Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 815-2006

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 815-2006 về quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt áp dụng để chẩn đoán bệnh Dịch tả vịt tại các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh động vật. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

B  NÔNG NGHI P VÀ PHÁT TRI N NÔNG THÔNỘ Ệ Ể

 10TCN       TIÊU CHU N NGÀNH Ẩ

10 TCN 815­2006

TIÊU CHU N NGÀNH       10 TCN 815­2006Ẩ

QUY TRÌNH CH N ĐOÁN B NH D CH T  V T Ẩ Ệ Ị Ả Ị

Protocol for duck virus enteritis diagnosis (Ban hành kèm theo Quy t đ nh s       QĐ/BNN­KHCNế ị ố    ngày        tháng  12  năm 2006 c a B  trủ ộ ưởng B  Nông nghi p và Phát tri n nông thôn)ộ ệ ể

1. Pham vi ap dung:̣ ́ ̣

Quy trinh nay đ̀ ̀ ược ap dung đê chân đoan bênh Dich ta vit tai cac phong thi nghiêḿ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ ̀ ́ ̣   chân đoan bênh đông vât.̉ ́ ̣ ̣ ̣

2. Khai niêḿ ̣

­ Bênh Dich ta vit (Duck Virus Enteritis ) la bênh truyên nhiêm câp tinh nguy hiêṃ ̣ ̉ ̣ ̀ ̣ ̀ ̃ ́ ́ ̉   xay ra   vit, ngan, ngông cac l a tuôi. ̉ ở ̣ ̃ ́ ứ ̉

­ Nguyên nhân gây bênh do herpes virus.̣

3. Lây mâú ̃:

3.1. Lây mâu:́ ̃

  Mâu bênh phâm lây t  vit nghi măc bênh la:̃ ̣ ̉ ́ ư ̣̀ ́ ̣ ̀

­ Gan, lach, thân (đôi v i vit chêt lây mâu trong vong 24h). ́ ̣ ́ ớ ̣ ́ ́ ̃ ̀

­ Huyêt thanh.́

3.2. Bao quan va g i mâu bênh phâm ̉ ̉ ̀ ử ̃ ̣ ̉

­ Mâu đ̃ ược lây ngay sau khi mô kham.́ ̉ ́

­ Mâu đ̃ ược lây vao lo hoăc tui nylon sach.́ ̀ ̣ ̣ ́ ̣

­ Dan nhan.́ ̃

­ Bao quan mâu   nhiêt đô 4­8̉ ̉ ̃ ở ̣ ̣ oC

­ Co phiêu g i bênh phâm.́ ́ ử ̣ ̉

4. May moc ­ Dung cu ­ Hoa chât ­ Nguyên liêú ́ ̣ ̣ ́ ́ ̣

4.1. May moć ́́:

­ Tu lanh âm̉ ̣ ́: ­15 đên ­20́ oC

­ Tu lanh th̉ ̣ ương: +2 đên +8̀ ́ oC

­ Tu âm.̉ ́

­ Tu âm CỎ ́ 2

­ May lăc đia (orbital shaker).́ ́ ̃

­ May lăc trôn (vortex mixer).́ ́ ̣

­ May khuây t ́ ́ ừ

­ Nôi đun cach thuy (water bath).̀ ́ ̉

­ Buông cây BSC (Bio­safety cabinet).̀ ́

­ May ly tâm.́

­ May hut chân không.́ ́

­ Đen soi tr ng.̀ ứ

­ Tu âp tr ng.̉ ́ ứ

4.2. Dung cu:̣ ̣

­ Binh tam giac cac c : 100, 200, 500 va 1000 ml.̀ ́ ́ ỡ ̀

­ ống đong thuy tinh cac c : 50, 100, 200, 500 va 1000 ml.̉ ́ ỡ ̀

­ Côc co mo cac c : 100, 200, 500 va 1000 ml.́ ́ ̉ ́ ỡ ̀

­ ống nghiêm.̣

­ Lo nho chăt huyêt thanh.̣ ̉ ́ ́

­ Pipet thuy tinh: 1, 5 va 10 ml.̉ ̀

­ Micropipet đ n: 0,5­10, 5­40, 40­200, 200­1000 ơ ml

­ Micropipet nhiêu đâu (8­12): 5­50, 50­300 ̀ ̀ ml

­ Côi chay s ́ ̀ ứ

­ Khăn bông

­ Dao, keo, panh kep.́ ̣

­ Khuây t ́ ừ

­ Dung cu nuôi cây tê bao: lo nh a T25, đia nh a 96 lô, đia nuôi cây 6 lô, 24 lô.̣ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ự ̃ ự ̃ ̃ ́ ̃ ̃

­ Mang loc Millipor 0,45̀ ̣ mm

­ Đia petri.̃

4.3. Hoa chât ́ ́ (hóa ch t phân tích tinh khi t dành cho phòng thí nghi m)ấ ế ệ

­ Nươc cât hoăc ń ́ ̣ ươc kh  ion.́ ử

­ NaCl

­ KCl

­ Na2HPO4

­ KH2PO4

­ NaHCO3

­ Chloroform. 

­ Tris/HCl

­ EDTA

­ Hoa chât đê tiêu đôc, tiêt trung: Formalin, Chloramin.́ ́ ̉ ̣ ̣ ̀

4.4. Nguyên liêu:̣

­ Môi trương nuôi cây tê bao:̀ ́ ́ ̀

+ L­glutamine

+ TPB – Tryptose Photphat Broth

+ Trypsine 

+ Eagle’s minimum essential medium (MEM)

+ Tryptose Photphat Broth (TPB)

­ Khang sinh: Penicillin, Streptomyciń , Kanamycin.      

­ Vit con 1­7 ngay tuôi.̣ ̀ ̉

­ Tr ng vit co phôi (11­12 ngay tuôi).ứ ̣ ́ ̀ ̉

­ Tr ng vit co phôi (9­10 ngay tuôi): dung đê lam tê bao x  phôi vit (DEF – Duck Embryoứ ̣ ́ ̀ ̉ ̀ ̉ ̀ ́ ̀ ơ ̣   Fibroblast)

­ Giông virus Dich ta vit.́ ̣ ̉ ̣

­ Khang huyêt thanh Dich ta vit.́ ́ ̣ ̉ ̣

5. Cac ph́ ương phap chân đoań ̉ ́

S  Đ  CH N ĐOÁN B NH D CH T  V TƠ Ồ Ẩ Ệ Ị Ả Ị

Giam đinh́ ̣   (VN)

(+) (­)

Đăc điêm dich tê  ̣ ̉ ̣ ̃

hoc̣

Pha t hiên ́ ̣

kha ng thê ́ ̉(SN)

Pha t hiên viruś ̣

Lâ y mâ u bênh ́ ̃ ̣

phâm̉

Kiêm tra lâm sa ng̉ ̀

5.1. Kiêm tra môt sô đăc điêm dich tê hoc – triêu ch ng:̉ ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ̣ ứ ́́

­ Tim hiêu bênh s  va truyên lây cua bênh nh :̀ ̉ ̣ ử ̀ ̀ ̉ ̣ ư

+ Bênh xay ra   vit, ngan, ngông moi l a tuôi.̣ ̉ ở ̣ ̃ ̣ ứ ̉

+ Bênh lây lan nhanh va trâm trong trong khoang 2­3 ngay.̣ ̀ ̀ ̣ ̉ ̀

­ Kiêm tra triêu ch ng: ̉ ̣ ứ

+ Giam ăn, mât thăng băng, ia phân loang, xu lông. ̉ ́ ̀ ̉ ̃ ̀

+ Măt co d , mi măt s ng, s  anh sang, chay ń ́ ử ́ ́ ư ợ ́ ́ ̉ ươc mui.́ ̃

5.2 Kiêm tra bênh tich:̉ ̣ ́

­ Kiêm tra bênh tich đai thê:̉ ̣ ́ ̣ ̉  

+   vit trỞ ̣ ưởng thanh co hiên t̀ ́ ̣ ượng gan bi bac mau.   con đ c tṛ ̣ ̀ ở ự ưởng thanh co thê xaỳ ́ ̉ ̉  

ra hiên ṭ ượng dương vât bi thay đôi vi tri,   con cai quan sat thây cac nang tr ng bi xuâṭ ̣ ̉ ̣ ́ở ́ ́ ́ ́ ứ ̣ ́  huyêt.́

+ Mach mau bi tôn tḥ ́ ̣ ̉ ương, tôn th̉ ương hê bach huyêt, thoai hoa nhu mô. ̣ ̣ ́ ́ ́ ống tiêu hoá 

co nhiêu chât nh n. Đây la đăc tr ng cua bênh Dich ta vit.́ ̀ ́ ờ ̀ ̣ ư ̉ ̣ ̣ ̉ ̣

­ Kiêm tra bênh tich vi thê:̉ ̣ ́ ̉  

+ Tôn th̉ ương mach mau va cac c  quan phu tang. Xuât hiên cac thê vui nôi nhân, thệ ́ ̀ ́ ơ ̉ ̣ ́ ̣ ́ ̉ ̀ ̣ ̉  vui tê bao chât trong cac tê bao biêu mô cua hê thông tiêu hoa. Đây la bênh tich đăc tr ng̀ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̉ ̉ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ́ ̣ ư   cua bênh.̉ ̣

5.3. Chân đoan phong thi nghiêm̉ ́ ̀ ́ ̣

5.3.1. Phat hiên virus:́ ̣

X  ly bênh phâmử ́ ̣ ̉ :

­ Mâu gan, lach, thân đ̃ ́ ̣ ư c x  ly thanh huyên dich 10% v i PBS co ch a 200 UI/mlợ ử ́ ̀ ̃ ̣ ớ ́ ứ   Penicillin va 200̀ mg/ml Streptomycin

­ Ly tâm 2.000 vong/15ph.̀

­ Lây dich trong   trên.́ ̣ ở

­ Kiêm tra vô trung:  trên môi tr̉ ̀ ương ǹ ươc thit BHI, hoăc môi tŕ ̣ ̣ ương thach mau.̀ ̣ ́

5.3.1.1. Phân lâp virus:̣

a. Phân lâp trên tr ng vit co phôi: ̣ ứ ̣ ́

­ Tiêm 0,2ml huyên dich bênh phâm đa x  ly vao xoang niêu mô hoăc mang CAM phôi vit̃ ̣ ̣ ̉ ̃ ử ́ ̀ ̣ ̣ ̀ ̣   11­12ngay: 5 phôi/mâu bênh phâm.̀ ̃ ̣ ̉

­ Tr ng đứ ược âp tiêp   tu âp 37́ ́ ở ̉ ́ oC

­ Soi tr ng. Loai bo nh ng phôi chêt trong khoang 24h sau khi tiêm.ứ ̣ ̉ ữ ́ ̉

­ Virus DTV gây chêt phôi sau 4­10 ngay v i đăc tr ng: Xuât huyêt lan rông.́ ̀ ớ ̣ ư ́ ́ ̣

­ Thu hoach gan phôi va ṇ ̀ ư c niêu đê giam đinh virus.ớ ̣ ̉ ́ ̣

Kết luận

Kêt luân bênh ́ ̣ ̣

b. Phân lâp trên tê bao x  phôi vit (Duck Embryo Fibroblast – DEF):̣ ́ ̀ ơ ̣

­ Cây tê bao DEF trên cac lo nuôi cây T25 hoăc đia nuôi cây ( đia nuôi cây 6 lô, 24 lô), saú ́ ̀ ́ ̣ ́ ̣ ̃ ́ ̃ ́ ̃ ̃   2­3 ngay tê bao moc thanh tham (khoang 70%) thi gây nhiêm huyên dich bênh phâm đa x̀ ́ ̀ ̣ ̀ ̉ ̉ ̀ ̃ ̃ ̣ ̣ ̉ ̃ ử  ly: 500µl/lô hoăc lo. Viêc cây chuyên 2 lân la cân thiêt trong qua trinh phân lâp.́ ̃ ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ̣

­ Quan sat bênh tich tê bao (CPE­Cytopathic pathogene effect): đăc tr ng v i đam tê bao to,́ ̣ ́ ́ ̀ ̣ ư ớ ́ ́ ̀   tron va tr  nên hoai t  sau 2­4 ngay sau đo.̀ ̀ ở ̣ ử ̀ ́

­ Thu hoach hôn dich tê bao, đông tan, ly tâm va thu phân ṇ ̃ ̣ ́ ̀ ̀ ̀ ước trong cho giam đinh virus.́ ̣ 5.3.1.2. Phương phap giam đinh virus ́ ́ ̣

a. Phương phap trung hoa trên tr ng vit co phôi (VN ­ Virus Nertralization):́ ̀ ứ ̣ ́

(phôi vit 10­14 ngay tuôi).̣ ̀ ̉

­ Chuân bi:̉ ̣

+ Pha loang virus phân lâp: Nông đô 10̃ ̣ ̀ ̣ ­1–10­9 v i dung dich PBS.ớ ̣

+ Lô đôi ch ng (+): Trôn khang huyêt thanh d́ ứ ̣ ́ ́ ương tinh DTV v i cac nông đô viruś ớ ́ ̀ ̣  

đa pha loang theo ty lê 1:1.̃ ̃ ̉ ̣

+ Lô đôi ch ng (­): Trôn huyêt thanh (­) tinh v i cac nông đô virus đa pha loang theó ứ ̣ ́ ́ ớ ́ ̀ ̣ ̃ ̃  

ty lê 1:1.̉ ̣

+   hôn h p trên    nhiêt đô 37Ủ ̃ ợ ở ̣ ̣ oC/1h

­ Tiên hanh:́ ̀

+ Tiêm hôn h p trên vao xoang niêu mô phôi tr ng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nông đô.̃ ợ ̀ ̣ ứ ̀ ̣ + Phôi được âp tiêp   tu âp 37́ ́ ở ̉ ́ oC trong 10 ngay. Loai bo nh ng phôi chêt tr̀ ̣ ̉ ữ ́ ươc 24h.́ + Phôi chêt xay ra trong 4­10 ngay, co bênh tich coi coc, xuât huyêt lan rông.́ ̉ ̀ ́ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ́ ̣

­ Đanh gia kêt qua:́ ́ ́ ̉

Tinh toan chi sô trung  hoa NI (neutralization index).́ ́ ̉ ́ ̀  

b. Phương phap trung hoa trên tê bao x  phôi vit (DEF):́ ̀ ́ ̀ ơ ̣

­ Chuân bi: ̉ ̣

+ Tê bao DEF trên đia nuôi cây tê bao 96 lô đa nuôi cây đ́ ̀ ̃ ́ ́ ̀ ̃ ̃ ́ ược 2­3 ngay.̀

+ Pha loang virus phân lâp: cac nông đô 10̃ ̣ ́ ̀ ̣ ­1–10­9 v i môi trớ ư ng nuôi cây MEM.ờ ́ + Lô đôi ch ng (+): trôn khang huyêt thanh d́ ứ ̣ ́ ́ ương tinh DTV v i cac nông đô viruś ớ ́ ̀ ̣  

đa pha loang theo ty lê 1:1.̃ ̃ ̉ ̣

+ Lô đôi ch ng (­): trôn huyêt thanh (­) tinh v i cac nông đô virus đa pha loang theó ứ ̣ ́ ́ ớ ́ ̀ ̣ ̃ ̃  

ty lê 1:1.̉ ̣

­ Tiên hanh:́ ̀

+ Gây nhiêm hôn h p trên vao đia đa nuôi cây tê bao DEF (đia 96 lô), 100µl/lô, 8̃ ̃ ợ ̀ ̃ ̃ ́ ́ ̀ ̃ ̃ ̃   lô/nông đô.̃ ̀ ̣

+ Ủ đia nuôi cây   tu âm CÕ ́ ở ̉ ́ 2   37ở oC/1h

+ Đô bo hôn h p trên, cho môi tr̉ ̉ ̃ ợ ương nuôi cây MEM 100µl/lô.̀ ́ ̃

+ Tiêp tuc u đia nuôi cây   tu âm CÓ ̣ ̉ ̃ ́ ở ̉ ́ 2   37ở oC. 

+ Kiêm tra bênh ly tê bao (CPE) trong 3­7 ngay v i biêu hiên tê bao to tron va tu laỉ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ớ ̉ ̣ ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ̣   thanh t ng đam, th i gian lâu co hiên t̀ ừ ́ ờ ́ ̣ ượng tê bao bi hoai t ́ ̀ ̣ ử

­ Đanh gia kêt qua:́ ́ ́ ̉

+ Tinh toan chi sô trung hoa NI (neutralization index).́ ́ ̉ ́ ̀

5.3.1.3. Phát hi n virus D ch t  v t b ng phệ ị ả ị ằ ương pháp PCR:

PCR có th  dùng đ  phát hi n virus DTV trong các t  ch c nh : Th c qu n, gan và ể ể ệ ổ ứ ư ự ả lách ho c sau khi ti n hành phân l p trên phôi v t.ặ ế ậ ị

a Chi t tách DNA virus:ế

DNA có th  chi t tách t  d ch t  bào phân l p virus, huy n d ch b nh ph m 10% ể ế ừ ị ế ậ ễ ị ệ ẩ

ho c d ch ngoáy   nh p.ặ ị ổ ớ

­ Bước 1: Đ i v i huy n d ch b nh ph m 10%: Nh  400 µl vào  ng 1.5ml và ly ố ớ ễ ị ệ ẩ ỏ ố tâm    16000 g trong 5 phút. Hút d ch n i sang  ng m i và b t đ u bở ị ổ ố ớ ắ ầ ước 2

­ Bước 2: Đ i v i d ch t  bào và d ch ngoáy   nh p: Nh  400 µl m u ho c d ch ố ớ ị ế ị ổ ớ ỏ ẫ ặ ị

n i t  bổ ừ ước trên vào  ng 1.5 ml và ly tâm   16000 – 20000 g trong 45 phút đ  ố ở ể

l ng virusắ

­ Bước 3: Đ  b  d ch n i và hòa tan c n l ng b ng 200 µl dung d ch Tris/EDTA ổ ỏ ị ổ ặ ắ ằ ị (10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)

­ Bước 4: Thêm 10 µl dung d ch proteinase K 5 µg/µl đ  đ t n ng đ  cu i là 0,2 ị ể ạ ồ ộ ố µg/µl, tr n đ u và     56ộ ề ủ ở oC trong 1 giờ

­ Bước 5: Thêm 25 µl dung d ch SDS 10% đ  n ng đ  cu i là 1%, tr n đ u và   ị ể ồ ộ ố ộ ề ủ  37

ở oC trong 1 gi ờ

­ Bước 6: Thêm 15 µl NaCl 5M đ  đ t n ng đ  cu i cùng là 0,3 M và tr n đ uể ạ ồ ộ ố ộ ề

­ Bước 7: Thêm 300 µl dung d ch phenol đ m v i Tris/HCl, pH 8,0 và tr n đ u ị ệ ớ ộ ề (có th  b ng cách đ o l n  ng 50 l n)ể ằ ả ộ ố ầ

­ Bước 8: Ly tâm  ng   16000 g trong 5 phút và chuy n pha nố ở ể ước n i sang  ng ổ ố

m iớ

­ Bước 9: L p l i bặ ạ ước 7 và 8 thêm l n n aầ ữ

­ Bước 10: Thêm 500 µl ether tr n đ u, và ly tâm   16000 g trong 1 phútộ ề ở

­ Bước 11: Hút b  pha nỏ ước, và l p l i bặ ạ ước 10 1 l n nầ ước

­ Bước 12: m  n p  ng và đ    nhi t đ  56ở ắ ố ể ở ệ ộ oC trong 15 phút ho c đ n khi ng i ặ ế ử

th y h t mùi etherấ ế

­ Bước 13: Chia lượng m u trong  ng làm 2, và thêm lẫ ố ượng c n tuy t đ i g p ồ ệ ố ấ 2,25 l n lầ ượng m u và tr n đ u, đ    nhi t đ  phòng (22ẫ ộ ề ể ở ệ ộ oC) trong 30 phút

­ Bước 14: Ly tâm   16000 g trong 45 phút và b  nở ỏ ước n iổ

­ Bước 15:Thêm 200 µl c n 70% hòa tan nh  nhàng c n l ng và l i ly tâm   ồ ẹ ặ ắ ạ ở

16000 g trong 15 phút

­ Bước 16: B  d ch n i và làm khô c n l ng   56ỏ ị ổ ặ ắ ở oC trong 30­45 phút

­ Bước 17: Hòa tan DNA b ng 30 µl nằ ướ ấc c t RNAse vàDNAse free

­ Có th  đ  m u   4ể ể ẫ ở oC trong vài ngày ho c   ­20ặ ở oC n u mu n b o qu n lâuề ố ả ả

b Ch y PCRạ

Khi pha các h n h p ph n  ng nên theo hỗ ợ ả ứ ướng d n c a nhà s n xu t đ i v i ph nẫ ủ ả ấ ố ớ ả  

ng hot start PCR

ứ

Trình t  c p m i (primer) dùng đ  phát hi n virus D ch t  v t  ự ặ ồ ể ệ ị ả ị

Primer 1    5'­GAA­GGC­GGG­TAT­GTA­ATG­TA­3' 

(ti n)ế  

10TCN 815­2006 Primer 2   5'­CAA­GGC­TCT­ATT­CGG­TAA­TG­3' 

(lùi) 

Chu trình nhân gien

1 vòng    94°C ­ 2 phút       37°C ­ 1 phút

35 vòng  94°C ­ 1 phút       55°C ­ 1 phút       72°C ­ 3 phút 

1 vòng    72°C for 7 phút

      Gi    4ữ ở oC đ n khi ch y đi n diế ạ ệ

Ch y đi n di s n ph m PCR ạ ệ ả ẩ

­ Pha th ch Agar 1% b ng dung d ch đ m TAE, đun cho tan đ u, khi đã ngu i, đạ ằ ị ệ ề ộ ổ  vào khuôn đi n di (có lệ ược)

­ Khi th ch đã đông, đ  vào trong bu ng đi n di có đ m TAEạ ể ồ ệ ệ

­ Các s n ph m PCR đả ẩ ược pha v i dung d ch loading v i t  l  1/10 và nh  vào ớ ị ớ ỷ ệ ỏ các gi ng trên mi ng th ch Agar (10 µl/m u)ế ế ạ ẫ

­ Ch y đi n di trong 1 gi    nhi t đ  120 v, sau đó nhuôm th ch v i ethidium ạ ệ ờ ở ệ ộ ạ ớ bromide trong 20 phút. R a b  thu c nhu m b ng cách ngâm trong nử ỏ ố ộ ằ ướ ấc c t 45  phút và đ c k t qu  b ng ánh sáng UV, ch p  nh.ọ ế ả ằ ụ ả

c. Đ c k t qu :ọ ế ả

­ M u đ i ch ng dẫ ố ứ ương và các m u dẫ ương tính có v ch v i kích c  446 bpạ ớ ỡ

­ M u đ i ch ng âm và các m u âm tính không có v ch.ẫ ố ứ ẫ ạ

5.3.2. Phat hiên khang thê:́ ̣ ́ ̉

  S  dung phử ̣ ương phap trung hoa (SN – Serum Nertralization) đê phat hiên khang thê:́ ̀ ̉ ́ ̣ ́ ̉  

Phương phap nay đ́ ̀ ược th c hiên trên tr ng vit co phôi, hoăc trên tê bao DEFự ̣ ứ ̣ ́ ̣ ́ ̀

Mâu: la huyêt thanh v t nghi m c b nh.̃ ̀ ́ ị ắ ệ

5.3.2.1. Trên tr ng vit co phôiứ ̣ ́ : 10­14 ngay tuôi. ̀ ̉

­ Chuân bi:̉ ̣

+ X  ly mâu huyêt thanh   56ử ́ ̃ ́ ở oC /30p

+ Pha loang mâu huyêt thanh theo c  sô 2   10 nông đô (1/5, 1/10, 1/2560).̃ ̃ ́ ơ ́ ở ̀ ̣

+ Pha loang virus DTV liêu 100 EID̃ ̀ 50

­ Tiên hanh:́ ̀

+ Trôn virus DTV va huyêt thanh kiêm tra đa chuân bi   trên  theo ty lê 1:1̣ ̀ ́ ̉ ̃ ̉ ̣ ở ̉ ̣

+   hôn h p khang nguyên – khang thê   tu âm 37Ủ ̃ ợ ́ ́ ̉ ở ̉ ́ oC/1h 

+ Tiêm hôn h p trên vao xoang niêu mô phôi tr ng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nông đô.̃ ợ ̀ ̣ ứ ̀ ̣ + Tr ng đứ ược âp tiêp   37́ ́ ở oC trong 14 ngay. ̀

+ Soi tr ng. Loai bo nh ng phôi chêt trứ ̣ ̉ ữ ́ ươc 24h. ́

­ Đanh gia kêt qua:́ ́ ́ ̉

+ Phôi chêt xay ra trong 4­10 ngay v i bênh tich coi coc, xuât huyêt lan rông.́ ̉ ̀ ớ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ́ ̣

+ Tinh toan chi sô trung hoa NI va hiêu gia trung hoa theo công th c cua Reed vá ́ ̉ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̀ ứ ̉ ̀  Muench 

5.3.2.2. Trên tê bao x  phôi vit DEF:́ ̀ ơ ̣

­ Chuân bi:̉ ̣

+ Lam va pha loang tê bao DEF v i sô l̀ ̀ ̃ ́ ̀ ớ ́ư ng cân thiêt (4x10ợ ̀ ́ 5 tê bao/ml).́ ̀

+ X  ly mâu huyêt thanh   56ử ́ ̃ ́ ở oC /30p

+ Pha loang virus DTV chuân liêu 100 TCID̃ ̉ ̀ 50(50% Tissue culture infective dose)

­ Tiên hanh: Trên đia nuôi cây 96 lô.́ ̀ ̃ ́ ̃

+ Cho môi trương nuôi cây MEM:  50µl/lô vao cac lô cua đia. ̀ ́ ̃ ̀ ́ ̃ ̉ ̃

+ Cho mâu huyêt thanh kiêm tra:  50µl vao lô đâu tiên, côt 1. ̃ ́ ̉ ̀ ̃ ̀ ̣

+ Pha loang mâu huyêt thanh theo c  sô 2 (1/2, 1/4, ) t  côt 1­12.̃ ̃ ́ ơ ́ ừ ̣

+ Cho virus DTV chuân liêu 100 TCID̉ ̀ 50 : 50µl/lô.̃

+   đia nuôi cây   tu âm COỦ ̃ ́ ở ̉ ́ 2   37ở oC/1h 

+ Đô bo hôn h p trên, cho môi tr̉ ̉ ̃ ợ ương MEM (không bô sung FCS) 100µl/lô.̀ ̉ ̃

+   tiêp đia nuôi cây   tu âm COỦ ́ ̃ ́ ở ̉ ́ 2   37ở oC trong 5­7 ngay. ̀

­ Đanh gia kêt qua:́ ́ ́ ̉

+ Kiêm tra bênh ly tê bao (CPE) trong 3­7 ngay. Tê bao  co biêu hiên to tron va tu laỉ ̣ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ̣ ̣  

t ng đam, th i gian lâu co hiên từ ́ ờ ́ ̣ ượng tê bao bi hoai t ́ ̀ ̣ ̣ ử

+ Tinh toan chi sô trung hoa NI va hiêu gia trung hoa theo công th c cua Reed vá ́ ̉ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̀ ứ ̉ ̀  Muench

6. Kêt luâń ̣ :

­ Nêu kêt qua phân lâp và giam đinh (b ng ph́ ́ ̉ ̣ ́ ̣ ằ ương pháp trung hòa VN) dương tinh́  

v i khang huyêt thanh chuân, kêt luân co virus D ch t  v t.ớ ́ ́ ̉ ́ ̣ ́ ị ả ị

­ Nêu kêt qua PCR d́ ́ ̉ ương tinh, kêt luân d́ ́ ̣ ương tinh virus D ch t  v t.́ ị ả ị

­ Nêu th y c m ch a tiêm phong, phat hiên co khang thê D ch t  v t (b ng ph́ ủ ầ ư ̀ ́ ̣ ́ ́ ̉ ị ả ị ằ ươ  ng pháp trung hòa SN), kêt luân thu  c m đa nhiêm virus D ch t  v t.́ ̣ ỷ ầ ̃ ̃ ị ả ị

­ Nêu kêt qua phân lâp âm tinh, PCR âm tinh, kêt luân âm tinh virus D ch t  v t.́ ́ ̉ ̣ ́ ́ ́ ̣ ́ ị ả ị

7. Tài li u tham kh oệ ả

1. Manual of standards for diagnosis tests and vaccines (OIE)

2. Manual of standards for diagnosis tests (Thailand)

       KT. B  TRỘ ƯỞNG

       TH  TRỨ ƯỞNG