Khảo sát một số phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

- Định tính và bán định lượng hoạt chất 2, 3, 5, O-β-D-glucosid trong dược liệu Hà thủ ô đỏ chế bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với mẫu dược liệu sống... Pha động bao gồm các dung dịch cần

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHAMLOY KEOMONGSA

Mã sinh viên: 1401325

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẾ BIẾN HÀ THỦ Ô ĐỎ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

ThS Phạm Thái Hà Văn

Nơi thực hiện

Bộ môn Dược học cổ truyền Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên em xin dành lời

cảm ơn sâu sắc tới Đảng và Chính phủ nước Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào

và Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập

và có điều kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực hiện đề tài này trong suốt thời gian vừa qua

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộ môn Dược học cổ truyền, ThS Phạm Thái Hà Văn đã tận tình trực tiếp chỉ bảo và hướng

dẫn em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các chị kĩ thuật viên trong

Bộ môn Dược học cổ truyền đã giúp đỡ, chỉ bảo luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn

Và cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn

ở bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường, đặc biệt là thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Khamloy KEOMONGSA

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vị thuốc Hà thủ ô đỏ 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.2 Bộ phận dùng và công dụng 3

1.1.3 Thành phần hóa học trong rễ củ của cây 3

1.2 Một số bài thuốc có vị thuốc Hà thủ ô đỏ 4

1.2.1 Chữa tóc rụng và bạc sớm, chóng mặt, ù tai, hoa mắt, đau mỏi lưng khớp, táo bón 4

1.2.2 Chữa phong thấp đau lưng, viêm dây thần kinh hông, vận động khó khăn 4

1.2.3 Thuốc bổ dùng cho người già yếu, thần kinh suy nhược, tiêu hóa kém 4

1.2.4 Thuốc bổ khí huyết, mạnh gân cốt 4

1.2.5 Thất bảo mỹ nhiệm đơn 5

1.2.6 Hà nhân ẩm 5

1.3 Chế biến Hà thủ ô đỏ 6

1.3.1 Mục đích 6

1.3.2 Phương pháp chế biến 6

1.3.3 Một số phụ liệu dùng trong chế biến 7

1.4 Hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 7

1.5 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 8

1.5.1 Sắc ký lớp mỏng 8

1.5.2 Ưu điểm của các thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 11 1.5.3 Ứng dụng của TLC trong nghiên cứu dược liệu 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 14

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Chế biến dược liệu Hà thủ ô đỏ 16

2.3.2 Định tính và bán định lượng thành phần THSG trong các mẫu Hà thủ ô đỏ đã chế biến bằng phương pháp TLC-videoscan 17

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Hiệu suất và một số chỉ tiêu cao khô Hà thủ ô đỏ 21

3.1.1 Các chỉ tiêu về cảm quan và định tính hóa học 21

3.1.2 Hiệu suất bào chế cao Hà thủ ô 22

3.2 Kết quả định tính bằng sắc ký lớp mỏng 23

3.3 Kết quả định lượng 25

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADP Adenosine-5'-diphosphat

DPPH α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl

GOT Glutamic oxaloacetic transaminase

GPT Glutamic pyruvic transaminase

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography HSCC High-speed countamrent chromatography

HTOĐ Hà thủ ô đỏ

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate SKLM Sắc ký lớp mỏng

THSG 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β -D-glucosid TLC Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thông tin bài thuốc Thất bảo mỹ nhiệm đơn 5

Bảng 2.1 Các mẫu và thể tích chấm trên bản mỏng định tính của THSG, mẫu chế Hà thủ ô đỏ và mẫu sống 18

Bảng 2.2 Các mẫu và thể tích chấm trên bản mỏng định tính, định lƣợng của THSG, mẫu chế Hà thủ ô đỏ Và mẫu sống 19

Bảng 3.1 Độ ẩm của các mẫu cao Hà thủ ô đỏ chế 22

Bảng 3.2 Hiệu suất của các mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ chế theo quy trình điều chế ở điều kiện khác nhau (%) 22

Bảng 3.3 Giá trị Rf trên bản mỏng định tính ở 366 nm 23

Bảng 3.4: Nồng độ THSG chuẩn và diện tích Pic đáp ứng 27

Bảng 3.5 Kết quả bán định lƣợng 28

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ 2

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside 8

Hình 2.1 Nguyên liệu chế Hà thủ ô đỏ chưa chế 14

Hình 2.2 Máy cất quay thu hồi dung môi IKA 15

Hình 2.3 Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC 15

Hình 3.1 Dược liệu Hà Thủ Ô chế 21

Hình 3.2 Hình ảnh cao khô sau khi chế biến lần lượt với đậu đen 2 lần (1), 4 lần (2), 6 lần (3) 21

Hình 3.3 Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở 24

Hình 3.4.a Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng λ= 254 nm (A), λ= 366 nm (B) 25

Hình 3.4.b Sắc ký đồ của các mẫu quan sát dưới ánh sáng trắng (C) 26

Hình 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn của THSG (Stilben) từ chiều cao pic sắc ký của dãy nồng độ khảo sát 27

Hình 3.6 Kết quả xây dựng đường chuẩn của THSG (Stilben) từ diện tích pic sắc ký của dãy nồng độ khảo sát 28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hà thủ ô đỏ là dược liệu quý đã được nhân dân các nước châu Á sử dụng với nhiều tên gọi khác nhau như dạ hợp, dạ giao đằng,… Bộ phận rễ củ có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới bạ (khí hư), thần kinh suy nhược, sốt rét kinh niên,

đi ngoài ra máu, bổ gan thận, làm đen râu tóc Bộ phận trên mặt đất có tác dụng dưỡng tâm an thần, dưỡng huyết hoạt lạc,… [5] Hà thủ ô đỏ cũng có mặt trong nhiều bài thuốc cổ phương [2]

Trong đông y các vị thuốc nói chung trước khi dùng để uống đều phải trải qua chế biến theo một hoặc nhiều phương pháp cổ truyền khác nhau để đạt được những mục đích của việc chữa bệnh: tăng quy kinh, giảm độc tính, tăng tác dụng,… của vị thuốc Do đó, với từng dược liệu cần chọn phương pháp chế biến thích hợp để có hiệu quả tốt nhất, phù hợp với tình trạng bệnh Theo dược điển Việt Nam IV, Hà thủ ô đỏ chế biến với 2 phụ liệu là đậu đen và nước vo gạo, dùng phương pháp cửu chưng cửu sái Tuy nhiên, nhiều thông số kỹ thuật trong quá trình chế biến Hà thủ ô đỏ chưa được làm rõ, cần có nghiên cứu sâu hơn để xây dựng quy trình chuẩn để chế biến Hà thủ ô đỏ đạt hiệu quả trị bệnh tốt Đặc biệt là số lần đồ với đỗ đen trong quy trình chuẩn [3], rất ít cơ sở sản xuất hiện nay tuân thủ đủ số lần chế biến (9 lần chưng, 9 lần sái) mà thường rút ngắn số lần chưng - sái Việc giải quyết bài toán kinh tế với vấn đề chất lượng sản phẩm

Hà thủ ô đỏ được đặt ra cho các nhà khoa học

Với mục tiêu nghiên cứu, tiến tới tiêu chuẩn hóa phương pháp chế biến vị

thuốc cổ truyền này, đề tài “Cải tiến quy trình chế biến Hà thủ ô đỏ” được

tiến hành với mục tiêu:

- Khảo sát số lần chưng – sái dược liệu Hà thủ ô đỏ

- Định tính và bán định lượng hoạt chất 2, 3, 5, O-β-D-glucosid trong dược liệu Hà thủ ô đỏ chế bằng sắc ký lớp mỏng, so sánh với mẫu dược liệu sống

nhụy 3 rời, ngắn Quả đóng hình thấu kính [9] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ(nguồn hình cây thuốc và động vật làm thuốc

Việt Nam)

Hà thủ ô phân bố rộng khắp ở các quốc gia Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam Ở Việt Nam, cây mọc hoang từ Lai Châu, Lào Cai, Sơn La, Hà Giang vào Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Tây Nguyên Thường gặp dưới tán tràng cây bụi, trong các rừng thưa ven suối hay ven đường râm mát ở chân núi hoặc khe

Quy kinh: can, thận [10]

Tác dụng: Bổ can thận, mạnh gân cốt, dưỡng huyết [5], [9]

Tương kị: hành, tỏi, củ cải, đồ bằng sắt [5], [9]

Tuy nhiên, phần thân leo của hà thủ ô đỏ cũng được sử dụng với tác dụng dưỡng tâm an thần, dưỡng huyết hoạt lạc, dùng trị chứng thần kinh suy nhược, thiếu máu, đau mỏi toàn thân [5]

1.1.3 Thành phần hóa học trong rễ củ của cây

Thành phần hóa học trong rễ củ Hà thủ ô bao gồm:

- Anthranoid tỷ lệ 1,7% chủ yếu chrysophanol, emodin và rhein có tác dụng làm tăng nhu động ruột, kích thích tiêu hóa và cải thiện dinh dưỡng [9]

- Chất đạm 1,1%, tinh bột 45,2%, chất béo 3,1%, chất vô cơ 4,5%, chất tan trong nước 26,4% và lecithin Lecithin bản chất là phospholipid được cấu tạo

từ acid glycerophosphoric với một phân tử choline và hai phân tử acid béo, được dùng trong trường hợp thiếu dinh dưỡng, thần kinh suy nhược [9]

4

Ngoài ra, Hà thủ ô đỏ có nhiều tanin như

3,3’-di-O-2, 3-O-galloyl-l-catechin, 3-O-galloyl-l-epicatechin, 3-O-

galloyprocyanidin-B-1, d-catechin, d-epichatechin và acid gallic [11]

1.2 Một số bài thuốc có vị thuốc Hà thủ ô đỏ

1.2.1 Chữa tóc rụng và bạc sớm, chóng mặt, ù tai, hoa mắt, đau mỏi lưng khớp, táo bón

Bài thuốc sử dụng như sau:

Hà thủ ô chế 20g

Huyền sâm 20g Cách dùng: Sắc uống [11]

1.2.2 Chữa phong thấp đau lưng, viêm dây thần kinh hông, vận động khó khăn

Bài thuốc sử dụng như sau:

Nước 600ml, sắc còn 200ml, chia 3-4 lần uống trong ngày [2]

1.2.4 Thuốc bổ khí huyết, mạnh gân cốt

Hà thủ ô trắng và hà thủ ô đỏ với lượng bằng nhau, ngâm nước vo gạo 3 đêm, sao khô tán nhỏ, luyện với mật làm viên to bằng hạt đậu xanh Uống mỗi ngày 50 viên với rượu vào lúc đói [2]

5

1.2.5 Thất bảo mỹ nhiệm đơn

Bài thuốc sử dụng như sau:

Bảng 1.1 Thông tin bài thuốc Thất bảo mỹ nhiệm đơn

Hà thủ ô đỏ 600g Đã chế biến

Hà thủ ô trắng 600g Đã chế biến

Xích phục linh 600g Cạo bỏ vỏ, tán bột, khuấy với nước trong, lọc lấy

bột lắng ở dưới, nắm lại, phơi khô

Bạch phục linh 600g

Ngưu tất 320g Tẩm rượu để một ngày, trộn với hà thủ ô và đổ với

đỗ đen vào lần thứ 7,8,9 rồi phơi khô Đương quy 320g Tẩm rượu phơi khô

Câu kì tử 320g Tẩm rượu phơi khô

Thỏ ty tử 320g Tẩm rượu cho nứt ra, giã nát phơi khô

Bổ cốt chi 100g Trộn với vừng đen, sao cho bốc mùi thơm

Tất cả giã nhỏ, trộn đều, thêm mật vào làm thành viên 0,5g Ngày uống 3 lần, mỗi lần 50 viên Sáng dùng rượu chiêu thuốc, trưa dùng nước gừng, tối dùng nước muối

Công dụng: Làm râu tóc trắng hóa đen, khỏe gân xương, bền tinh khí, sống lâu [2]

1.2.6 Hà nhân ẩm

Sinh khương 3 lát Cách dùng: Sắc uống, trước khi lên cơn sốt rét 2 giờ

Công dụng: Trị bệnh sốt rét đã kéo dài, hay tái phát Khí huyết lưỡng hư, sắc mặt xanh nhợt, chất lưỡi nhợt, mạch hoãn đại mà hư [8]

- Giảm tác dụng nhuận tràng do anthranoid bằng phương pháp ngâm

- Tăng tác dụng dẫn thuốc vào kinh thận bằng cách chế với dịch nước đậu đen

1.3.2 Phương pháp chế biến

1.3.2.1 Phương pháp chế theo dược điển Việt Nam V

Rửa sạch củ, ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại Đổ nước đậu đen cho ngập (cứ 1kg Hà thủ ô cần 100g Đậu đen, 2L nước, nấu đến khi đậu đen nhừ nát), nấu đến khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều Khi củ đã mềm, lấy ra, bỏ lõi (nếu có) Nếu còn nước đậu đen thì tẩm phơi cho hết Làm sạch vụn nát Thái hoặc cạo mỏng rồi phơi khô Nếu đồ thì đồ 9 lần rồi phơi 9 lần (cửu chưng cửu sái) thì càng tốt

Khi đun nên đặt vỉ ở đáy nồi cho khỏi cháy dược liệu [4]

1.3.2.2 Chế biến theo phương pháp đồ

Ngâm: Hà thủ ô ngâm với nước vo gạo 4 ngày đêm, mỗi ngày thay nước 1 lần Vớt ra, rửa sạch

Đồ: ra đậu đen và hà thủ ô vào chõ Cứ 1 lượt đậu đen lại 1 lượt hà thủ ô

đỏ Đồ đến khi đậu đen chín nhừ Loại bỏ hạt đậu đen Phơi hà thủ ô đến khi khô Làm như vậy nhiều lần Thái phiến, phơi sấy đến khi khô kiệt

Tiêu chuẩn thành phẩm: phiến dày 1-2 mm, màu nâu đen, khô cứng, ít chát [10]

Ứng dụng: Hạt đậu đen có màu đen, chế thuốc nhằm tăng tác dụng dẫn thuốc vào kinh thận, tăng tác dụng bổ, giảm độc tính của một số vị thuốc như

mã tiền, phụ tử Lượng đậu đen dùng chế khoảng 10- 20% so với thuốc Nấu lấy dịch nước, dùng dịch nước này tẩm hay nấu với thuốc [10]

1.3.3.2 Nước vo gạo

Dùng nước gạo nếp hoặc gạo tẻ Ngâm thuốc, thường dùng với nước vo gạo loãng (1kg gạo lấy 2-3 L dịch nước) Tẩm vào thuốc, thường dùng nước vo gạo đặc (1kg gạo lấy 100- 200 ml dịch nước)

Phương pháp tẩm thuốc với dịch nước vo gạo gọi là mễ cam chế

Ứng dụng: Thuốc chế với dịch nước vo gạo làm tăng tác dụng kiện tỳ, hòa

vị, làm giảm tính táo của vị thuốc, tăng thêm tính nhu nhuận

Dịch nước vo gạo để lâu sẽ bị lên men có mùi chua, pH dịch thay đổi từ trung tính sang acid, ảnh hưởng đến độ tan của một số thành phần hóa học trong dịch ngâm như alcaloid, coumarin Men còn là yếu tố gây phản ứng thủy phân các glycosid thành aglycol và đường, làm thay đổi tác dụng của thuốc [10]

1.4 Hoạt chất 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside

2, 3, 5, 4' - tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside (THSG) là một polyphenol có trong Hà thủ ô đỏ thuộc dẫn chất của stilben với cấu trúc như

Hình 1.2 [15], được phân lập từ năm 1998 bằng phương pháp HSCC [12]

Công thức phân tử: C20H22O9

Khối lượng phân tử: 406 [14]

8

CH CH OH HO

(E)- 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-0-β-D-glucopyranoside còn có tác dụng ức chế gốc tự do DPPH [16], hạ huyết áp, bảo vệ tim mạch, chống viêm [17], [18], [19] THSG còn là hợp chất đầy hứa hẹn trong điều trị giai đoạn đầu của ung thư đại trực tràng [14]

Theo Dược điển Trung Quốc, hàm lượng 2,3,5,4'-tetrahydroxy O-D-glucosid định lượng bằng phương pháp HPLC trong Hà thủ ô đỏ không được dưới 1% tính theo dược liệu khô [13]

stilbene-2-1.5 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

1.5.1 Sắc ký lớp mỏng

1.5.1.1 Nguyên tắc

Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, Pha động bao gồm các dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1]

Trong đó:

dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đếm mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1

- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10- 30 μm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên thi trường có kích thước khác nhau thường 5- 20 cm, nhiều khi có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để phát hiện chất phân tích [1] Chất hấp phụ thường dùng nhất là loại silicagel (>90%) rồi đến nhôm oxyd (<5%) Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil, Celite,…) ít được sử dụng [3]

- Pha động cho TLC rất thay đổi, thùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa vào kinh nghiệm Một số gợi ý chung nhất cho pha động TLC [1]:

+ Dung môi cần có độ tinh khiết cao

+ Cần điều chỉnh sức rửa giải giữa pha động để trị số Rf nằm trong

khoảng 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị

+ Chất phân tích dạng ion hay phân cực rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-butanol – nước Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

+ Khi dùng silica hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và Rf của chúng

10

Nếu thêm một ít dung môi phân cực như ethyl ethylic vào dung môi không phân cực như methyl benzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf

+ Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể

sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina

1.4.1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Đầu tiên là lựa chọn bản mỏng sắc ký có kích thước phù hợp, hoạt hóa trong thời gian và nhiệt độ thích hợp Sau đó, thực hành sắc ký lớp mỏng có 4 bước sau:

Bước 1: Đưa chất phân tích lên bản mỏng

- Lượng và thể tích mẫu chấm: Lượng mãu đưa lên bản mỏng có ý nghĩa

rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số Rf Nếu lượng chất quá lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các vết có trị số Rf gần nhau sẽ chồng lên nhau và không tách riêng được Nếu lượng chất quá nhỏ có thể khó phát hiện vết Lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0,1- 0,5μg Tùy theo kiểu đưa mẫu lên bản mỏng mà thể tích mẫu cũng khác nhau Trường hợp mẫu dưới dạng thể tích, thể tích mẫu khoảng 0,1- 0,2 μl [1], [3]

- Vị trí đưa mẫu lên bản mỏng: Đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng

và mép của dung môi pha động đủ lớn để tốc độ di chuyển của dung môi từ khi bắt đầu đến điểm đưa mẫu lên bản mỏng đã khá ổn định Tốt nhất là cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm và cách mép dung môi từ 0,8- 1cm để tránh hiệu ứng bờ [1], [3]

Bước 2: Khai triển sắc ký

- Thiết bị triển khai sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, kích thước phù hợp với bản mỏng Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi), người ta đặt giấy lọc áp sát thành bình

- Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô được cho vào bình sắc ký bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm vẫn cách bề mặt pha động khoảng 1cm [3]

11

Bước 3: Hiện sắc ký đồ, dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất cần phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp vết sắc ký

- Sử dụng thuốc thử hiện màu [3]: Sau khi khai triển, muốn quan sát đầy

đủ nhất tất cả các vết, thường phải phun thuốc thử lên bề mặt bản mỏng hoặc nhúng cả bản mỏng vào thuốc thử Đôi khi phải làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu

- Soi dưới ánh sáng đèn UV [1]: Nhiều chất hưu cơ trên sắc ký đồ trở nên

tối hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 hoặc 366 nm Một số bản mỏng tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

- Dùng densitometer [1]: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt

bản mỏng khi soi dưới đèn UV- VIS Chất phân tích bức xạ được ghi lại thành pic sắc ký

Bước 4: Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm [1]

1.5.2 Ưu điểm của các thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là hình thức phát triển nhất của

kỹ thuật SKLM Thuật ngữ HPTLC bao gồm hệ thống triển khai sắc ký bán tự động như: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer), máy quét vết (TLC Scanner) và bản mỏng hiệu năng cao TLC [20] Các thiết bị có thể sử dụng trong kỹ thuật TLC thông thường để cải thiện độ lặp lại của các lần triển khai sắc ký là: máy chấm mẫu tự động (Linomat 5, Nanomat 4, ATS 4), thiết bị triển khai sắc ký (ADC2), thiết bị soi và chụp ảnh bản mỏng (TLC Visualizer)

Ưu điểm của phương pháp này so với SKLM thông thường là [7]:

- Khả năng phân tách tốt hơn Ưu điểm này chủ yếu nhờ bản mỏng hiệu năng cao có kích thước hạt nhỏ hơn, hạt đồng đều hơn, do đó khả năng hấp phụ của bản mỏng cũng tốt hơn

12

- Lượng chất đưa lên bản mỏng ít hơn: với thiết bị tiêm mẫu chính xác và bản mỏng có khả năng hấp phụ tốt, lượng chất cần cho phân tích là nhỏ hơn

- Thời gian triển khai ngắn hơn

- Độ lặp lại tốt hơn do gắn với hệ thống chấm máy sắc ký tự động, buồng triển khai sắc ký, máy quét, chụp ảnh và phần mềm xử lý hình ảnh, số liệu Các yếu tố về môi trường, nguyên nhân ảnh hưởng tới kết quả phân tích, được kiểm soát và hạn chết tối đa các thay đổi

1.5.3 Ứng dụng của TLC trong nghiên cứu dược liệu

1.5.3.1 Định tính

Chứng thực độ tinh khiết của một hợp chất phân lập được: Chấm tương đối đậm mẫu thử trên ít nhất 3 bản mỏng khác nhau, khai triển ít nhất với 3 hệ dung môi khác nhau Nếu cả 3 sắc ký đồ đều cho một vết gọn trong một vùng Rf

= 0,3- 0,75 thì có thể sơ bộ kết luận rằng mẫu thử là một chất tinh khiết Việc khẳng định sự tinh khiết của mẫu thử sẽ được kiểm tra bằng phương pháp phổ học khác (UV, IR, NMR, MS) [3]

So sánh với một chất chuẩn: Thực hiện ít nhất trên 3 bản mỏng khác nhau, khai triển với ít nhất 3 hệ dung môi khác nhau Trên mỗi bản mỏng chấm ít nhất

3 vết: vết I (mẫu thử), vết II (mẫu thử + mẫu chuẩn), vết III (mẫu chuẩn) Nếu trên cả 3 sắc ký đồ mẫu thử với mẫu chuẩn đều đồng nhất (về trị số Rf, về hình dạng, màu sắc vết trước và sau khi hiện màu) thì có thể sơ bộ kết thúc mẫu thử

và mẫu chuẩn là đồng nhất [3]

Kiểm nghiệm dược liệu: Cùng với một quy trình chiết xuất như nhau, dịch chiết của mẫu thử dược liệu được chấm song song với dịch chiết của mẫu dược liệu chuẩn (thực hiện trên 3 bản mỏng về số vết, Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết… của mẫu dược liệu thử và dược liệu chuẩn [3]

Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: Bằng một chiết xuất nhất định, trong điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu là không đổi về số vết, về trị số Rf của các vết, hình dạng các vết, màu sắc các vết,

14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là dược liệu Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora

(Thunb.) Haraldson) được mua từ chợ Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà Nội

Hình 2.1 Nguyên liệu chế Hà thủ ô đỏ chưa chế

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

2.1.2.1 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm

- Máy cất quay thu hồi dung môi

- Máy chấm sắc ký Linomat 5, Máy chụp ảnh TLC Visualizer, phần mềm WINCATS, phần mềm VideoScan

- Cân phân tích

- Giấy lọc

- Nồi đun, dao

2.1.2.2 Hóa chất

- Nước cất, cồn Ethanol 96%, Toluen, Acid acetic

- Chất đối chiếu: THSG (Trung Quốc) pha ở nồng độ 0,5 mg/ml trong methanol

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tiến hành bào chế dược liệu Hà thủ ô đỏ với số lần chưng – sái khác nhau

16

- Kiểm tra các chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ

- Định tính và so sánh thành phần hóa học của các mẫu dược liệu Hà thủ

ô đỏ được chế biến với các điều kiện khác nhau, và chiết xuất ở cùng điều kiện bằng phương pháp TLC-videoscan

- Định lượng THSG (Stilben) trong cao khô hà thủ ô đỏ thu được nhằm nghiên cứu sự ảnh hưởng của các điều kiện chế biến đến quá trình bào chế cao khô Hà thủ ô đỏ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chế biến dược liệu Hà thủ ô đỏ

Dược liệu sau khi mua được chế biến dựa trên phương pháp chế của Dược điển Việt Nam IV [3], tiến hành khảo sát số lần chưng – sái (hay chế biến) với phụ liệu là nước đậu đen như sau:

Mẫu 1: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 2 lần, mỗi lần 200g

Mẫu 2: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 4 lần, mỗi lần 200g

Mẫu 3: 1kg HTOĐ 200g đậu đen làm 6 lần, mỗi lần 200g

Cách chế dịch nước đậu đen: lấy 200g đậu đen nấu với khoảng 2 lít nước Nấu hạt đậu đen với nước, gạn lấy dịch, thêm nước vào bã đun tiếp đến khi nhìn thấy dịch nước đậu đen nhạt màu thì dừng lấy dịch nước đậu đen Gộp dịch nước đậu đen lại dùng để chế với hà thủ ô đỏ

Sau đó nấu Hà thủ ô đỏ với dịch đậu đen đến khi chín lấy ra thái phiến dày 1-2 mm, tẩm dịch đậu đen sau đó sấy không quá 62 trong khoảng 20 – 21 giờ đến khô kiệt Nghiền thành bột

Bước 2: Chiết bột Hà thủ ô

17

Lấy cồn 96% pha loãng với nước cất đến 50%, đo bằng cồn kế, chiết xuất mẫu với tỷ lệ dung môi dược liệu là 3:1, cho dung môi chiết vào dược liệu trong bình nón, lắc đều, để yên 15 phút, rồi siêu âm trong thời gian 60 phút, gạn lấy dịch chiết, lọc qua giấy lọc, làm như vậy 3 lần Sau mỗi lần chiết, gộp các dịch chiết lại thu được dịch chiết tổng

Mẫu 1: 600g dược liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1800ml ethanol 50%

Mẫu 2: 620g dược liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1860ml ethanol 50%

Mẫu 3: 660g dược liệu, chiết 3 lần, mỗi lần 1980ml ethanol 50%

Sau đó dịch chiết 3 mẫu được cô cất quay thu hồi dung môi ở nhiệt độ không quá 60 , cô tiếp đến khi được cao khô

2.3.2 Định tính và bán định lượng thành phần THSG trong các mẫu

Hà thủ ô đỏ đã chế biến bằng phương pháp TLC-videoscan

2.3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1 Chuẩn bị mẫu thử:

Cân chính xác khoảng 2,50 g cao khô Hà thủ ô đỏ, cho vào bình nón, cho thêm 15 ml Ethanol tuyệt đối, siêu âm, trong 45 phút ở nhiệt độ thường, gạn lấy dịch chiết, làm như vậy 2 lần, lần sau chiết với 10ml Ethanol tuyệt đối, gộp dịch chiết cho vào bình định mức 25ml, thêm ethanol tuyệt đối vừa đủ 25ml, sau đó

lọc dịch chiết bằng giấy lọc, dịch lọc dùng để chấm sắc ký

Bước 2 Mẫu đối chiếu:

Pha dung dịch đối chiếu gốc THSG: Cân chính xác khoảng 0,0050g THSG, hòa tan trong 5ml Ethanol, cho vào bình định mức 10 ml Bồ sung dung môi Ethanol tới vạch thu được dung dịch gốc có nồng độ 0,5 mg ml tương ứng với 0,5 µg/µl

Chuẩn bị dãy dung dịch đối chiếu gốc THSG: Từ dung dịch đối chiếu gốc, chấm sắc ký với các thể tích lần lượt là 5, 10, 15, 20, 25 µl Làm như vậy ta được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tương ứng 2,5 µg/µl; 5,0 µg/µl; 7,5 µg/µl; 10,0 µg/µl; 12,5 µg/µl

2.3.2.2 Định tính các chất trong cao khô Hà thủ ô đỏ

o Mẫu đối chiếu THSG nồng độ 0,5 mg/ml

o Mẫu dược liệu chưa chế biến nồng độ 0,1 g/ml

o Các mẫu dược liệu đã chế biến (M1, M2, M3): 0,1 g/ml Thể tích các vết chấm trong thí nghiệm định tính bằng sắc ký lớp mỏng

được chi tiết trong Bảng 2.1

Bản mỏng sau khi khai triển được phát hiện vết ở ánh sáng bước sóng 254nm, 366nm, và hiện màu bằng hơi NH3, sau đó quan sát và chụp ảnh ở ánh sáng trắng

Bảng 2.1 Các mẫu và thể tích chấm trên bản mỏng định tính của THSG,

o Dãy dung dịch đối chiếu THSG (Stilben): 5, 10, 15, 20, 25 µl

o Mẫu cao Hà thủ ô sống (mẫu sống): 10 µl

o Mẫu cao Hà thủ ô đỏ chế (Mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3): 10 µl

Bản mỏng sau khi khai triển được phát hiện vết ở ánh sáng bước sóng

254nm, 366nm, và hiện màu bằng hơi NH3 – quan sát ở ánh sáng khả kiến

Sau khi khai triển thu được sắc ký đồ là hình ảnh các vết được tách nhau trên bản mỏng Xử lý kết quả bằng hệ thống chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer cùng 2 phần mềm winCATS và VideoScan sẽ giúp

ta xác định được nồng độ các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ Stilben của các mẫu