cây trên 5 giot thuôc th  VP (xem phân phu luc), đoc kêt qua sau 2 gì ́ ̣ ́ ử ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ơ ̀ phut, nêu co mau đo hông la d́ ́ ́ ̀ ̉ ̀ ̀ ương tinh, không biên mau hoăc mau vang la âm tinh.́ ́ ̀ ̣ ̀ ̀ ̀ ́

+ MR: Cây khuân lac nghi ng  vao môi tŕ ̉ ̣ ờ ̀ ương ǹ ươc VP­MR, nuôi   37́ ở 0C sau 24 gi ̀ơ  nho vao môi tr̉ ̀ ương nuôi cây trên 5 giot dung dich đo methyl trong côn 95̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̀ 0 (xem phân phù ̣  luc), đoc kêt qua sau 5 phut, nêu co mau đo la phan  ng ḍ ̣ ́ ̉ ́ ́ ́ ̀ ̉ ̀ ̉ ứ ương tinh, co mau vang la âm tinh.́ ́ ̀ ̀ ̀ ́

+  Citrate: kiêm tra s  s  dung  ̉ ự ử ̣ citrate  cua vi khuân. Cây khuân lac vao thach  ̉ ̉ ́ ̉ ̣ ̀ ̣ simon  citrate nuôi   37ở 0C t  18 gi  đên 24 gi  Vi khuân s  dung citrate (dừ ờ ́ ờ ̉ ử ̣ ương tinh) lam môí ̀  

trương chuyên t  mau xanh la cây sang mau xanh ǹ ̉ ừ ̀ ́ ̀ ươc biên. Âm tinh khi môi tŕ ̉ ́ ương gì ư ̃ nguyên mau xanh la cây.  ̀ ́

   4.4.2.3. Kiêm tra kha năng san sinh đôc tô F18 va VT2ẻ ̉ ̉ ̣ ́ ̀

Kiêm tra yêu tô bam dinh F18 băng phan  ng ̉ ́ ́ ́ ́ ̀ ̉ ứ Polymerase chain reaction (PCR) hay ng ngư   kêt nhanh trên phiên kinh́ ́ ́

­ Kiêm tra băng phan  ng ng ng kêt nhanh trên phiên kinh v i khang nguyên F18̉ ̀ ̉ ứ ư ́ ́ ́ ớ ́

+  Đê tim yêu tô bam dinh F18, nuôi cây vi khuân ̉ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ̉ E. coli trên môi trương ̀ Minca hoăc̣

+  Lây khuân lac, hoăc vi khuân trong cac canh trung nuôi cây lam phan  ng ng ng kêt́ ̉ ̣ ̣ ̉ ́ ̀ ́ ̀ ̉ ứ ư ́  nhanh trên phiên kinh v i khang nguyên F18 theo h́ ́ ớ ́ ương dân cua nha san xuât́ ̃ ̉ ̀ ̉ ́

­ PCR đê phat hiên gene f18 san sinh yêu tô bam dinh F18 ̉ ́ ̣ ̉ ́ ́ ́ ́

4.4.2.4. Kiêm tra kha năng san sinh đôc tô ́̉ ̉ ̉ ̣ Verotxin 

­ Kiêm tra đôc l c trên đông vât thi nghiêm la chuôt nhăt trăng ̉ ̣ ự ̣ ̣ ́ ̣ ̀ ̣ ́ ́

+ Tiêm 2 chuôt nhăt trăng môi con 0,2 ml canh trung nuôi cây tinh (không lăc). Nêu cọ ́ ́ ̃ ̀ ́ ̃ ́ ́ ́  đôc l c chuôt chêt sau 24 gi ̣ ự ̣ ́ ờ

­ Dung phan  ng PCR phat hiên gene vt2e (yêu tô đôc l c VT2e ­ Nêu co điêu kiên)̀ ̉ ứ ́ ̣ ́ ́ ̣ ự ́ ́ ̀ ̣

5. Kêt luâń ̣

D a trên đăc điêm dich tê,   triêu ch ng lâm sang, bênh tich   va kêt qua chân đoanự ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ứ ̀ ̣ ́ ̀ ́ ̉ ̉ ́  trong phong thi nghiêm:̀ ́ ̣

­ Phân lâp, giam đinh đăc tinh sinh hoạ ́ ̣ ̣ ́ ́

­ Kiêm tra yêu tô đôc l c F18 va VT2ẻ ́ ́ ̣ ự ̀

KT. B  TRỘ ƯỞNG

      TH  TRỨ ƯỞNG

        Bùi Bá B ng ổ

Phu luc ̣ ̣

Phu luc 1: Nhuôm graṃ ̣ ̣

1. Thuôc nhuôḿ ̣

a Dung dich kêt tinh tim ̣ ́ ́

Kêt tinh tim ́ ́ 2,5g

Nươc cât́ ́ 1000 ml

b Dung dich ̣ fuscin mẹ

Côn 96̀ 0 C  10 ml

Nươc cât́ ́ 100ml       Pha loang dung dich me theo ti lê 1/10 v i ñ ̣ ̣ ̉ ̣ ơ ướ c cât khi nhuôḿ ́ ̣

c Dung dich ̣ lugol 

Iodua kali  1g Iodua tinh thê ̉ 0,5g

Nươc cât́ ́ 150 ml

d Côn axeton ̀

Côn nguyên chât ̀ ́ 3 phân ̀ Axeton  1 phâǹ

2. Cach nhuôm ́ ̣

- Nho dung dich tim  lên tiêu ban: 1 phut đên  2 phut ̉ ̣ ́ ̉ ́ ́ ́

- R a nử ươc nhanh, vây khô ń ̉ ươć

- Nho dung dich ̉ ̣ lugol: đê 1 phut ́̉

- R a nử ươc nhanh, vây khô ́ ̉

- Nho côn ̉ ̀ Axeton 

- R a nử ươc thât nhanh́ ̣

- Nho dung dich ̉ ̣ fucsin loang: Đê 1 phut ̃ ̉ ́

- R a nử ươc ́

- Thâm khô. Sây khô ́ ́

3. Xem kinh băng vât kinh dâú ̀ ̣ ́ ̀

- Vi khuân gram d̉ ương băt mau tim ́ ̀ ́

- Vi khuân gram âm băt mau đo ̉ ́ ̀ ̉

Phu luc 2: Thuôc th  Kovacṣ ̣ ́ ử

a­ Paradimetylaminobenzaldehyte   2,5 g

b­ Amyl alcohol (côn amyl)̀  37,5 ml

c­ HCL đăc̣ 12,5 ml

Cach pha: Hoa dung dich a vao b cho tan hêt va đê trong t  lanh âm 4́ ̀ ̣ ̀ ́ ̀ ̉ ử ̣ 0C. Thêm 5ml đêń 

10 ml HCL t  t  hoa đêu rôi đê tu lanh cho lanh lai tiêp tuc đô HCL cho đu lư ừ ̀ ̀ ̀ ̀ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ́ ̣ ̉ ̉ ượng

* Thuôc th  không đ́ ử ược đê qua nong trong luc pha chê. Bao quan trong lo mau, lanh.̉ ́ ́ ́ ́ ̉ ̉ ̣ ̀ ̣

Dương tinh: Vong thuôc th  co mau đó ̀ ́ ử ́ ̀ ̉

Âm tinh: Vong thuôc th  co mau vanǵ ̀ ́ ử ́ ̀ ̀

Phu luc 3: Thuôc th  phan  ng VP̣ ̣ ́ ử ̉ ứ Chê thuôc th́ ́ ử

­ Dung dich 1:     Alpha­naphthol      5g̣

      Côn 96      100 ml̀

­ Dung dich 1:     NaOH      40g̣

      Nươc cât      100 ml ́ ́

Tiên hanh phan  ng: cây vi khuân cân kiêm tra vao  môi tŕ ̀ ̉ ứ ́ ̉ ̀ ̉ ̀ ương VP – MR, nuôi cây ̀ ́ ở 

370C  t  24 gi  đên 48 gi , sau đo nho vao môi trừ ờ ́ ờ ́ ̉ ̀ ương nuôi cây trên 5 giot dung dich 1 va 2.̀ ́ ̣ ̣ ̀   Sau 5 phut co mau đo hông la ́ ́ ̀ ̉ ̀ ̀phan  ng d̉ ứ ương tinh. Không biên mau hoăc mau vang la phań ́ ̀ ̣ ̀ ̀ ̀ ̉  

ng âm tinh. 

́ ́

ư

Phu luc 3: Thuôc th  phan  ng MṚ ̣ ́ ử ̉ ứ

Đo methyl      0,04g̉

Côn 95       60 ml̀

Nươc cât      40 mĺ ́