Khảo sát điều chế và một số chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ chế bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Kết quả định tính các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện chiết xuất khác nhau .... Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khảo sát điều chế và một s

Ô ĐỎ CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

Ký LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

Bộ môn Dược học cổ truyền –

Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2019

Trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ gia đình thầy cô, bạn bè Đầu tiên, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc

tới Đảng và Chính phủ nước Cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào và Cộng hòa

xã hội chủ nghĩa Việt Nam đã tạo điều kiện cho em được học tập và có điều

kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực hiện đề tài này trong suốt thời gian vừa qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Phạm Thái Hà Văn, người

thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất và trực tiếp giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khóa luận này

Em cũng xin gửi đến Bộ môn Dược học cổ truyền sự biết ơn vì đã cho em

cơ hội được học dược thực tập và hoàn thành khóa luận tại bộ môn

Em cũng xin b ày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân yêu nhất trong gia

đình như Bố Mẹ, cảm ơn bạn bè – những người luôn sát cánh, động viên, giúp

đỡ trong thời gian học tập cũng như làm khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên Sengkham CHOUMLIVONG

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Hà thủ ô đỏ 3

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật cây Hà thủ ô đỏ 3

1.1.2 Bộ phận dùng và cách chế biến 5

1.1.3 Thành phần hóa học 6

1.1.4 Tác dụng dược lý và công dụng 8

1.2 Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp quét hình ảnh (TLC-videoscan) 9

1.2.1 Nguyên tắc 9

1.2.2 Các đại lượng đặc trưng 9

1.2.3 Ứng dụng trong phân tích thành phần hóa học trong cao chiết Hà thủ ô đỏ 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 12

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phương pháp điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ 13

2.3.2 Phương pháp định tính 14

2.3.3 Phương pháp bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Hiệu suất và một số chỉ tiêu cảm quan cao khô Hà thủ ô đỏ 20

3.1.1 Các chỉ tiêu về cảm quan: 20

3.2 Kết quả định tính các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện

chiết xuất khác nhau 23

3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 25

3.3.1 Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống 25

3.3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của emodin 26

3.3.3 Độ lặp lại 28

3.4 Kết quả định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ 29

3.5 Kết quả tách các chất có trong mẫu cao 29

BÀN LUẬN 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học đã được xác định trong dược liệu Hà thủ ô đỏ 6

Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi 12

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ở quy trình chiết xuất 14

Bảng 2.3 Thể tích các vết chấm mẫu định tính 15

Bảng 2.4 Thể tích các vết chấm mẫu bán định lượng 16

Bảng 3.1 Kết quả chỉ tiêu cảm quan của các mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ 20

Bảng 3.2 Hiệu suất quy trình điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ với các điều kiện chiết xuất khác nhau (%) 21

Bảng 3.3 Chỉ tiêu hàm ẩm cao Hà thủ ô đỏ 22

Bảng 3.4 Thứ tự các vết trên bản mỏng định tính 23

Bảng 3.5 Kết quả định tính các pic sắc ký trong 10 mẫu cao chiết 24

Bảng 3.6 Nồng độ emodin chuẩn và diện tích pic đáp ứng 26

Bảng 3.7.Kết quả bán định lượng emodin trong các mẫu cao Hà thủ đỏ 29

Hình 1.1 Đặc điểm thực vật loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb) 4

Hình 3.1 Cao khô Hà thủ ô đỏ sau khi điều chế 20

Đồ thị 3.1.Hiệu suất điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện khác nhau 21

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ ở bước sóng 366 nm 23

Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát độ thích hợp hệ thống 25

Hình 3.4 Kết quả xây dựng đường chuẩn từ dãy nồng độ khảo sát 26

Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ khảo sát nồng độ tuyến tính của emodin 27

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại………28

Hình 3.7 Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng ở 254 nm 30

Hình 3.8 Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng ở 366 nm 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ thời xa xưa, ông cha ta đã có câu:

“Muốn cho xanh tóc, đỏ da

Rủ nhau lên núi, hái hà thủ ô”

Câu ca dao này đã nói lên được một phần nào đó công dụng tuyệt vời của hà thủ ô trong việc điều hoà khí huyết, bổ thần kinh, giúp đen tóc đẹp da, duy trì nét thanh xuân cho con người Hà thủ ô đỏ được xem như là một trong những thảo dược quý giá của Đông y với nhiều tên gọi khác nhau như dạ hợp, dạ giao đằng,

Bộ phận dùng của cây là phần rễ củ, có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới hạ, thần kinh suy nhược, sốt rét, bổ gan thận, đen râu tóc, Bộ phận trên mặt đất có tác dụng dưỡng tâm an thần, dưỡng huyết hoạt lạc,

Trong dân gian, người ta thường sử dụng Hà thủ ô đỏ dưới dạng chế, phương pháp truyền thống và cũng được ghi trong nhiều tài liệu cổ truyền chính thống như Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Cây cỏ Việt Nam, Vị thuốc Hà thủ ô đỏ

có thể được chế biến bằng cách ngâm với nước vo gạo rồi nấu với nước đậu đen Ngoài ra, còn nhiều phương pháp chế biến khác nhau cũng đã được nghiên cứu Để đánh giá chất lượng sản phẩm cao khô Hà thủ ô đỏ sau chế biến, cần thiết phải thực hiện chiết xuất và định lượng các thành phần quan trọng của sản phẩm sau khi chế biến

Sắc ký lớp mỏng là một trong những phương pháp phân tích khá đơn giản và hiệu quả, nhất là trong phân tích dược liệu Ngày nay, nhờ các thiết bị máy móc hiện đại, phương pháp sắc ký lớp mỏng ngày càng hiệu quả khi điều kiện chạy sắc

ký được chuẩn hóa Trong khuôn khổ đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Khảo sát điều chế và một số chỉ tiêu chất lượng cao khô hà thủ ô đỏ chế bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ” với 2 mục tiêu chính như sau:

(i) Điều chế được cao khô Hà thủ ô đỏ chế

(ii) Khảo sát định tính và bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ chế với các phương pháp sử dụng dung môi chiết khác nhau bằng phương pháp sắc

ký lớp mỏng

Tên khoa học là Fallopia multiflora Thunb

Tên đồng nghĩa: Reynoutria multiflora (Thunb.) Moldenke., Polygonum multiflorum (Thunb.) Haraldson, Fallopia multiflora (Thunb.) Czerep [26]

Hà thủ ô đỏ được phân loại thực vật học như sau:

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)

Họ Rau răm (Polygonaceae)

có màu xanh tía, có những vân hoặc bì khổng, mặt thân nhẵn, không có lông Lá mọc cách, so le, có cuống dài, phủ lông, bẹ chìa mỏng màu nâu nhạt, dài 3-5 mm Phiến lá hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 2,5 - 5 cm [7], hoặc hình trứng cỡ

3-7 x 2-5 cm [4], mũi nhọn ở đỉnh, đầu lá hình tim, hoặc hình mũi tên, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhẵn và không có lông Lá kèm mỏng, màu nâu nhạt ôm lấy thân

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, dài hơn lá; lá bắc ngắn;hoa nhỏ nhiều, màu trắng, nhị 8 với 3 nhị hơi dài hơn, thường dính vào gốc của bao hoa.Mùa hoa: Tháng 9 – 11 [3]

Quả bế, màu nâu đen, hình chop có 3 góc nhẵn bóng nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài còn lại phát triển thành cánh rộng.Mùa quả: Tháng12 – 2 [3], [4], [7] [8]

Hình 1.1 Đặc điểm thực vật loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora

(Thunb)

1.1.1.3 Phân bố

Hà thủ ô đỏ phân bố rộng rãi ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới Trên thế giới,

Hà thủ ô đỏ có ở Trung Quốc, miền Bắc của Lào ( Sầm Nưa), Nhật Bản và Ấn Độ

Ở Việt Nam,Hà thủ ô đỏ chỉ có ở một số tỉnh vùng núi cao (trên 1000 m) phía bắc Cây mọc nhiềuở Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La Các tỉnh khác ít gặp hơn như Hòa Bình(Mai Châu, Đà Bắc); Thanh Hóa (Son Bá Mười); Nghệ An (Kỳ Sơn); Lạng Sơn(núi Mẫu Sơn); Cao Bằng (Bảo Lạc); Yên Bái (Mù Cang Chải) Cây thường gặp dưới tán cây bụi, trong các rừng thưa ven suối hay ven đường râm mát

ở chân núi, khe đá Một số nơi cũng trồng nhỏ lẻ phục vụ nhu cầu nhân dân ở một

số tỉnh Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Phú Yên, Bình Định, [3], [4], [7]

Năm 2017, Phạm Thanh Huyền và Nguyễn Thị Hà Ly tiến hành nghiên cứu

Điều tra phân bố và đánh giá chất lượng nguồn gen hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora

(Thunb.) Haraldson) tại 8 tỉnh và thành phố ở Việt Nam đã xác định được một số điểm tập trung của Hà thủ ô đỏ là các xã thuộc 3 tỉnh Lào Cai (xã Bản Xèo, huyện Bát Xát; xã Sa Pả, xã Tả Phìn, huyện Sa Pa); tỉnh Hà Giang (xã Phó Bảng huyện Đồng Văn, huyện Xín Mần, xã Quyết Tiến huyện Quản Bạ); tỉnh Sơn La (xã Loong

Hẹ, xã Co Mạ, huyện Thuận Châu) [13]

Sách đỏ Việt Nam (2007) đã phân hạng loài Hà thủ ô đỏ (F multiflora

(Thunb.) Haraldson) vào phân hạng VU A1c,d với mức đánh giá là “sẽ nguy cấp” (V) [4]

1.1.2 Bộ phận dùng và cách chế biến

1.1.2.1 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng là rễ củ phơi khô của cây Hà thủ ô đỏ.Dược liệu là rễ củ phơi

hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ (F multiflora (Thunb.) Haraldson Syn Polygonum multiflorum (Thunb.)), họ Rau răm (Polygonaceae), được mô tả như

sau: rễ củ tròn hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, dài 6 cm đến 15 cm, đường kính 4 cm đến 12 cm; củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to Mặt ngoài màu nâu đỏ, có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Chất chắc, khó bẻ Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm

vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ Mùi nhẹ,vị hơi ngọt, hơi đắng và chát [6]

1.1.2.2 Chế biến

Rễ củ to, đường kính trên 6 cm, vỏ nâu sẫm, cứng chắc, nhiều bột, ít xơ Mùa thu hoạch vào tháng 8 Đào củ về, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, củ nhỏ để nguyên, củ to

bổ đôi, phơi hay sấy khô tới độ ẩm dưới 13% Hà thủ ô được chế như sau: rửa sạch

củ, ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại Đổ nước đậu đen cho ngập (cứ

1 kg Hà thủ ô cần 100 g đậu đen, 2 lít nước, nấu đến khi đậu đen nhừ nát), nấu đến khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều Khi củ đã mềm, lấy ra, bỏ lõi (nếu có) Thái hoặc cạo mỏng rồi phơi khô Nếu còn nước đậu đen thì tẩm phơi cho hết Nếu

đồ, phơi 9 lần (cửu chưng cửu sái) thì càng tốt Khi đun nên đặt vỉ ở đáy nồi cho khỏi cháy dược liệu [7]

1.1.3 Thành phần hóa học

Về thành phần hóa học, các nhóm hoạt chất chính đã được xác định có trong

Hà thủ ô đỏ bao gồm: anthranoid, flavonoid, stilben, protid, lipid, tinh bột, các chất

vô cơ, các chất tan trong nước khác và lexithin Trong đó các thành phần chính là anthranoid chiếm 1,7%, trong đó có emodin, chrysophanol, rhein, physcion , protid chiếm 1,1%, tinh bột 45,2%, lipid 3,1%, 4,5% chất vô cơ, và 26,4% các chất tan trong nước.Trong đó, nhiều hoạt chất đã được phân lập và xác định cấu trúc thuộc các nhóm stilben, anthranoid (cụ thể là các anthraquinon), và các flavonoid [19], [21], [16], [24] Các nghiên cứu về Hà thủ ô đỏ Nhật Bản ghi chép bởi Đỗ Tất Lợichỉ ra trong rễ củ có các hoạt chất bao gồm: anthranoid (1,7%) trong đó chủ yếu là chrysophanol, emodin và rhein Ngoài ra, còn có chất đạm (1,1%), tinh bột (45,2%), chất béo (3,10%), chất vô cơ (4,5%), các chất tan trong nước (26,4%), lexitin Nhóm anthranoid có tác dụng bổ máu,điều trị tóc bạc sớm,kích thích nhu động ruột, trị đau lưng, mỏi gối,chống lại tế bào ung thư…[3],[7]

Nghiên cứu của Lin 2015 thống kê các hoạt chất đã được phân lập và xác định cấu trúc trong Hà thủ ô đỏ, các hợp chất được thống kê trong Bảng 1.1[21]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học đã được xác định trong dược liệu Hà thủ ô đỏ

chất

Số lượng chất đã xác định được

Một số hoạt chất điển hình

Resveratrol, Rhaponticoside, Cis - 2, 3, 5,

4 - tetrahydroxystilbene - 2- O - β - D - glucoyranoside, Polygonumosides A, B,

C, D

Citreorosein - 8 - methyl ether, Fallacinol,

2 - acetylemodin, Physcion - 8 - O - β - D

- glucopyranoside, Chrysophanol - 8 - O -

β D glucopyranoside, 6methoxyl 2 acetyl – 3 - methyl - 1,4 – naphthoquinone – 8 -O – β – D - glucopyranoside, 2 – Methoxy – 6 -acethyl – 7 – methyliuglone

Kaempferol, Isoorientin, Apigenin, Hyperoside, Vitexin, Quercetin-3-O-arabinoside, Polygonflavanol A

Eicosane, Hexanoic, Hexadecanoic acid methyl ester, Hexadecanoic acid ethyl ester, Octadecanoic acid methyl ester , Octadecanoic acid ethyl, Ethyl oleate, Squalen…

5 Các hợp chất

khác

34 Catechin, Epicatechin, Acid gallic,

Methyl galate, Daucosterol, β-sitosterol,

…

Về công dụng, Trong y học cổ truyền Trung Quốc Hà thủ ô đỏ sống tươi và khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, tiêu ung thũng, chữa táo bón cho phụ nữ sau khi đẻ hoặc người già, mụn nhọt, ghẻ lở, eczema Có thể phối hợp với Hạ khô thảo, Kim ngân hoa,Hà thủ ô đỏ chế có tác dụng bổ gan thận, ích tinh huyết, dùng làm thuốc an thần, bổ và táng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, chóng mặt, tim hồi hộp, nhức đầu, mất ngủ, suy nhược thần kinh, còi xương, bệnh tạng rỉ dịch và để hồi phục sức khỏe cho người già sau khi bị bệnh (phối hợp với Sinh địa, Bạch thược, Cúc hoa), kích thích tạo hồng cầu và bạch cầu trong các bệnh về máu

và thiếu máu Còn dùng chữa đau mỏi chân tay, di tinh (phối hợp với Đương quy, Ngưu tất, Kỷ tử, Thỏ ty tử), chữa sốt rét lâu ngày, khí huyết suy nhược (phối hợp với Nhân sâm, Đương quy, Trần bì), giải nhiệt và lợi tiểu và làm chất sàn trong điều trị phối hợp chữa ỉa chảy [3]

Ở Ấn Độ, rễ Hà thủ ô đỏ được dùng làm thuốc bổ, chống bệnh scorbut và làm đen tóc Nó còn có tác dụng với bệnh tăng đường máu [3]

Đỗ Tất Lợi viết về vị thuốc Hà thủ ô với các công dụng chính làm thuốc bổ, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, ích huyết khỏe gân cốt, sống lâu, làm đen râu tóc [7]

Phạm Hoàng Hộ trong Cây cỏ Việt Nam có ghi công dụng Hà thủ ô đỏ như sau: Củ ăn được, bổ, trị liệt dương, làm giảm cholesterol và glucose/máu;

trấn thống, an thần, giúp ngủ; trị sốt; trị huyết bạch, có kinh khó, giảm đau, trị đau đầu gối, trị bướu, chống vi khuẩn thủy bào chẩn [12]

1.2.1 Nguyên tắc

Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng TLC xảy ra khi pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong TLC pha tĩnh được rửa một lớp mỏng lên giá đỡ phẳng Dưới tác dụng của lực mao quan, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát-nơi hỗn hợp các chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng trong quá trình di chuyển của pha động qua lóp mỏng chất hấp phụ (pha tĩnh) nhờ các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ khác nhau Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng

ra ở các vị trí khác nhau trên bảng mỏng.Tách bằng sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật tách các chất được tiến hành trên một lớp mỏng bao gồm các hạt có kích thước đồng nhất, một được kết dính trên giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion,… Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi lực mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [1]

1.2.2 Các đại lượng đặc trưng

- Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = 𝑑𝑅 𝑑𝑀⁄Trong đó:

dR: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động từ 0 đến 1

- Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 – 30 µm, được rải đều và kết dính

thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng

có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5 – 20 cm, nhiều khi có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích [1] Chất hấp phụ thường dùng nhất là các loại silica gel (>90%) rồi đến nhôm oxyd (<5%) Các loại khác (than hoạt, Polyamid, Florisil, Celite, Kieselguhr)…ít được sử dụng [6]

- Pha động cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có thể sử dụng cho TLC với pha tĩnh là silica hoặc alumina

1.2.3 Ứng dụng trong phân tích thành phần hóa học trong cao chiết Hà thủ ô đỏ

1.2.3.1 Định tính

Dựa vào sự xuất hiện hay không của các vết chất trên sắc ký đồ, người ta có thể xác định được sự có mặt hay không của một chất trong mẫu sắc ký (mẫu sắc ký có thể là dịch chiết toàn bộ hay bộ phận cây nào đó), từ đó kết luận sự có mặt hay không có mặt chất đó trong cây Mẫu đối chiếu có thể là chất chuẩn hay dược liệu chuẩn Với chất chuẩn, điều kiện xác định là trong mẫu thử phải xuất hiện vết trên sắc ký đồ có cùng Rf và màu sắc với chất chuẩn Với dược liệu chuẩn, điều kiện xác định là mẫu thử phải xuất hiện các vết có cùng Rf và màu sắc với các vết trong mẫu dược liệu chuẩn

1.2.3.2 Thiết lập dấu vân tay sắc ký

Trong cùng một chi hay một loài, dựa vào TLC/HPTLC, người ta có thể tìm ra các vết đặc trưng của chi hay loài đó bằng cách phân tích các mẫu khác nhau

của các loài trong chi trên cùng một bản mỏng ở cùng điều kiện để tìm ra các vết đặc trưng chung của chi đó và đặc trưng riêng của từng loài Vân tay sắc ký của một loài là tập hợp các vết luôn luôn có mặt trong sắc ký đồ của loài đó ở điều kiện sắc ký xác định, nó đặc trưng cho loài và được dùng để xác định loài

1.2.3.3 Bán định lượng

Bằng cách phân tích các mẫu cần nghiên cứu và các mẫu chất chuẩn/chất đối chiếu đã biết trước hàm lượng trên cùng một bản mỏng, sau đó khai triển trong cùng điều kiện, người ta có thể bán định lượng được hàm lượng một chất có trong mẫu nghiên cứu nhờ hệ thống phân tích chính xác và phần mềm xử lý dữ liệu videoscan

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Rễ củ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson), họ Rau răm

(Polygonacceae) đạt tiêu chuẩn DĐVN V

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm

bao gồm: Bộ máy phun mẫu bán tự động (dùng cho hệ thống sắc ký bản mỏng) Camag Linomat 5; máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer, 2 phần mềm winCATS và VideoScan

- Bể siêu âm WISD

- Bình triển khai sắc ký

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck)

- Tủ sấy WiseVen (R) WOF

2.1.2.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Hoá chất, dung môi

3 Chất đối chiếu emodin Chất chuẩn đối chiếu emodin được phân lập,

tinh chế từ dược liệu làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu (được cung cấp bởi Viện Dược liệu Việt Nam)

4 Chất đối chiếu stilbene Được cung cấp bởi Viện Dược liệu Việt

Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Điều chế được cao khô Hà thủ ô đỏ

- Xác định các chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ về cảm quan

- Xác định các chỉ tiêu chất lượng cao khô Hà thủ ô đỏ

- Khảo sát định tính và bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ chiết với các phương pháp sử dụng dung môi chiết khác nhau bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.2.1 Phương pháp điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ

2.2.1.1 Phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

Hà thủ ô đỏ được rửa sạch, ngâm nước lã 2-3 đêm Sau đó đem nấu với đậu đen theo tỷ lệ 1kg hà thủ ô đỏ : 0,2kg đậu đen : 2 lít nước, thái mỏng, sau đó đem sấy ở nhiệt độ 640C Sấy và tẩm cho hết dịch

2.2.1.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Dược liệu được chiết bằng phương pháp siêu âm Bột dược liệu được cân chính xác vào bình nón, sau đó thêm dung môi và đem siêu âm ba lần, mỗi lần 45 phút, ở nhiệt độ thuờng Các dung môi được khảo sát bao gồm: nước, cồn 50 độ và cồn 80

- Các mẫu khác nhau với các điều kiện chiết xuất khác nhau được ký hiệu trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thiết kế thí nghiệm khảo sát ở quy trình chiết xuất

- Các mẫu M1-M9 sau khi chiết ba lần đc gộp lại thu được dịch chiết tổng

- Các mẫu MS và M1-M9 cô thành cao đặc Đem sấy khô dưới 500

C tới khối lượng không đổi thu được cao khô.

Bước 2 Mẫu đối chiếu

- Chuẩn bị mẫu emodin dối chiếu: Cân chính xác khoảng 0,0010 g emodin đối chiếu vào bình định mức 10 ml Bổ sung dung môi EtOH tới vạch, được dung dịch gốc đối chiếu có nồng độ 0.1mg/ml

2.2.2.2 tiến hành định tính các chất trong cao chiết Hà thủ ô đỏ

ml)

M1 (0,4mg/

ml)

M2 (0,4mg/

ml)

m3 (0.4mg/

ml)

M4 (0,4mg/

ml)

M5 (0,4mg/

ml)

M6 (0,4mg/

ml)

M7 (0,4mg/

ml)

M8 (0,4mg/

ml)

M9 (0,4mg/ml)

2.2.3 Phương pháp bán định lượng emodin trong cao khô Hà thủ ô đỏ

2.2.3.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1 Mẫu thử (MS và M1-M9)

Cân chính xác khoảng 0,25 g cao khô cho vào bình nón nút mài 25ml, thêm

khoảng 8 ml EtOH, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường Sau đó, lọc sang bình định mức 10ml; bổ sung dung môi tới vạch Lấy dịch đem đi chấm sắc ký

Bước 2 Mẫu đối chiếu

- Chuẩn bị mẫu emodin dối chiếu: Cân chính xác khoảng 0,0010 g emodin đối chiếu vào bình định mức 10 ml Bổ sung dung môi EtOH tới vạch, được dung dịch gốc đối chiếu có nồng độ 0.1mg/ml Sau đó hút chính xác cùng một lượng

và pha loãng khác nhau dung dịch gốc đối chiếu để thu được dãy nồng độ lần lượt là 50 25 12,5 6,25 3,125 ( µg/ml ) từ dung dịch chuẩn gốc trên để xây dựng đường chuẩn

ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng là 1,5 cm Độ dài băng chấm 6 mm

- Hệ dung môi khai triển: Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

- Thể tích các vết chấm như bảng 2.4

ml)

M1 (0,400mg/

ml)

M2 (0,40mg/

ml)

M3 (0.40 mg/

ml)

M4 (0,40 mg/

ml)

M5 (0,40 mg/

ml)

M6 (0,40 mg/

ml)

M7 (0,40 mg/

ml)

M8 (0,40 mg/

ml)

M9 (0,40 mg/ml)

pháp bình phương tối thiểu [11] Đánh giá kết quả: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính Thông thường với giá trị r > 0,995 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [11]

2.2.3.3 Bán định lượng emodin trong cao chiết Hà thủ ô đỏ

- Hệ dung môi khai triển Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

- Thể tích các vết chấm như sau:

o Dãy dung dịch emodin đối 3,125 µg/ml: 2, 4, 6, 8, 10 µl

o Mẫu cao chiết Hà thủ ô sống: 10 µl

o Mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ chế (M1-M9):10 µl

- Bản mỏng sác ký sau khi khai triển thu được sắc ký đồ là hình ảnh các vết được tách nhau trên bản mỏng Xử lý kết quả bằng hệ thống chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer cùng 2 phần mềm winCATS và VideoScan sẽ giúp ta xác định được nồng độ các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ emodin của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ emodin trong các mẫu thử Từ đó tính hàm lượng emodin trong cao theo công thức:

m là khối lượng cao khô (g)

a là hàm ẩm của cao khô (%)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.1 Các chỉ tiêu về cảm quan:

Cao khô Hà thủ ô đỏ thu được có cảm quan như trong Hình 3.1 và Bảng 3.1

Hình 3.1 Cao khô Hà thủ ô đỏ sau khi điều chế

Bảng 3.1 Kết quả chỉ tiêu cảm quan của các mẫu cao khô Hà thủ ô đỏ

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

mịn, đồng nhất

đen

nâu đen

Nâu đen

nâu đen

Nâu đen

nâu đen

nâu đen

nâu đen

nâu đen

nâu đen

Vị đắng,

chát

3.1.2 Hiệu suất điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ

Các mẫu Hà thủ ô đỏ được chuẩn bị theo quy trình trong Bảng 2.2.Hiệu suất điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ thu được trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Hiệu suất quy trình điều chế cao khô Hà thủ ô đỏ với các điều kiện chiết

- Nhìn chung, khi tăng tỷ lệ dung môi chiết xuất: Hiệu suất điều chế cao khô với dung môi là nước tăng nhưng không đáng kể, hiệu suất điều chế cao khô với EtOH 50% giảm rõ rệt Với dung môi là EtOH 80%, khi tăng tỷ lệ dung môi từ 3/1 tới 6/1 thì hiệu suất điều chế cao khô giảm, sau đó tăng cao khi đạt tỷ lệ dung môi/dược liệu = 9/1

- Như vậy, ở tỷ lệ dung môi/dược liệu = 3/1, chiết xuất Hà thủ ô đỏ với EtOH 50% hoặc EtOH 80% ở tỷ lệ dung môi/dược liệu = 9/1 cho hiệu suất cao khô đạt cao nhất

- Hiệu suất điều chế cao khô đạt thấp nhất nếu chiết dược liệu với EtOH 80% tỷ lệ 6/1 hoặc EtOH 50% tỷ lệ 9/1

- Các chỉ tiêu về hàm ẩm: Hàm ẩm các mẫu cao Hà thủ ô được xác định có giá trị như trong Bảng 3.3

3.2 Kết quả định tính các chất có trong dược liệu Hà thủ ô đỏ ở các điều kiện chiết xuất khác nhau

Chấm các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ chế với các phương pháp theo quy trình trong Bảng 2.2 và emodin đối chiếu trên cùng một bản mỏng Thể tích chấm các vết như sau:

- Emodin đối chiếu 0.01mg/ml: 10 µl

- Cao chiết Hà thủ ô đỏ chưa chế biến (MS): 10 µl

- Cao chiết Hà thủ ô đỏ M1 – M9: 10 µl

Bảng 3.4 Thứ tự các vết trên bản mỏng định tính Vết 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ ở bước

sóng 366 nm

Nhận xét

Từ kết quả sắc ký đồ, quan sát ở các bước sóng 366 thu được kết quả về các vết với thông tin về màu sắc và giá trị Rf của các vết trên mỗi mẫu cao chiết tương ứng Kết quả được trình bày ở Hình 3.2 và Bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả định tính các pic sắc ký trong 10 mẫu cao chiết

ở bước sóng 366 nm

ST

T Rf

Màu sắc

Mẫu nghiên cứu

(+) : Trên sắc ký đồ xuất hiện vết có giá trị Rf tương ứng

(-) : Trên sắc ký đồ không xuất hiện vết có giá trị Rf tương ứng

Nhận xét:

Có một số mẫu như M1, M2, M3 không phát hiện emodin, còn các mẫu cao chiết như MS, M4, M5, M6, M7, M8 và M9 đều phát hiện có mặt của emodin, tuy cường độ vết khác nhau Mẫu MS và M4 có sắc ký đồ tương đối giống nhau, có cường độ và màu sắc emodin các vết là mạnh và rõ nhất

Một số mẫu cao chiết tuy có mặt emodin nhưng vết nhạt và không rõ như M5, M6, M7 Hai mẫu M8, M9 có hình ảnh sắc ký đồ không quá khác biệt

3.3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của emodin

Chấm trên cùng bản mỏng các thể tích tăng dần của dung dịch emodin chuẩn, kết quả biểu thị bởi đồ thị phụ thuộc giá trị diện tích pic với nồng độ emodin chuẩn Kết quả được trình bày trong Hình 3.5 và Bảng 3.5 Từ kết quả đó lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ emodin chuẩn trong Hình 3.4

Bảng 3.6 Nồng độ emodin chuẩn và diện tích pic đáp ứng

Đường chuẩn thu được như sau:

Hình 3.4.Kết quả xây dựng đường chuẩn emodin từ dãy nồng độ khảo sát

y = 8975.1x + 30270 R² = 0.9905

Phương trình đường chuẩn theo diện tích pic

3.3.3 Độ lặp lại

Chấm trên cùng bản mỏng một lượng mẫu thử như nhau, tiến hành sắc ký trong điều kiện cần khảo sát Mẫu thử được chọn là mẫu M4 do có sắc ký đồ rõ và đẹp nhất Kết quả thu được biểu thị bởi hình ảnh sắc ký đồ và giá trị Rf của các pic sắc ký trong mẫu thử (Hình 3.6 và phụ lục 5)

3.4 Kết quả bán định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ

Từ phương pháp định lượng ở trên, ghi nhận giá trị diện tích pic của các vết

và thu được nồng độ emodin trong các mẫu thử (phụ lục 5) Hàm lượng emodin trong các mẫu như sau:

Bảng 3.7 Kết quả định lượng emodin trong các mẫu cao Hà thủ đỏ

STT Mẫu

cao

Khối lượng (g)

Hàm ẩm (%)

Diện tích pic

Hàm lượng (%)

Trong các mẫu trên, hàm lượng emodin thu được trong mẫu M4 là cao nhất

Sau khi tiến hành định tính và định lượng, qua tính toán thấy mẫu cao Hà thủ

ô đỏ M4 chiết xuất theo phương pháp chiết Hà thủ ô đỏ đã chế biến (ngâm với nước, nấu với đậu đen) với EtOH 50%, tỷ lệ dung môi/dược liệu = 3/1, thu được nhiều vết nhất và hàm lượng emodin cao nhất

Kết quả tách các chất trên bản mỏng được trình bày ở Hình 3.6 và Hình 3.7

Hình 3.7 Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng

ở 254 nm

Hình 3.8 Sắc ký đồ tách các chất trong mẫu M4 trên bản mỏng

ở 366 nm

Chú thích:

12,13 Cao Hà thủ ô đỏ được chiết xuất từ Hà thủ ô đỏ chưa chế biến