Khảo sát một số phương pháp điều chế l cystin từ tóc, sừng

Thông thường người ta thu được các acid amin từ quá trình thủy phân protein với các tác nhân khác nhau như: acid, kiềm, enzym ...Để đánh giá chất lượng các chế phẩm acid amin, người ta t

BỘ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ

Giáo viên hướng dẫn ': Ths ^Nguyễn Đình Luyện

Ths Nguyễn Thị Trinh Lan

Sình viên thực hiện : Nghiêm Thanh Hoàng

Nơi thực hiện : Bộ món Công nghiệp - Dược, phòng GMP

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp “ K hảo sát m ột số phương pháp điều chế L-cystin từ tóc, sừng”, được sự giúp đỡ hết sức tận tình của thầy Nguyễn Đ ình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh L an, tôi đã hoàn thành

khóa luận tốt nghiệp với mục đích và nội dung đề ra đúng thời gian qui định

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy Nguyễn Đình Luyện và cô Nguyễn Thị Trinh Lan cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật

viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược, phòng thí nghiệm GMP - Trường Đại học Dược Hà nội

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các phòng ban, bộ môn của trường đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đc tài

Xin kính chúc các thầy cô luôn luôn mạnh khỏe và ngày càng thu được nhiều thành tích mới trong công tác nghiên cứu cũng như trong giảng dạy

Hà nội, ngày 27 tháng 5 năm 2005

Sinh viên

Nghiêm Thanh Hoàng

1.2 Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin 4

2.2 Điều chế theo Gortner và Hoffman 17 2.3 Các phương pháp điều chẻ khác 17

1.4 Phương pháp nghiên cứu và cách xác định

2.1 Khao sát sự ảnh hưởng của nồng độ acid

tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 23 2.2 Khảo sát anh hương của thời gian thủy phân

tới hiệu suất của phản ứng thủy phân 26 2.3 Khảo sát và tối ưu hóa giai đoạn tách

cystin với tên khoa học là : L(-)-3,3'-Dithiobis(2-aminopropanoic acid).

Trong y học, người ta đã sử dụng L-cystin để điều trị một số bệnh da liễu như: rụng tóc, trứng cá, bệnh vảy nến Gần đây L-cystin còn được dùng trong các trường hợp tổn thương giác mạc, do tác dụng ức chế colagenaza làm biểu mô giác mạc nhanh thành sẹo

Ngoài ra, L-cystin còn được dùng để tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng dụng trong lâm sàng như : N-acetylcystcin, L-cystein, S-carboxy-Metylcystein Đc điều chế L-cystin người ta có thể đi từ con đường tổng hợp hóa học hoặc chiết từ dịch thủy phân protein [8J

Trcn thế giới cũng như ở Việt nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu điều chế L-cystin từ tóc, sừng, lông gà, lông cừu [11][15][19] Nhằm hoàn thiện quy trinh điều chế L-cystin, chúng tôi tiến hành đc tài nghicn cứu

“ Khảo sát inột sô phương pháp điều chê L-cystin từ tóc, sừng “ với những

inục tiêu sau :

1 Khảo sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là tóc

2 Khao sát 1 số điều kiện của phản ứng thủy phân ảnh hưởng đến hiệu suất tạo thành L-cystin từ nguyên liệu ban đầu là sừng

3 Nghiên cứu cải tiến các phương pháp tách và tinh chế L-cystin nhằm tiết kiệm năng lượng và phụ liệu

4 Điều chế một lượng L-cystin đạt tiêu chuẩn cho quá trình tổng hợp Acetylcystein tiếp theo

Thông thường người ta thu được các acid amin từ quá trình thủy phân protein với các tác nhân khác nhau như: acid, kiềm, enzym Để đánh giá chất lượng các chế phẩm acid amin, người ta tiến hành kiểm nghiệm bằng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp Kendan, phương pháp Ninhydrin, phương pháp sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion

Ớ nước ta hiện nay, đa số các chế phẩm acid amin phải nhập từ nước ngoài trong khi nhu cầu sử dụng các chế phẩm này làm thuốc lại rất lớn Do vậy việc nghiên cứu về acid amin đóng một vai trò quan trọng và có nhiều ý nghĩa trong thực tế

1.1.2 Cấu tạo hoá học của acid atnin

Acid amin là những hợp chất acid hữu cơ mạch thẳng trong đó một hay hai nguyên tử hydro trên carbon a được thay thế bằng nhóm amin Các acid amin trong tự nhiên đều là acid L- a amin

H

lĩ

0

Acid a -am in

Tất cả các acid amin trừ glycin (R -H ) đều có carbon a bất đối mang

hoạt tính quang học làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực

Mặc dù trong tự nhiên có khoảng 300 acid amin nhưng cũng chỉ có 20

acid amin được tìm thấy trong protein Người ta gọi đó là những acid amin

chuẩn [4]

1.1.3 Phân loại acid amỉn [4]

• Theo mức độ phụ thuộc vào gốc R có trong phân tử acid amìn có thể chia các acid L- a amin thành 2 nhóm lớn: acid amin phân cực và acid amin

không phân cực

Không phân cực Alanin, Isolcucin, Methionin, Phenylalanin, Prolin,

Tryptophan, Valin

Phân cực Acid aspartic, Acid glutamic, Arginin, Asparagin,

Cystein, Glutamin, Glycin, Histidin, Lysin, Serin, Threonin, Tyrosin

• Mặt khác, theo cấu tạo hóa học của nhóm R: Các acid L- a amin được phân thành 7 nhóm :

o Nhóm acid amin mạch thẳng: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin

o Nhóm acid amin chứa hydroxyl (OH): Serin, Threonin, Tyrosin

o Nhóm acid amin chứa lưu huỳnh: Cystein, Methionin

o Nhóm acid amin acid (chứa carboxyl hay amid): Acid aspartic, Asparagin, Acide Glutamic, Glutamin

o Nhóm acid amin kiềm (chứa nhóm basic): Arginin, Lysin, Histidin

3

o Nhóm acid amin chứa nhân thơm: Histidin, Phenylalanin, Tyrosin, Trytophan

o Nhóm imin: Prolin

1.1.4 Tính chất của acid amin

• Tính tan và điểm chảy của acid amiti [4]

Sự có mặt của nhiều nhóm ion hoá trên acid amin làm cho chúng dễ tan hơn trong dung môi phân cực như: nước, ethanol, không tan trong các dung môi không phân cực như: benzen, hexan hay ete

Điểm chảy của chúng thường cao (trên 200°C) do lực ion của mạng kếttinh

• Các phản ứng hoá học đặc trưng của acid amin

Đó là các phán ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxyl như phản ứng acetyl hoá, phản ứng formyl hóa hay este hóa:

1.2 Cấu trúc hóa học của nguyên liệu Keratin [2][4]

Keratin là protein rắn chắc, không tan trong nước, chiếm tỷ lệ cao trong tóc, sừng, móng và lông của hầu hốt các loài động vật kể cả con người

Hình l : ịa): cấu trúc tóc; (h): cấu tạo sợi tóc;(c): Keratin

Thông thường Keratin có 2 cấu dạng chính đó là a-keratin và p-keratin, a-keratin thường được tìm thấy ở người và động vật có vú còn p-keratin thường có trong các loài chim và bò sát Cấu trúc của ị3-keratin cứng rắn hơn

so với a-keratin

Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào Keratin còn có tác dụng bảo

vệ cơ thể tránh được các tác nhân có hại từ môi trường bên ngoài

1.2.1 Cấu dạng xoắn a

Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin Khoảng cách một chu kỳ xoắn là 0,54 nm (gồm 3,5 gốc acid amin) Các nhóm R của nguyên tử carbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn Cấu dạng xoắn a (hình 2) có những đặc điểm quan trọng sau đây :

• Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết Hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm

NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm c o thuộc gốc acid amin thứ

4 trong chuỗi) Như vậy mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo sự bền vững tối đa cho phân tử Keratin

• Liên kết Hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a

• Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptid do có thể tạo xoắn a một cách tự nhicn mà không cần nhiều năng lượng.

Hình 2: Cảu dạng xoắn a-keratin

1.2.2 Cấu dạng gấp nếp p

Là điển hình cho cấu trúc của P-keratin Nó có hình dáng giống như một tờ giấy gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình zigzag (không bị cuộn lại như cấu dạng xoắn a)

Trong cấu dạng p :

• Các chuỗi polypeptid cạnh nhau có thể song song (có cùng hướng từ N- tận đến C-tận) hay đối song (hướng ngược nhau) Hai cấu trúc này giống nhau mặc dù độ dài lặp lại trong cấu trúc song song ngắn hơn (0,65 nm so với 0,70

nm trong cấu trúc đối song)

• Khoảng cách giữa các acid amin cạnh nhau theo đường trục là 0,35 nm (trong cấu dạng xoắn a là 0,15 nm)

• Các liên kết Hydro tạo bởi các nhóm -NH- và - CO- có thể nằm trong cùng một chuỗi nhưng cách xa nhau hay giữa các chuỗi polypeptid khác nhau

• Các gốc R của acid amin cạnh nhau nằm ở những vị trí gấp khúc

1.3 Lịch sử nghiên cứu, tính chất lý hoá và ứng dụng của L-cystin

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

Do L-cystin thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực dược lý học, tế bào học, sinh hóa học, phóng xạ học nên từ lâu nó đã được tổng hợp và lưu hành trên thị trường L-cystin có thể được điều chế bằng nhiều phương pháp khác nhau Người ta đã tổng hợp được L-cystin từ Serin hay Acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các enzym , Tuy nhiên phương pháp thủy phân L-cystin từ protein vẫn đơn giản và có ý nghĩa thực tế hơn cả

Qua điều tra nghiên cứu người ta thấy L-cystin có tỷ lệ cao trong Keratin của lông, tóc, sừng, móng: [9]

12,1%10,3%

7

<J b e

Hình 4: Nguồn nguyên liệu L-cystin a: Tóc; b: Sừng; c: Lông

Do đó nguyên liệu chủ yếu để chiết tách L-cystin là các Keratin

Quá trình chiết L-cystin từ protein nhìn chung đều dựa trên sơ đồ

Vấn đề cần nghiên cứu trong quá trình thủy phân là các yếu tố ảnh hướng đến hiệu suất L-cystin như: nồng độ acid, lượng acid sử dụng, thời gian thủy phân và nhiệt độ thủy phân Theo một số tài liệu, nhiều tác giả sử dụng acid clohydric 37% với thể tích gấp 2 lần khối lượng tóc [7][ 11], một số lại sử dụng acid ở nồng độ loãng hơn (20-30%) để thủy phân với lượng acid gấp từ 2- 4 lần tóc [15][16] Theo Gortner và Hoffman [15] thì nên thủy phân tóc trong acid clohydric 20% vì dung dịch này tương đối ổn định và ít nguy hiểm hơn dung dịch acid đậm đặc

Ngoài ra, các tài liệu còn cho rằng thời gian thủy phân không nên kéo dài quá 8-10h [15] vì L-cystin dễ bị racemic hóa khi đun lâu trong acid Tuy

nhiên thời gian thủy phân còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện nhiệt độ , nếu đun trực tiếp trên bếp điện, bếp dầu hoặc cách cát thì chỉ cẩn 6-8h, trong khi nếu đun cách thủy thì phải cần tới 120-144h để thủy phân hoàn toàn protein.

Sau khi thủy phân được một hỗn hợp các acid amin người ta kết tủa L-

cystin bằng cách đưa về điểm đẳng điện ở pH=5 Tác nhân trung hòa thường

dùng là: NaOH, KOH, Amoniac, Amoni acetat, Natri acetat Ở đây những nghiên cứu trước cho thấy nếu chỉ dùng NaOH đặc dễ gây môi trường quá kiềm làm L-cystin bị phá hủy

Hiệu suất chiết tách L-cystin thường đạt cao nhất (5%) khi sử dụng nguyên liệu là tóc, tác nhân thủy phân là acid clohydric 37% với tỷ lệ acid : tóc bằng 2:1 và thời gian thủy phân là 6h nếu đun sôi trực tiếp hoặc 12h nếu đun sôi cách thủy

Tuy nhiên một số hạn chế của các phương pháp này còn chưa được giải

* quyết như: sử dụng acid clohỵdric đặc làm dung môi thủy phân dễ gây độc,

khả năng ăn mòn thiết bị cao, ô nhiễm môi trường

Sau khi thủy phân, sản phẩm thu được là L-cystin thô chứa cả Humin (chất mầu), Tyrosin và các tạp chất khác Humin là những acid hydro và polycarboxylic với 2-4 nhóm -COOH Chúng có trọng lượng phân tử cao, hấp Ihu ánh sáng, ở dạng vô định hình, có mầu và cấu trúc chưa chứng minh được Tạp chất Tyrosin có thể được loại bằng cách rửa nước nóng nhiều lần và tránh

để kết tủa L-cystin quá lâu [15]

Để tẩy mầu và loại bỏ tạp chất người ta thường sử dụng các chất hấp phụ bề mặt kết hợp với nhiều lần hòa tan kết tủa Đối với L-cystin thô người ta hay dùng than hoạt, có the sử dụng than hoạt ở tỷ lệ 2-5% so với dung dịch và

xử lý như vậy từ 2-5 lần

1.3.2 Câu tạo hoá học

9

L-cystin có cấu trúc ổn định, là sản phẩm oxy hóa của L-cystein L- cystin được biết đến như một disulfide amino acid bởi nó được cấu thành từ 2 phân tử Cystcin nối với nhau bằng cầu nối disulfide L-cystin có thể tạo thành L-cystein nhờ sự khử hóa Nó được phát hiện vào nãm 1810 và được chấp nhận là một thành phần của protein vào năm 1899.

1 + NÌỈ3+

Hình 5: Tinh thê L-cystin

L-cystin có dạng bột kết tinh màu trắng, thực tế không tan trong nước

và alcol Có thể hoà tan được trong dung dịch kiềm loãng, khả năng tan trong nước (g/1) ở nhiệt độ 25°c là 0,112, ở 50°c là 0,239, ở 75°c là 0,523, ở 100°c

là 1,142 L-cystin có góc quay cực t ừ -215° đến -225° (5%, HC1 IM), nhiệt độ nóng cháy khoảng 260-26l°c

1.3.3.2 H oútính [3]

L-cystin có cấu trúc của một a-amino acid do vậy nó có thể tham gia các phán ứng tương tự như các a-amino acid khác

o Phản ứng Biurê:

Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, các liên kết peptid trong protein

kết hợp với ion Cu tạo phức hợp màu tím ở dưới dạng anion Phản ứng này tạo phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng protein

Nguyên tắc: Ninhydrin là chất oxy hoá mạnh, khi đun nóng có khả

năng khử nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo Ninhydrin khử,

C 0 2, NH3 và aldehyd Sau đó Ninhydrin và Ninhydrin khử lại phản ứng tiếp

11

với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím có độ hấp thu cực đại ở Ằ, = 570

nm Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin

Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a-am in của acid amin, đây

là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram

+ H -N -c coo'

F lu o re s c a m in A cid am in

o Phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh

Nguyên tắc: L-cystein và L-cystin khi đun nóng trong môi trường kiềm

sẽ phản ứng với muối chì tạo sulfur chì PbS màu đen xám Cơ chế phản ứng như sau:

ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion,

Phương pháp Kendan :

Phương pháp Kendan dựa trên cơ sở dùng acid sulfuric đậm đặc để vô

cơ hóa nguyên liệu, các chất hữu cơ bị đốt cháy thành C 0 2 và H20 còn Nitơ được chuyển thành (NH4)2S 0 4

Khi cho dung dịch NaOH tác dụng với (NH4)2S 0 4 thì NH3 sẽ giải phóng ra, cất kéo NH3 theo hơi nước và chuyển tới bình đựng dung dịch H2S 0 4 N/50 chuẩn độ Chuẩn độ H2S 0 4 dư bằng dung dịch NaOH N/50, từ đó tính ra hàm lượng Nitơ toàn phần có trong dịch thủy phán

Phương pháp này đánh giá được hàm lượng Nitơ toàn phần có trong chế phẩm Tuy nhiên phương pháp này khó phân biệt được lượng Nitơ trong L- cystin và lượng Nitơ có nguồn gốc khác

❖ Phương pháp N ỉtơ form on (phương pháp Serensen)

Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amin để định lượng Nitơ của acid amin có trong dịch thủy phân, các acid amin đều có nhóm - COOH và -NH2, cả 2 nhóm này đều yếu, quá trinh điện ly kém, khi gặp dung dịch formon thì nhóm -NH2 chuyển thành nhóm metylenic -N=CH2, làm mất tính kiềm của các acid amin, do vậy mà tính acid của nhóm -COOH mạnh hơn

và có thể định lượng được bằng một chất kiềm mạnh với chỉ thị màu là phenolphtalein

❖ Phương pháp Pepe-Steven

Pcpe-Steven đã dựa vào khả năng tạo phức của acid amin với đồng bền vững trong môi trường kiềm có dung dịch đệm photphat Hai tác giả đã đề nghị xác định hàm lượng Nitơ amin theo phương pháp định lượng ion gián tiếp (phương pháp thừa trừ) theo phương trình phản ứng :

R— C — CO O H + Cu++ + H2N - C — R - ► I I

I2 + Na2s 20 3 - ► Na2s 40 6 + Nal

Như vậy việc xác định hàm lượng Nitơ amin được chuyển sang xác định hàm lượng I2 từ đó để tính ra hàm lượng Cu++ liên kết trong phức chất và suy

ra hàm lượng acid amin Irong dịch thủy phân

♦> Phương pháp sắc ký giấy:

So sánh Rị của mẫu ihử với R, của mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện,

từ đó suy ra acid amin có trong mẫu thử Hệ dung môi sử dụng là n- butanol :acid acetic : nước = 4:1:5 Hiện màu bằng thuốc thử Ninhydrin

❖ Phương pháp tách các acid amin bằng sắc ký trao đổi ion

Dùng nhựa trao đổi ion để tách riêng các acid amin có trong dịch thủy phân Các nhựa thường được sử dụng trong sắc ký tách acid amin là: Dowex-

50, Dowex 2x8, Amberlite-IR-4B, Amberlite IRC-120, Amberlite IRC-50, Wofatit Kps-200,

Các acid amin thường được tách ricng biệt nhờ cột chứa cationit gắn Na+, H+ và anionit gắn O H ở môi trường có pH khác nhau, các acid amin tách ra và hòa tan vào dung dịch rồi dịch chuyển theo dung dịch với tốc độ dịch chuyển khác nhau Người ta hứng dung dịch theo từng phần nhỏ, mỗi loại acid amin được phân bố theo những phần nhất định Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion có ý nghĩa rất lớn trong việc định tính, định lượng và tách từng acid amin riêng biệt ra khỏi dung dịch thủy phân

1.3.5 Tác dụng sinh học và ứng dụng

L-cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc khoảng 14% và 12,1% trong sừng, ngoài ra nó còn chiếm một tỷ lệ ít hơn trong da (2 đến 4%) L-cystin tham gia vào quá trình tổng hợp Keratin (chất sừng) của tóc và móng Nó thúc

15

đẩy sự tăng sinh của tế bào mầm ở các vùng tạo chất sừng và có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của chúng Tác dụng này đã được chứng minh qua các thử nghiệm có đánh dấu bằng phóng xạ ở các nhân của tế bào mầm.

L-cystin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về lông, tóc, móng như : tóc móng dễ gẫy, chẻ; chống rụng tóc; hoạt hóa sự mọc tóc, chăm sóc và giúp cho tóc móng tăng trưởng Ngoài ra nó còn được sử dụng để điều trị các chứng ngứa và các bệnh lý biểu bì da, tóc, móng; sạm da, chàm, ban da, nổi

mề đay; viêm nhiễm mụn nhọt, trứng cá trên da

L-cystin thường xuất hiện dưới dạng các chế phẩm như: viên nang mềm

5 0 0 m g X 12 vỉ X 5 viên, viên nén bao film hộp 2 0 v iê n ,

Một số chế phẩm có trên thị trường hiện nay như : Blooming, L-cystin 500, có công dụng điều trị các bệnh về suy nhược cơ thể, các chứng liên quan đến da, tóc, biểu bì Liều lượng trung bình dành cho người lớn và trẻ em

trên 8 tuổi là 1 viên nang 500mg X 2 lần mỗi ngày, nên dùng liên tục 2-3 Iháng hoặc 10-20 ngày mỗi tháng

2 PHƯƠNG PHÁP ĐIỂU CHẾ :

2.1 Phương pháp điều chê theo V o g el:

• Nội dung phương pháp [19]

Thuỷ phân

Keratin -— -► HOOC-CH-CH2-S —S-CH2-CH-COOH

L-cystinCân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào 1000 ml hỗn hợp acid hydrochloric đặc và acid formic theo tỷ lệ 1:1 Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt

độ 120 C cho đến khi phản ứng Biurê trở nên âm tính (khoảng 20h) Tẩy màu bằng khoảng 12g than hoạt, lọc nóng và cô đặc dịch lọc đến khi tạo thành sirô

có khối lượng không đổi Hòa tan phần sirô trong 250ml nước cất, thêm từ từ

dung dịch Na acetat 50% cho đến khi dung dịch có pH khoảng từ 4-5 Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện Lọc lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng 50ml nước cất 60°c Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan trong 750ml acid hydrochloric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt Nếu dịch lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt Điều chỉnh dịch lọc đến pH -4-5 bằng Na acetat 50% Để yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng khoảng 5-6h Tủa xuất hiện Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng 50ml nước cất 60°c

Khối lượng L-cystin thu được: 25g Hiệu suất phản ứng: 5%.

Chú ỷ: Sản phẩm thô có thể chứa Tyrosin Một phần của nó được loại bởi than

hoạt và rửa bằng nước nóng Nhưng khi kết tinh lại có thể sản phẩm vẫn chứa Tyrosin nếu thời gian kết tinh để quá 5-6h

2.2.Phưưng pháp điều chế theo Gortner và Hoffman :

• Nội dung phương pháp [15]

Gortner và Hoffman tiến hành thí nghiệm với dung dịch acid HC1 20%, lượng acid sử dụng gấp 2-4 lẩn khối lượng tóc Sau khi tiến hành thủy phân được hỗn hợp các acid amin, tiến hành kết tinh L-cystin bằng cách đưa về điểm đẳng điện ở pH=5 Để trong 3 ngày, tủa xuất hiện Lọc lấy tủa, tiến hành tinh chế bàng dung dịch HC1 IM và chất hấp phụ bề mặt Kết quả thu được sản phẩm L-cystin thô Ở đây 2 tác giả không sử dụng acid HC1 đặc vì theo các ông dung dịch acid 20% là tương đối ổn định và ít gây nguy hiểm hơn so với acid đậm đặc Hiệu suất L-cystin thu được từ 4-5%

2.3 Các phương pháp điều chê khác :

Các tác giả này đã khảo sát phản ứng thủy phân tóc bằng acid HC1 đặc theo những cách khác nhau cụ thể như sau:

Trong bình cầu dung tích 1 lít cho 200g tóc khô sạch và một thể tích acid clohydric nồng độ 30% hoặc 37% theo tỷ lệ acid/tóc bằng 2:1 Hỗn hợp đun sôi với sinh hàn hổi lưu trực tiếp trên bếp điện trong thời gian 10 giờ Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, dung dịch thủy phân được trung hòa từ từ với dung dịch NaOH 30% đến pH = 5, thử phản ứng Biurê để xác định mức độ thủy phân Tủa đcn xuất hiện, để qua đêm, lọc và hòa tan trở lại trong acid

clohydric 5% Lọc để loại hợp chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HC1 5%

(chia 3 lẩn) Khử màu toàn bộ dung dịch lọc bằng cách đun nóng với 20g than

hoạt và lắc trong 1 giờ Lọc và rửa than bằng một ít HC1 5% Trung hòa dịch

lọc màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5 Để kết tủa trong 3- 4h, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại Tyrosin Sản phẩm thu được là L-cystin, có thể tinh chế bằng một lần hòa tan và kết tủa nữa Tủa được thử phản ứng Millon để xác định tạp chất Tyrosin Hiệu suất phản ứng là : 5%

2.3.2 Theo tác giả Bành Đức Lâm:

• Nội dung phương pháp [8]

Cho 1 kg tóc vào bình thủy phân 4 lít (có thể chia vào 5 bình nhỏ 1 lít) Thêm 2 lít HC1 37% Đậy kín Ngâm trong thời gian 1 tuần Tóc mòn ra thành dịch Tiến hành thủy phân cách thủy dưới sinh hàn hồi lưu Sau từng thời gian 2h, 4h, .14h, 16h lấy một lượng nhỏ dịch đang thủy phân, để nguội Thử phản ứng Biurc đến khi âm tính thì ngừng thủy phân, để nguội dịch thủy phân Trung hòa bằng dung dịch Na acctat 50% đến pH=5 Để kết tủa trong 4h Lọc lấy tủa bằng phễu hút chân không Hòa tan tủa trong 200ml HC1 5% Khử màu dung dịch bằng than hoạt (tỷ lệ than hoạt bằng 2% thể tích dịch lọc) : đun nóng dịch lọc đến 60°c cho than hoạt vào khuấy đều trong 30’ Để yên 3h Lọc loại than hoạt và rửa than bàng 50ml HC1 5% Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch Na acetat 50% đến pH=5 Để kết tủa 4h Lọc lấy tủa Rửa tủa

nhiều lần bằng nước nóng, sản phẩm thu được là L-Cystin thô Có thể tinh chế bằng cách hòa tan và kết tủa lần nữa Sấy ở nhiệt độ 60-70°C đến khô.

Hiệu suất sản phẩm thu được là: 5%

19

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ

1 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u :

1.1.Nguyên liệu:

Nguyên liệu chính được sử dụng để chiết xuất L-cystin là tóc Tóc được thu mua tại các hiệu cắt tóc Trước khi sử dụng nguyên liệu cần phải loại bỏ các tạp chất cơ học Đặc biệt khi rửa nguyên liệu cần chú ý loại bỏ các chất dầu mỡ và dầu tự nhiên Nên rửa sạch nguyên liệu bằng nước nhiều lần sau đó ngâm nguyên liệu trong nước xà phòng, vò kỹ Rửa lại cho hết xà phòng Đổ khô

Ngoài ra một nguyên liệu khác chứa hàm lượng L-cystin tương đối cao cũng được sử dụng là sừng trâu, bò Nguyên liệu này được thu mua từ các lò

mổ và những nơi chế biến đồ thủ công mỹ nghệ Dạng nguyên liệu là những phế phám không còn được sử dụng để gia công chế biến Trước khi sử dụng tiến hành loại bỏ phần tủy, rửa sạch, để khô

1.2.Hóa chất và thuốc thử :

Bảng 1: Bảng hóa chất và thuốc thử được sử dụng trong klióa luận