Khoa luan tot nghiep

Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố và hai yếu tố với ba lần lặp lại bao gồm thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattley

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA

LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO

ẢNH HƯỞNG CỦA BA, NAA VÀ DỊCH CHIẾT ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA

LAN CATTLEYA (Cattleya sp.) IN VITRO

Tác giả

NGUYỄN CAO KIỆT

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng

kỹ sư ngành Nông học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

ThS Nguyễn Thị Thanh Duyên

Tp Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính khắc ghi công ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và dạy

dỗ con nên người, anh chị em và những người thân trong gia đình đã hết lòng yêu thương, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con có được ngày hôm nay.

Em xin trân trọng cảm ơn cô Nguyễn Thị Thanh Duyên – khoa Nông học trường

Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho

em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

Xin chân thành cảm ơn:

suốt quá trình học tập.

Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học tập tại trường.

trong thời gian thực hiện đề tài.

thời gian tiến hành khóa luận.

Xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, tháng 3 năm 2016 Sinh viên

Nguyễn Cao Kiệt

TÓM TẮT

Đề tài “Ảnh hưởng của BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của

lan Cattleya (Cattleya sp.) in vitro” đã được tiến hành tại bộ môn Di truyền – Giống,

khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh từ tháng 10/2015 đến tháng 3/2016 Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố

và hai yếu tố với ba lần lặp lại bao gồm thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya, thí nghiệm khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt, nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya và thí nghiệm khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya nhằm mục tiêu nhân nhanh số lượng chồi,

kích thích sự ra rễ của giống Cattleya sp in vitro Kết quả thu được như sau:

Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường

30 g/l có bổ sung (0,1 mg NAA + 4 mg BA)/lít thích hợp cho việc nhân chồi lan Cattleya nhất Kết quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (19,03 chồi ở giai đoạn

90 NSC).

Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường

30 g/l có bổ sung 20% nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng lan Cattleya nhất Kết

quả cho thấy số chồi hình thành nhiều nhất (14,06 chồi ở giai đoạn 90 NSC), khối lượng lớn nhất (0,77 g ở giai đoạn 90 NSC).

Xác định được môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường

30 g/l có bổ sung 5 mg NAA trên lít thích hợp nhất cho sự hình thành rễ lan Cattleya Kết quả cho thấy số rễ hình thành nhiều nhất (3,27 rễ/cây ở giai đoạn 80 NSC)

3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến khả

Bảng 3.1a Ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi giai

cụm chồi giai đoạn 90 NSC37

Bảng 3.4a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

giai đoạn 10 – 40 NSC (cm) 38

Bảng 3.4b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

giai đoạn 50 – 90 NSC (cm) 40

Bảng 3.5a Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

10 – 60 NSC (chồi)42

Bảng 3.5b Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

giai đoạn 70 – 90 NSC (chồi)44

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa đến

đường kính (cm) và khối lượng (g) cụm chồi giai đoạn 90 NSC45

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của Cattleya giai đoạn

Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN15

Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương

tế bào18

Hình 1.4 Mẫu cụm chồi lan Cattleya được sử dụng trong thí nghiệm

55

Hình 1.5 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 1 giai đoạn 90 NSC55

Hình 1.6 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 2 giai đoạn 90 NSC56

Hình 1.7 Các nghiệm thức ở thí nghiệm 3 giai đoạn 80 NSC56

Hình 1.8 Cân trọng lượng cụm chồi tươi57

Hình 1.9 Đo đường kính cụm chồi57

GIỚI THIỆU

Đặt vấn đề

Ngày nay, khi đời sống được nâng cao thì hoa là một nhu cầu không thể thiếu của con người Với hương thơm, màu sắc và ý nghĩa riêng của mình, mỗi loài hoa góp phần làm đẹp thiên nhiên, làm đẹp cho cuộc sống và là biểu tượng cho cái đẹp, hạnh phúc và sức sống cho con người Trong muôn ngàn loài hoa, hiếm có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp nhiều họ, nhiều chủng loại, màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ bằng hoa lan Hoa lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng mà còn ấm áp, gần gũi và chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, mới lạ, hấp dẫn Đặc biệt, lan Cattleya rất được

ưa thích về màu sắc, kiểu dáng trang nhã nhưng cũng không kém phần kiêu sa Chính vì vậy, việc trồng lan Cattleya không chỉ dừng lại ở quy mô gia đình mà đã nhanh chóng được mở rộng và trở thành lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ Trong

đó, Việt Nam cũng là một nước có nhiều tiềm năng trở thành một nước sản xuất hoa phong lan lớn trong khu vực, có khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm giá thể tốt cho cây lan sinh trưởng

Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu hoa trong nước cũng như xuất khẩu đòi hỏi phải có một số lượng lớn cây giống đồng đều trong khi Cattleya lại là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện nhân vô tính tự nhiên Do đó việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân giống tối ưu cho lan Cattleya là hết sức cần thiết.

Trong các phương pháp nhân giống lan Cattleya hiện nay thì nuôi cấy mô là phương pháp thích hợp để nhân nhanh giống lan trong một thời gian ngắn, tạo ra các dòng cây con đồng nhất, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền nhưng không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết Phương pháp này có thể tạo ra số lượng hoa lan lớn mà vẫn đáp ứng được yêu cầu ngày càng khắt khe hơn của người chơi hoa lan về màu sắc, kiểu dáng

phải mới lạ, độc đáo, cây sinh trưởng phát triển tốt, khả năng thích ứng với môi trường cao, ít nhiễm sâu bệnh, hoa tươi lâu, có độ bền, đẹp về màu sắc.

Hiện nay, có rất nhiều chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô Đặc biệt, các chất BA, NAA và dịch chiết là các chất phổ biến trên thị trường bởi vì tính không độc, an toàn với môi trường, dễ tìm, giá cả hợp lý và tác động nhanh đến quá trình nhân chồi, tạo rễ.

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Ảnh hưởng của các chất điều hòa

sinh trưởng BA, NAA và dịch chiết đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya (Cattleya

sp.) in vitro” được tiến hành.

Mục tiêu – Yêu cầu

Mục tiêu

- Xác định liều lượng của BA và NAA thích hợp để nhân chồi lan Cattleya.

- Xác định liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa thích hợp cho sự sinh trưởng chồi lan Cattleya.

- Xác định liều lượng NAA thích hợp cho sự tạo rễ lan Cattleya.

Yêu cầu

- Tìm hiểu và đánh giá sự tác động của các chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA

và một số dịch chiết đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya.

- Theo dõi sự sinh trưởng của lan Cattleya thông qua chỉ tiêu số chồi, chiều cao

của chồi và chiều dài rễ, số rễ.

- Đánh giá ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ lan Cattleya.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Nguyễn Đức Lượng (2006), lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật gắn liền với các sự kiện nổi bật như sau:

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết về tính toàn năng của

tế bào vào thực nghiệm Theo ông, tất cả tế bào thực vật đều có tính toàn năng, mỗi tế bào đều mang một lượng thông tin di truyền đầy đủ của cơ thể và khi gặp điều kiện thuận lợi thì có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Tuy nhiên, ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công.

Năm 1922, Kotte và Robbins thực hiện lại thí nghiệm của Haberlandt và đã thành công trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng từ đầu rễ một cây hòa thảo.

Năm 1934, White (Hoa Kỳ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu

rễ cây cà chua trên môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường và dịch chiết nấm men Ở các thí nghiệm tiếp theo, White chứng minh có thể thay thế dịch chiết nấm men

Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành ở nhiều cây khác nhau

Sau đó ít lâu, Went và Thimann phát hiện ra chất điều hòa sinh trưởng đầu tiên là IAA (Indol acetic acid).

Năm 1939, cùng với Nobercourt, Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng trong thời gian dài của mô sẹo cà rốt (Daucus carota) trên môi trường rắn bằng thạch.

Năm 1941, Overbeck (Hoa Kỳ), chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi họ cà (Datura).

Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng nhân tạo đã được nghiên cứu và tổng hợp thành công, như Napthyl acetic acid (NAA), 2,4 Dichlorphenoxy acetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4D đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy.

Năm 1955, Skoog và tìm ra chất điều hòa sinh trưởng trong tinh dịch cá bẹ là Furfurylaminopurine và đặt tên là Kinetin, có tác dụng kích thích sự phân bào.

6-Việc phát hiện vai trò của NAA, IAA, 2,4D và Kinetin cùng với phát hiện vai trò của các vitamin và nước dừa là một bước tiến quan trọng, đây là tiền đề kỹ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hoá học, cho việc làm các thí nghiệm ổn định và dẫn đến những thành công tiếp theo của ngành khoa học này.

Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ

lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ Ngược lại thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tượng này được xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào sự điều khiển sinh trưởng, phát triển của mô tế bào trong nuôi cấy

Từ 1954 đến 1959, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển Muir, Hildebrandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành các tế bào đơn bằng cách sử dụng máy lắc.

Năm 1960, Bergman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được hầu hết là tế bào đơn mà không phải là dính cụm Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục phân chia và tái tạo lại mô sẹo Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của

Bergman, nhiều tác giả khác đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào, chứng minh được tính toàn thế của tế bào.

Năm 1960, Cooking (Anh) công bố có thể dùng men cellulose để phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật, kết quả thu được các tế bào tròn, không vỏ bọc, gọi là protoplast.

Đầu những năm 1970, Nagata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho các protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia, tạo nên một quần thể

tế bào trong môi trường lỏng.

Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định

và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí từ các cơ quan tử từ bên ngoài Các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả hơn.

Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng về vấn đề biến tính của tế bào Ông cho rằng các tế bào có khả năng hấp thụ DNA ngoại lai vào, gây nên sự biến tính ở thực vật.

Từ 1980 đến 1992, có nhiều các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố, hàng loạt các công trình chuyển gene ngoại lai vào nhiều họ thực vật.

Khả năng nhân giống và phục tráng cây trồng được thể hiện rõ rệt trong những ứng dụng của nuôi cấy mô thực vật Morel (1960), đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các

loài địa lan (Cymbidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm Khi chia cắt các

protocorm và nuôi cấy tiếp thì thu được các protocorm mới Khi để trong các điều kiện thích hợp nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con Do đó, có thể phục tráng, tạo ra các dòng vô tính không bị nhiễm virus Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với các cây như: khoai tây, cây ăn quả và nhiều cây nhân giống vô tính khác.

Hiện nay, đang bước vào giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng và phát triển mạnh mẽ trong việc nhân giống, chọn tạo giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp

có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Nuôi cấy mô

thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

1.1.2 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam

Theo Trần Văn Minh (2005), sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu chú trọng đến

kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật

Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do Lê Thị Muội khởi xướng Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong điều kiện Việt Nam, như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo và protoplast Và đã thành công khi nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv, 1978; Lê Thị Xuân và ctv, 1978) Tiếp đó là thành công nuôi cấy protoplast khoai tây (Lê Thị Muội và Nguyễn Đức Thành, 1978; Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội, 1980, 1981) Phòng thí nghiệm tiếp theo được đặt tại phân viện Khoa Học Việt Nam ở TP Hồ Chí Minh, sau đó là Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam, chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Đến nay, đã có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các Viện nghiên cứu (Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Quả Trung ương, các trường Đại học), mà có cả ở một số tỉnh và cơ sở sản xuất (Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, Thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh).

Từ giữa 1980 đến nay, hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh Những kết quả đáng khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây (Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Lâm Nghiệp) Một số kết quả bước đầu đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv, 1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv, 1994) Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn để tạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Di Truyền Giống Nông Nghiệp Nuôi cấy các cây dược liệu quí để bảo tồn nguồn gen và tạo các dòng tế bào có hàm lượng sinh học quan trọng cũng đã và đang được phát triển (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và ctv, 1995; Bùi Bá Bổng, 1995).

Không dừng lại ở đó, các công trình nghiên cứu ngày càng đạt được những bước tiến vượt bậc Cụ thể:

- Tại Viện sinh học Nhiệt đới, từ đầu những năm 2000, đã tập trung vào công nghệ nuôi cấy mô các cây công nghiệp như cà phê, hồ tiêu và nhóm cây lâm nghiệp thân gỗ như Paulownia, dó bầu, Neem Hoàn chỉnh công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, tạo các giống cây trồng nông lâm nghiệp sạch bệnh Nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi cấy invitro, biorector cho các cây có giá trị như cây thuốc, cây lấy dầu, hoa lan, cây cảnh Lần đầu tiên trong nước, các nhà nghiên cứu đã nuôi cấy thành công mô

phôi vô tính (soma), mô chồi sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong

môi trường lỏng tạo điều kiện rất thuận lợi cho việc nhân sinh khối quy mô lớn tạo sản phẩm có khả năng thương mại hóa Tạo và nuôi nhân rễ bất định sâm Ngọc Linh và bước đầu ghi nhận được sự hình thành rễ tơ (hairy root) sâm Ngọc Linh nhờ vi khuẩn

Agrobacterium rhizogenes, tạo điều kiện cho việc nuôi nhân quy mô lớn sinh khối nhằm

thu hoạt chất phục vụ ngành mỹ phẩm và y dược Tạo thành công mô sẹo/rễ bất định hai cây dược liệu quý là Xạ đen và Tam thất nhằm nhân nhanh sinh khối phục vụ sản xuất

hợp chất thứ cấp Đã nhân giống thành công giống lan đặc hữu Việt Nam (Dendrobium

farinatum Schildh et Schraut) (Bích Diệp, 2014).

- Các công trình nghiên cứu tại Lâm Đồng đạt được nhiều thành tựu: Dương Tấn Nhựt thu được nhiều kết quả trong nuôi cấy các loài hoa cúc, lyli, salem, hồng môn, hoa hồng,… và đặc biệt ứng dụng hệ chiếu sáng đơn sắc của công nghệ đèn LED vào luận án tại Đại học Kagawa, Nhật Bản (2002) Mới đây tác giả đã đạt được nhiều kết quả

mới về công nghệ sinh khối sâm K5 Panax vietnamensis, thông đỏ

Taxus wallichiana, công nghệ phôi vô tính các loài Hồ điệp

(Phalaenopsis spp.),… mở ra hướng công nghệ tạo giống chủ động và

sinh khối chất lượng cao với những công trình phong phú cùng những

đề tài tiềm năng lớn; Nguyễn Văn Kết và ctv triển khai khá thành công

nuôi cấy các loài lan rừng Cát Tiên - Lâm Đồng - Đồng Nai, và đặc biệt

là đưa từng bước công nghệ nuôi cấy mô hiện đại với các hệ thống Bioreactor vào thực tiễn nhân giống, xuất phát từ luận án tiến sĩ tại Đại học Chungbuk, Hàn Quốc (2005); Phạm Xuân Tùng đã phát triển công nghệ tạo giống khoai tây kết hợp nuôi cấy in vitro (củ bi và siêu

bi - microtuber) với công nghệ gieo hạt Hiện nay tác giả cùng các cộng sự tiếp tục triển khai kết quả công nghệ lai tạo và chọn lọc các dòng hoa quý: cúc, đồng tiền, cẩm chướng… có giá trị thương mại cao (Lê Xuân Thám, n.d.).

1.1.3 Lợi ích của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

Tạo ra các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ.

Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn Tạo ra các cây con sạch bệnh.

Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất.

Việc trao đổi giống quốc tế các nguồn gen sạch bệnh nuôi trong ống nghiệm được thực hiện dễ dàng.

Thông qua nuôi cấy mô có thể ứng dụng việc chuyển gen cho những thực vật bậc cao để chọn tạo giống mới theo yêu cầu sản xuất (Bùi Bá Bổng, 1995).

1.1.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2002), nuôi cấy mô thực vật có một số phương pháp như sau:

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên

Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Sau một thời gian, từ đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển, vươn thân, ra lá, rễ, để trở thành một cây hoàn chỉnh

Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có bổ sung auxin Trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo

mô sẹo, khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ, từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn.

Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường lỏng và đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp, sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ, gọi là tế bào đơn Sau đó, tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường thích hợp để phát triển, tăng sinh khối.

Nuôi cấy protoplast

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn tách lớp vỏ cellulose, trong điều kiện nuôi cấy thích hợp protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và phát triển thành cây hoàn chỉnh Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng.

Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo.

Mô sẹo này được phát triển thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội.

1.1.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong đời sống thực vật, ngoài các chất dinh dưỡng như glucid, protein, lipid, cây còn nhiều chất hoạt tính sinh lý như các vitamine, enzyme, các chất điều hòa sinh trưởng (phytohormon) Trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật, các phytphormon rất quan trọng trong quá trình thay đổi các đặc trưng hình thái sinh lý của cây trồng, đặc biệt là trong tạo mô sẹo và hình thành cây hoàn chỉnh (Lê Văn Tri, 1997) Một số đặc tính và cơ chế tác dụng của nhóm chất như auxin, cytokinin.

1.1.5.1 Auxin

nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là indol acetic acid (IAA) IAA có dẫn xuất là naphthalene acetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) NAA được Went và Thimann phát hiện năm 1937 và là một auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA Trong cây IAA tập trung nhiều trong các mô non (chồi, lá đang phát triển), trong hạt, trong hạt nảy mầm (Trịnh Xuân Vũ và ctv, 1976).

1-Tác động sinh lý của auxin

Auxin có vai trò điều hòa quan trọng trong việc kìm hãm sự phát triển của chồi bên (duy trì hiện tượng ưu thế ngọn).

Auxin gây tính hướng động của cây (hướng quang và hướng địa).

Auxin kích thích quá trình tăng trưởng nhờ tác dụng kéo giãn tế bào Sự kéo tế bào diễn ra đồng thời trên hai trục (trục ngang và trục dọc) Nhờ vào tác dụng này mà auxin giúp tăng diện tích lá, tăng đường kính và chiều dài cành, thân, rễ; làm củ, quả phình to ra.

Auxin kích thích sự tăng trưởng của quả, ngăn ngừa hiện tượng rụng lá, quả, kích thích sự ra rễ (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

Ứng dụng

Auxin kích thích sự ra rễ đặc biệt là rễ bất định trên cành giâm, cành chiết và trên

mô nuôi cấy Trong nuôi cấy mô, auxin (IBA, NAA) cũng có tác dụng tạo rễ tốt.

Để tăng đậu quả, tăng sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt, người ta xử lý auxin dưới dạng NAA 20 ppm, 2,4-dichlorophenoxyl acetic acid (2,4-D) 10 ppm cho một số cây trồng như cà chua, cam, chanh.

Để kéo dài sự chín của quả và dùng bảo quản quả lâu, sử dụng dung dịch NAA (10 – 20 ppm) (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

Vai trò sinh học và ứng dụng

Trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt của auxin là rất cần thiết

để kích thích sự phân bào, nhưng giai đoạn sau phôi phải được nuôi cấy trên môi trường

có cytokinin để biệt hóa chồi (Vũ Văn Vụ, 1999) Cytokinin cùng auxin điều tiết chu trình tế bào, kích thích sự phân chia tế bào một cách mạnh mẽ Nếu auxin/cytokinin >1: kích thích ra rễ; auxin/cytokinin <1: kích thích hình thành chồi; auxin/cytokinin =1: kích thích hình thành mô sẹo (Nguyễn Văn Uyển và ctv, 1993).

Cytokinin kích thích sự phát triển mầm hoa.

Cytokinin cảm ứng hình thành chồi cây từ mô sẹo nuôi cấy, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan và loại bỏ ưu thế ngọn cũng như hạn chế sự phát triển của rễ.

Cytokinin được sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy mô thực vật: TDZ (Thiazuron),

BA (6- Benzylaminopurine), kinetin (6- Furfuryl amino purine) và cytokinin tự nhiên trong nước dừa được ứng dụng rộng rãi trong môi trường tạo chồi in vitro (Nguyễn Văn Uyển, 1989).

1.1.6 Dịch chiết sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Dịch chiết hữu cơ có thể kích thích có hiệu quả qua việc cung cấp các thành phần dinh dưỡng acid hữu cơ không xác định và các thành phần có tác dụng như chất kích thích sinh trưởng (Trần Văn Minh, 2005).

Các nghiên cứu của Pierik và ctv (1988), Li và ctv (2001), Chyuam và ctv (2010), Songjun và ctv (2012, 2013) đều cho thấy, khi bổ sung các hợp chất hữu cơ vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ tái sinh cây, hệ số nhân chồi của một số loài lan hài cao hơn hẳn môi trường không bổ sung các chất này Các hợp chất hữu cơ được dùng phổ biến trong nuôi cấy in vitro như nước dừa, dịch chiết chuối, cà rốt, khoai tây, peptone và triptone, đây là những nhân tố đóng vai trò không kém phần quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Cúc và ctv, 2013).

1.1.6.3 Nước dừa

Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng cytokinin được tìm thấy trong nước dừa Bên cạnh đó trong nước dừa có chứa acid lauric, dồi dào vitamin, khoáng chất và chất dinh dưỡng, ít đường và Natri nhưng lại

có nhiều kali, canxi và chloride (Hoa Phạm, 2015).

Nước dừa giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật khó nuôi cấy (Trần Văn Minh, 2005).

1.1.7 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường dùng trong thí nghiệm là môi trường nền MS (Murashige và Skoog, 1962).

Môi trường nền MS là một trong những loại môi trường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, đặc biệt ở những môi trường tái sinh.

Môi trường nền MS là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy Môi trường nền MS là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng (Trần Văn Minh, 2005).

Môi trường cơ bản MS gồm các thành phần như sau:

Các nguyên tố đa lượng (mg/l)

Pyridoxine HCl 0,5

1.2 Một số hình ảnh về hoa Cattleya

Hình 1.1 Một số hình ảnh lan Cattleya

(Nguồn: Những bức ảnh Đẹp Nhất Thế Giới về Lan Cattleya – The

World’s Best Photos Of Cattleya, 2012)

1.3 Giới thiệu về lan Cattleya

Hình 1.2 Loại lan Cattleya dùng trong TN

(Nguồn: Guilherme Corigliano, 2012)

Guilherme Corigliano

Năm 1818, William Cattley, một nhà chuyên nghiên cứu thực vật nhiệt đới người Anh, lúc bấy giờ đang làm việc ở Barnett, nhận được một kiện hàng toàn các loại thực vật được gởi về nước từ Brazil Tác giả thấy một loại cây có lá lạ dùng để bọc và chèn

các cây cỏ trong kiện hàng Tác giả đem trồng các cây lạ đó trong vườn ươm Đến tháng

11 cùng năm, các cây lạ đó trổ hoa Những đoá hoa đã gây sửng sốt cho giới quý tộc Anh vì vẻ đẹp rực rỡ, mê hồn cùng mùi hương thật quyến rũ Rất nhanh chóng người ta

đã đặt cho chúng cái tên nữ hoàng của các loài hoa – The Queen of Flowers.

Đến năm 1821, John Lindley, một nhà phân loại thực vật được William Cattley nhận vào làm việc để thay thế Sir Joseph Banks, đã qua đời, tiếp tục công trình nghiên cứu mô tả và phân loại thực vật trong bộ sưu tập của Cattley; và Lindley đã lấy tên của

Cattley đặt cho cây nữ hoàng của các loài hoa là Cattleya labiata (labiata tiếng Latin có

nghĩa là Cánh môi hoa tuyệt diệu) để vinh danh người đầu tiên ở châu Âu trồng Cattleya

ra hoa (trích dẫn bởi Hà Thị Tuyết Phượng, 2008).

1.3.3 Đặc điểm thực vật học và phân loại

Theo Huỳnh Văn Thới (1996), cũng giống như Dendrobium, Cattleya là cây đa

thân, có giả hành mập và lùn hơn, phát triển theo chiều ngang Lúc còn non có bẹ màu xanh bọc lại, lúc lớn các bẹ khô lại và rụng đi Thường trên đỉnh giả hành có một hoặc hai lá to, chính giữa có một lưỡi mèo bao lấy phát hoa, phát hoa vượt lên và xuyên qua lưỡi mèo để trổ hoa Mỗi hoa có ba lá đài hình thuôn, hai cánh ở hai bên, to hơn đài Cánh thứ ba biến thành môi xòe rộng màu sắc rất đẹp, có khi nhăn nheo, giữa có trụ nhụy khá cao với bốn phấn khối hình dĩa màu vàng

Cattleya được phân ra hai nhóm:

- Nhóm 1 lá: giả hành chỉ có một lá và chỉ ra có một, hai hoa rất to, rất đẹp.

- Nhóm 2 lá: mỗi giả hành có hai lá, có hoa chùm năm, bảy hoa nhưng hoa nhỏ hơn.

1.3.4 Yêu cầu sinh thái

Theo Huỳnh Văn Thới (1996), lan Cattleya thích hợp với điều kiện sinh thái như

sau:

tốt.

Ẩm độ: ẩm độ thích hợp cho lan phát triển dao động trong khoảng từ 40 – 70%,

vì vậy mỗi ngày nên tưới nước 2 lần, trừ những ngày mưa Giả hành Cattleya mập, có

khả năng giữ nước tốt, do đó nếu tưới quá ẩm sẽ làm thối đọt non Ở Đà Lạt có nhiều sương mù nên mỗi ngày chỉ cần tưới một lần, cây lan vẫn tươi tốt, ra hoa to, màu sắc tươi đẹp và lâu tàn.

Với điều kiện thời tiết ở thành phố Hồ Chí Minh nên làm giàn che nắng 50%, nếu ở sân thượng phải che 60% và nên treo chậu hơi sát vào nhau để cản bớt gió Cây lan Cattleya khi thấy lá bị cháy hay vàng là hiện tượng dư nắng, cây lùn, mập và cứng cáp Thiếu nắng, cây ốm yếu, lá màu xanh đậm, dễ gãy, khó ra hoa và có ra hoa thì hoa

mềm hay gục xuống Cattleya có lá màu xanh lợt hoặc ửng vàng là cây có đủ nắng, đủ nước, mập mạp, dễ ra hoa, hoa to, màu sắc đẹp, cứng cáp, không lắc lư và ra hoa quanh năm.

1.3.5 Kỹ thuật chăm sóc

Về phân bón: phun lên lá, lên thân, lên rễ và có bình phun sương vào sáng sớm hoặc chiều mát Sử dụng phân hỗn hợp N – P – K tùy thuộc vào giai đoạn của cây Lan con với công thức 30 – 10 – 10 cộng thêm vi lượng Đối với cây lan trưởng thành sử dụng công thức 10 – 30 – 10 cộng phân vi lượng, lan có lưỡi mèo thì tưới theo công thức 10 – 10 – 30 cộng vi lượng Không nên tưới lên hoa kể cả nước, vì tưới trực tiếp lên hoa làm cho hoa sẽ mau tàn Không tưới lên đầu giả hành non lúc lá còn đang ở dạng hình phễu Tưới như vậy, nước sẽ đọng lại trong phễu làm thối lá và lưỡi mèo Khi

cây Cattleya mới ra chồi non, tưới phân cân đối giữa các hàm lượng N – P – K (10 – 30

– 10) thì đảm bảo 3 tháng sau sẽ ra hoa và khi hoa tàn thì tưới trở lại theo công thức 30 – 10 – 10 cộng vi lượng.

Có thể dùng phân hữu cơ như bánh dầu sẽ cho kết quả tốt kết hợp thuốc sát trùng

vì phân hữu cơ có thể có nhiều vi khuẩn.

Thay chậu: muốn thay chậu thì ngâm giò lan vào xô nước có pha thuốc trừ nấm Đợi 15 phút sau lấy ra, gỡ nhẹ bộ rễ, dùng kéo bén cắt ra mỗi đơn vị 3 giả hành trở lên, trong đó có một hướng có cây con Cắt bỏ hết rễ hư thối và trồng lại vào chậu mới, cột

vô cây ti cho chặt, tưới phun thuốc kích thích ra rễ rồi để vào chỗ râm mát, chờ khi nào cây lan ra rễ mới để giá thể vào Nhớ phải thật thoáng, có thể gác hai cây nẹp tre ngay giữa chậu.

Cũng có thể cắt trước rồi để yên trong chậu, khi thấy cây ra chồi mới, ra rễ mạnh thì chiết ra trồng (Huỳnh Văn Thới, 1996).

1.4 Sơ đồ quy trình nhân giống hoa lan in vitro

Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào trải qua các giai đoạn:

Giai đoạn chọn mẫu lan

Khử trùng mẫu cấy

Nhân giống lan (Nhân nhanh)

Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro (tạo rễ)

Chuyển cây ra vườn ươm

Hình 1.3 Quy trình kỹ thuật cơ bản nhân giống hoa lan bằng phương

pháp NCM tế bào

(Nguồn: Kỹ thuật nhân giống lan căn bản và nâng cao, 2012)

Theo đó, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, nội dung hướng đến hai giai đoạn bao gồm:

- Nhân giống lan (nhân nhanh) nhằm mục tiêu tạo chồi, nhân nhanh số lượng cá thể, đồng đều về sinh trưởng.

- Tạo cây hoàn chỉnh nhằm tạo rễ chuẩn bị cho quá trình ra vườn ươm sau này.

1.5 Một số kết quả nghiên cứu về nuôi cấy mô phong lan

1.5.1 Thế giới

Theo Ricardo Tadeu de Faria và ctv (2002) khi nghiên về lan

Cattleya walkeriana Gardner Brazil in vitro ở môi trường ½ MS có kết

hợp than hoạt tính ở các mức 1 mg/l , 2 mg/l, 4 mg/l, 6 mg/l cho thấy bổ sung 2 mg than hoạt tính/lít giúp mẫu ít bị hóa nâu, có lợi trong quá trình cấy chuyền.

Khi nghiên cứu nảy mầm và phát triển trong ống nghiệm của

Cattleya bicolor Lindley (Orchidaceae) cho thấy Vacin & Went là môi

trường nuôi cấy lý tưởng cho hạt nảy mầm và phát triển cây giống

ban đầu của Cattleya bicolor Lindley trong ống nghiệm (Rogério

Mamoru Suzuki và ctv, 2010).

Kết quả của Yaser Hassan Dewir và ctv (2014) khi nghiên cứu vi nhân giống Cattleya, cải thiện quá trình tạo rễ in vitro và tạo sự thích nghi cho thấy cảm ứng tối ưu cho rễ là môi trường ½ MS kết hợp 2,4

Ngoài ra, đều là cây đa thân như Cattleya, có nhiều đặc điểm tương tự, lan Dendrobium đã có một số công trình nghiên cứu:

Kết quả nghiên cứu giống lan Dendrobium của Daneshwar Puchooa (2004) cho thấy số lượng tối đa của PLBs đã đạt được hình thành trong môi trường lỏng Murashige và Skoog (MS), dao động ở 80 rpm và có bổ sung (0,1 mg BA + 1mg NAA + 15% nước dừa)/lít; chồi tái sinh đã đạt được hình thành khi PLBs được chuyển lên môi trường

MS rắn có bổ sung (0,1 mg BA + 1 mg NAA + 15% nước dừa + 10 g

củ khoai tây)/lít, các chồi phát triển hệ rễ sau 4 tuần Chuyển vào môi trường chứa than hoạt tính để cây con phát triển.

Khi nghiên cứu về giống Dendrobium lai cho thấy trên môi

trường MS có bổ sung than hoạt tính, trọng lượng tối đa của PLBs

(5,123 g) thu được từ sự kết hợp của (1 mg BAP + 1 mg IBA)/lít ; chiều cao chồi cao nhất (3,239 cm) và số lượng tối đa của rễ cây con (4,473) thu được từ (1 mg BAP + 1 mg NAA)/lít kết hợp; các số lượng tối đa của lá (3,490) và chiều dài tối đa của lá (1,946 cm) đã thu được

từ (1 mg BAP + 1 mg IBA)/lít và chiều rộng lá cao nhất (1,166 cm) được thu thập từ (0,5 mg BAP + 1 mg IBA)/lít; các chiều dài rễ cao nhất thu được từ (0,5 mg BAP + 0,5 mg IAA)/lít và số lượng tối đa của cây con tái sinh (20) được thu được từ (0,5 mg IAA + 1 mg IBA)/lít Tuy nhiên, trọng lượng chồi tươi tối đa (0,219 g) và số lượng rễ tối đa trên cây non (6,300) là thu được từ (1 mg IAA + 1 mg IBA)/lít (H Khatun và ctv, 2010).

1.5.2 Việt Nam

Theo Hà Thị Tuyết Phượng (2005) khi nghiên cứu ứng dụng nuôi

cấy mô trong nhân giống cây lan Cattleya (Cattleya sp.) để khử trùng,

vào mẫu lan dùng Calci Hypochlorite 3% trong thời gian 15 phút cho kết quả tốt nhất Ở giai đoạn nhân chồi, tạo cây con, kích thích tố BA

có tác dụng thúc đẩy quá trình tạo chồi; có thể nhân giống lan Cattleya in vitro bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh trên môi trường MS + (20 g đường + 150 ml nước dừa + 2 mg BA+ 7g agar)/lít; cụm chồi có 10 chồi đến 15 chồi thích hợp cho quá trình vi nhân giống; lan Cattleya in vitro cũng có khả năng tạo chồi trên môi trường

MS khi nuôi cấy mô từ chồi đơn; lượng đường và hàm lượng nước dừa thích hợp cho lan Cattleya in vitro sinh trưởng tốt là (30 g đường và

200 ml nước dừa)/lít Ở giai đoạn tạo rễ, lan Cattleya có khả năng ra

rễ trong điều kiện in vitro; bổ sung NAA ở nồng độ 2 mg/l là thích hợp cho sự tạo rễ; bổ sung chuối hay tấm gạo có tác dụng thúc đẩy sự hình rễ cho cây lan Cattleya in vitro; môi trường ra rễ và tạo cây lan Cattleya in vitro hoàn chỉnh là MS + (20 g đường + 150 ml nước dừa + 2 mg NAA + 30 g chuối + 1 g than hoạt tính + 7 g agar)/lít.

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia đến lan Cattleya nuôi cấy mô (in vitro) cho thấy ở giai đoạn nhân chồi, nồng độ BA thích hợp cho khả năng ra chồi lan

Cattleya nuôi cấy mô là 2 mg/l không phụ thuộc vào điều kiện có hoặc

không có nước dừa; nồng độ Kinitine thích hợp nhất cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là 3 mg/l; chất điều hòa sinh trưởng tốt

cho khả năng ra chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là BA với nồng độ 2

mg/l có bổ sung nước dừa; nồng độ NAA thích hợp cho khả năng ra

chồi lan Cattleya nuôi cấy mô là 0,1 mg/l Ở giai đoạn tạo rễ, nồng độ NAA thích hợp nhất để kích thích ra rễ lan Cattleya nuôi cấy mô là 3 mg/l; chất phụ gia tốt để kích thích rễ lan Cattleya nuôi cấy mô là

khoai tây với liều lượng 60g/l Ở giai đoạn ra cây, giá thể thích hợp

cho lan Cattleya nuôi cấy mô trồng ngoài vườn ươm là rễ lục bình (Lưu

Thị Vân Thư, 2006).

Bên cạnh Cattleya, lan Dendrobium là loài cây cùng họ có những đặc điểm tương đồng đã có các nghiên cứu:

Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan bản địa

Dendrobium nobile lindl của Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh

(2013) cho thấy ở giai đoạn khử trùng, vào mẫu, nguyên liệu sử dụng thích hợp là quả lan 5 tháng tuổi và môi trường gieo hạt là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít Ở giai đoạn nhân protocorm, nhân chồi và tạo cây, trong nhân in vitro kinh điển, môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; nhân nhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100ml ND + 10g saccharose + 6,0g agar)/lít; trong nhân in vitro cải tiến: nuôi cấy lỏng lắc nút bông và lỏng lắc màng thoáng khí đã tăng

hệ số nhân protocorm đạt 1,9 và 2,3 lần so với nhân in vitro kinh điển; nuôi cấy đặc thoáng khí giúp giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi

cấy kinh điển; nhân nhanh cụm chồi bằng kỹ thuật bioreactor giảm ½ thời gian nhân giống; môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là RE+ (10g saccharozase + 0,5g than hoạt tính)/lít, cường độ ánh sáng 2300 lux.

Kimura et Migo (thạch hộc thiết bè) cho thấy ở giai đoạn khử trùng, vào mẫu, nhân giống bằng gieo hạt trên môi trường VW+ (10g sucrose + 6g agar + 100ml nước dừa (ND)/lít là tốt nhất Ở giai đoạn nhân chồi, tái sinh chồi và tạo cây hoàn chỉnh, nhân nhanh cụm chồi tốt nhất trên môi trường MS + (100ml ND + 20g sucrose + 6g agar + 60g chuối chín)/lít; nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy đoạn thân mang mắt

ngủ sử dụng đoạn thân in vitro mang 2 mắt ngủ và nuôi cấy trên môi

trường MS + (20g sucrose + 10% ND + 0,5 mg BA + 0,5mg α-NAA + 6g agar)/lít là tốt nhất; môi trường tốt nhất tạo cây hoàn chỉnh là RE + (10g sucrose + 6g agar + 0,3g THT + 0,5 mg α-NAA)/lít (Nguyễn Thị Sơn và ctv, 2014).

Nhìn chung, các nghiên cứu về phong lan đã được tiến hành khá nhiều Tuy nhiên, các nghiên cứu về dịch chiết ít được đề cập và cần được mở rộng phạm vi nghiên cứu.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thời gian: 10/2015 – 03/2016

Địa điểm: phòng nuôi cấy mô, bộ môn Di truyền – Giống, khoa Nông Học, trường ĐH Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

2.2 Nội dung

Thí nghiệm 1: khảo sát nồng độ BA và NAA đến khả năng nhân chồi của lan Cattleya Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và

nước dừa đến khả năng sinh trưởng của lan Cattleya

Thí nghiệm 3: khảo sát nồng độ NAA lên sự tạo rễ của lan Cattleya

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Giống

Cụm chồi và cây con lan Cattleya in vitro được lấy từ vườn lan Nam Anh.

- Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn, bồn rửa, kệ để hoá chất và dụng cụ, tủ lạnh,

tủ sấy, máy đo pH, nồi hấp vô trùng, cân điện tử, máy lắc

tránh không khí chuyển động từ bên ngoài trực tiếp đưa bụi vào Để tăng hiệu suất khi làm việc, phòng cấy phải được trang bị máy lạnh Phòng cấy đòi hỏi phải vô trùng tuyệt đối do đó phải thường xuyên khử trùng bằng formol, thuốc tím hoặc đèn UV (ultra violet).

- Tiến hành tiệt trùng bằng:

+ Dung dịch formol phun thành sương mù

+ Chiếu tia UV trong 3 – 4 giờ đủ để thao tác 2 – 3 giờ

- Trang thiết bị cần có trong phòng: bàn để tủ cấy, tủ cấy vô trùng, kệ để môi trường

đã hấp và vô trùng, đèn, đèn cồn, đèn đốt bằng gas, dao, kéo, kẹp, dĩa petri, bút viết trên dụng cụ thuỷ tinh.

• Phòng nuôi cây (phòng sáng)

- Sau khi cấy xong, cây được đưa vào phòng nuôi cây Phòng nuôi cây phải đảm bảo

- Theo chế độ chiếu sáng ta chia thành:

+ Buồng tối liên tục (nuôi tạo mô sẹo, giữ mô sẹo).

+ Buồng sáng theo chu kỳ 8 – 12 giờ/ngày.

+ Buồng sáng liên tục.

- Trang thiết bị cần có trong phòng: kệ, đèn neon, máy lạnh, dụng cụ đo ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ.

2.3.2.2 Môi trường cơ bản dùng trong thí nghiệm

Môi trường cơ bản là môi trường MS có bổ sung thêm:

Đường mía (sacharose) 30g/l Agar 8,5 g/l

Than hoạt tính 0,5 g/l Môi trường được điều chỉnh bằng NaOH và HCl để đạt pH = 5,8 và được khử

2.4 Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm đơn yếu tố và hai yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

Nhiệt độ phòng nuôi cấy là: 18 – 250 C

Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,4 – 0,5 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Yếu tố A: 3 mức nồng độ NAA: 0,1 mg/l, 0,2 mg/l, 0,3 mg/l

Yếu tố B: 4 mức nồng độ BA: 1 mg/l, 2 mg/l, 3 mg/l, 4 mg/l

- Số nghiệm thức: 12

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi

- Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai

- Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

- Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát liều lượng dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

Mục tiêu: xác định liều lượng và loại dịch chiết thích hợp đến khả năng sinh

trưởng của lan Cattleya

Vật liệu: cụm chồi lan Cattleya in vitro đường kính 0,3 – 0,4 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm 2 yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn toàn

ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Yếu tố A: 3 mức nồng độ: 10%, 20%, 30%

Yếu tố B: 3 loại dịch chiết khoai tây, cà rốt và nước dừa

- Số nghiệm thức: 9

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60

- Tổng số mẫu: 60 x 9 = 540

- Môi trường nền: môi trường MS + agar 8,5 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + đường 30 g/l

Bố trí thí nghiệm:

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của các dịch chiết đến khả năng nhân chồi

Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi định kỳ 10 ngày/lần đến 90 ngày sau cấy

- Chiều cao chồi (cm): đo từ mặt thạch lên đỉnh cụm chồi

- Số chồi (chồi): đếm số chồi hình thành trung bình của các cụm trong 5 chai

- Trọng lượng tươi cụm chồi 90 ngày sau cấy (g): cân và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

- Đường kính cụm chồi 90 ngày sau cấy (cm): đo và tính trung bình 4 cụm chồi trong một chai.

Vật liệu: cây con lan Cattleya in vitro cao 1,5 – 2 cm.

Phương pháp thí nghiệm: thí nghiệm đơn yếu tố, được bố trí theo kiểu hoàn

toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

- Số nghiệm thức: 6

- Số lần lặp lại của một nghiệm thức: 3

- Số chai cho mỗi lần lặp lại: 5

- Số mẫu/chai: 4

- Tổng số chai cho mỗi nghiệm thức trong 3 lần lặp lại: 5 x 3 = 15

- Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 15 x 4 = 60