Khảo sát thành phần hóa học của một số mẫu Hà thủ ô đỏ chế bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Định tính cao chiết Hà thủ ô đỏ trước và sau khi chế biến với các phương pháp khác nhau bằng TLC.. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có những nghiên cứu cụ thể đánh giá chất lượng sản

MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới Đảng và Chính phủ nước Cộng

hòa Dân chủ Nhân dân Lào và Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam đã tạo điều

kiện cho em được học tập và có điều kiện tham gia nghiên cứu khoa học, thực hiện

đề tài này trong suốt thời gian vừa qua

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

ThS Phạm Thái Hà Văn, người thầy đã trực tiếp giao cho em đề tài này, định

hướng, tận tình chỉ bảo và hỗ trợ em bằng bất cứ giá nào trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu Những kinh nghiệm, bài học quý giá cùng những tư duy nghiên cứu

mà thầy đã truyền cho em sẽ luôn luôn là hành trang không thể thiếu trong quá trình nghiên cứu khoa học tại trường và công tác sau này

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu, các thầy cô

giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt em suốt 5 năm học tập và nghiên cứu khoa học tại trường Mỗi thầy cô đều là những người truyền lửa cho em cố gắng phấn đấu học tập để hoàn thiện và phát triển bản thân mình

Cuối cùng, con xin cảm ơn Bố Mẹ là những người sinh thành, dưỡng dục, luôn

luôn quan tâm và động viên con hàng ngày và trong suốt thời gian xa nhà, học tập

và thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019

Sinh viên Vanasack Vanasack OUDOUMSIN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Cây Hà thủ ô đỏ 2

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Bộ phận dùng 4

1.1.4 Thành phần hóa học của Hà thủ ô đỏ 5

1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng 7

1.2 Các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ 8

1.2.1 Phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ theo DĐVN V 8

1.4.2 Các phương pháp chế biến khác 8

1.3 Vài nét về emodin và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 10

1.3.1 Tổng quan về emodin 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 12

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc Hà thủ ô từ các mẫu chế với các phương

pháp chế biến khác nhau 14

2.3.2 Phương pháp định tính 17

2.3.3 Phương pháp bán định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ bằng TLC – videoscan 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Hiệu suất và một số chỉ tiêu cảm quan cao chiết Hà thủ ô đỏ 22

3.1.1 Xác định các chỉ tiêu cảm quan 22

3.1.2 Xác định hàm ẩm cao chiết hà thủ ô đỏ 22

3.1.3 Hiệu suất điều chế cao chiết hà thủ ô đỏ 23

3.2 Định tính cao chiết Hà thủ ô đỏ trước và sau khi chế biến với các phương pháp khác nhau bằng TLC 24

3.2.1 Kết quả định tính bằng TLC các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ 24

3.3 Kết quả bán định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ trước và sau khi chế biến 28

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của emodin 28

3.3.2 Kết quả định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ 30

BÀN LUẬN 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EtOH: Ethanol

MeOH: Methanol

MS: Mẫu sống

SKLM: Sắc ký lớp mỏng

TLC: Thin Layer Chromatography

HPTLC: High Performance Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học đã được xác định trong Hà thủ ô đỏ 6

Bảng 1.2 Tập hợp các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ 8

Bảng 1.3 Độ tan của emodin trong một số dung môi hữu cơ 11

Bảng 3.1 Hàm ẩm các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ 23

Bảng 3.2 Tỷ lệ (%) cao đặc Hà thủ ô đỏ thu được 23

Bảng 3.4 Kết quả định tính các pic sắc ký trong 10 mẫu cao ở 366 nm 27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson 3

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của emodin 10

Hình 2.1 Mẫu Hà thủ ô đỏ trước khi chế bíến 12

Hình 2.2 Hệ thống máy sắc ký HPTLC hãng CAMAG 13

Hình 2.3 Sơ đồ quá trình chế biến Hà thủ ô đỏ 16

Hình 3.1 Thành phẩm cao Hà thủ ô đỏ 22

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở ng 254 nm 25

Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở ánh sáng trắng 25

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở 366 nm 26

Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký đồ khảo sát nồng độ emodin 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hà thủ ô đỏ là một dược liệu quý, được sử dụng với nhiều tên gọi khác nhau như dạ hợp, dạ giao đằng, Bộ phận dùng của cây là phần rễ củ, có tác dụng bổ máu, trị di tinh, đới hạ, thần kinh suy nhược, sốt rét, bổ gan thận, đen râu tóc, Bộ phận trên mặt đất có tác dụng dưỡng tâm an thần, dưỡng huyết, [8]

Xưa nay, dân gian ta thường sử dụng Hà thủ ô đỏ dưới dạng chế, phương pháp truyền thống và cũng được ghi trong nhiều tài liệu cổ truyền chính thống như Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Cây cỏ Việt Nam, là cửu chưng cửu sái Theo Dược điển Việt Nam V, vị thuốc Hà thủ ô đỏ có thể được chế biến bằng cách ngâm với nước vo gạo rồi nấu với nước đậu đen Ngoài ra, còn nhiều phương pháp chế biến khác nhau cũng đã được nghiên cứu [5], [8], [11]

Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có những nghiên cứu cụ thể đánh giá chất lượng sản phẩm cao khô Hà thủ ô đỏ sau chế biến của các phương pháp khác nhau này, do đó chưa có những bằng chứng tin cậy về mặt khoa học giải thích và so sánh kết quả của chất lượng sản phẩm Hà thủ ô đỏ sau khi chế biến

Sắc ký lớp mỏng là một trong những phương pháp phân tích khá đơn giản và hiệu quả, nhất là trong phân tích dược liệu Ngày nay, nhờ các thiết bị máy móc hiện đại, phương pháp sắc ký lớp mỏng ngày càng hiệu quả khi điều kiện chạy sắc ký được chuẩn hóa Nhằm khảo sát và so sánh hiệu quả của các phương pháp chế biến khác nhau với dược liệu Hà thủ ô đỏ bằng cách ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng thiết bị hiện đại kết hợp với phần mềm video scan, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của một số mẫu Hà thủ ô đỏ chế bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng” với 2 mục tiêu sau:

1 Định tính và so sánh thành phần hóa học của các mẫu cao trước và sau chế biến bằng SKLM

2 Bán định lượng emodin trong các mẫu cao trước và sau chế biến

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây Hà thủ ô đỏ

1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại

Cây Hà thủ ô đỏ hay còn gọi là thủ ô, giao đằng, dạ hợp, địa tinh, khua lình (Thái), mãn đăng tua lình (Lào-Sầm Nưa), mần đăng ón (Thổ) [15]

Tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

Tên đồng nghĩa: Reynoutria multiflora (Thunb.) Moldenke, Polygonum

multiflorum, Fallopia multiflora (Thunb.) Czerep, chi Fallopia, thuộc họ Rau răm

(Polygonaceae) Hệ thống phân loại thực vật của cây Hà thủ ô đỏ được tóm tắt như sau:

Hoa nhỏ, hợp thành chùy ở nách lá hay ở ngọn, có nhiều nhánh Hoa nhiều, nhỏ, mọc ở nách các lá bắc ngắn Hoa lưỡng tính, màu trắng hoặc lục nhạt Đường kính hoa 2mm, có cuống ngắn 1-3 mm Bao hoa 5 mảnh Không bằng nhau, 3 mảnh phía ngoài to hơn và đồng trưởng với quả Nhị 8, ngắn hơn bao hoa, với 3 nhị hơi dài hơn Bầu thượng, hình trứng hay hình 3 cạnh, vòi nhụy ngắn gồm 3 cái rời nhau, nuốm hình mào gà, rũ xuống

Quả bế, màu nâu đen, hình chop có 3 góc nhẵn bóng nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài còn lại phát triển thành cánh rộng

Mùa hoa tháng 7-10, mùa quả tháng 9-12 [4], [7], [8], [12], [14]

Hình 1.1 Hình ảnh loài Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson

Theo bản mô tả và khóa phân loại các thứ của loài Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson hiện có 3 thứ gồm: Fallopia multiflora var multiflora (Thunb.) Haraldson; Fallopia multiflora var angulata (S.Y Liu) H J Yan, Z J Fang & S

X Yu và Fallopia multiflora var ciliinervis (Nakai) Yonek & H.Ohashi với đặc

điểm cụ thể như sau

(1) F multiflora var multiflora: Thiết diện thân tròn; thân và gân lá nhẵn, không

có gai thịt

(2) F multiflora var ciliinervis: Thiết diện thân tròn, thân nhẵn không có gai

thịt, có gai thịt ở gân lá mặt dưới hoặc gân lá ở cả hai mặt, gai thịt dài từ 0,1 -0,15mm Trên các gờ dọc thân cũng có thể có gai thịt

(3) F multiflora var angulate: Thiết diện nhánh hình vuông, hoặc hình đa giác

(tùy thuộc vào vị trí của thân); gân lá nhẵn

Sách đỏ Việt Nam (2007) đã phân hạng loài Hà thủ ô đỏ (F multiflora (Thunb.)

Haraldson) vào phân hạng VU A1c, d với mức đánh giá là “sẽ nguy cấp” (V) [3] Hiện nay, để phục vụ nhu cầu sử dụng vị thuốc, nhiều nơi ở Việt Nam và Lào đều có những vùng tự trồng Hà thủ ô đỏ rải rác ở các địa phương

1.1.3 Bộ phận dùng

Dược liệu là rễ củ phơi hay sấy khô của cây Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora

(Thunb.) Haraldson, họ Rau răm (Polygonaceae), được mô tả như sau: rễ củ tròn hoặc hình thoi, không đều, củ nhỏ để nguyên, dài 6cm đến 15cm, đường kính 4cm đến 12cm; củ to bổ đôi theo chiều dọc, hay chặt thành từng miếng to Mặt ngoài màu

nâu đỏ, có những chỗ lồi lõm do các nếp nhăn ăn sâu tạo thành Chất chắc, khó bẻ Mặt cắt ngang có lớp bần mỏng màu nâu sẫm, mô mềm vỏ màu đỏ hồng, có nhiều bột, ở giữa có ít lõi gỗ Mùi nhẹ,vị hơi ngọt, hơi đắng và chát [6], [17]

1.1.4 Thành phần hóa học của Hà thủ ô đỏ

Vị thuốc là rễ củ của cây Hà thủ ô đỏ Fallopia multiflora Thunb Thành phần

hóa học gồm có anthranoid 1,7% (trong đó có emodin, chrysophanol, physcion, rhein), tanin (acid gallic, (+) catechin, (+) epicatechin), lipid 3,1%, protid 1,1%, tinh bột 42,2%, chất vô cơ 4,5% Hợp chất 2,3,5,4' - tetrahydoxystilbene-2-O-beta-D-glucoside có trong thành phần của thuốc làm mọc tóc, hàm lượng trung bình trong

rễ là 1-3% [16], [19], [23], [28]

Một nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký đã phân lập và tinh chế được 8 hợp chất từ rễ hà thủ ô đỏ là: emodin, chrysophanol, rhein, 6-OH-emodin, emodin-8-beta-D-glucoside, polygonimitin B, 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-beta-D-glucoside, và acid gallic Các nghiên cứu về Hà thủ ô Nhật Bản ghi chép bởi Đỗ Tất Lợichỉ ra trong rễ củ có các hoạt chất bao gồm: Anthranoid (1,7%) trong đó chủ yếu

là chrysophanola, emodin và rhein Ngoài ra, còn có chất đạm (1,1%), tinh bột (45,2%), chất béo (3,10%), chất vô cơ (4,5%), các chất tan trong nước (26,4%), lexitin [14]

Nghiên cứu của Lin 2015 thống kê các hoạt chất đã được phân lập và xác định cấu trúc trong Hà thủ ô đỏ được thống kê trong Bảng 1.3 [15], [19], [23]

Bảng 1.1 Thành phần hóa học đã được xác định trong Hà thủ ô đỏ

STT Nhóm hoạt chất Hàm

lượng Một số chất điển hình

1 Anthranoid

1,7 % emodin, chrysophanol, physcion, rhein, aloe

emodin, citreorosein, , fallacinol, 2 acetylemodin, physcion - 8 - O – β – D -glucopyranoside, chrysophanol – 8 - O - β – D - glucopyranoside,

-2 Tanin acid gallic, (+) catechin, (+) epicatechin

3 Stilben 2, 3, 5, 4-tetrahydroxystilbene

2 - O - β - D - glucopyranoside, polydatin, resveratrol, rhaponticoside,

4 Flavonoid tricin, rutin, luteolin, quercetin, kaempferol,

isoorientin, apigenin, hyperoside, vitexin, quercetin-3-o-arabinoside, polygonflavanol

10 Phospholipid Phosphatidyl ethanolamine, Copaene,

Eicosane, Hexanoic, Hexadecanoic acid methyl ester, Hexadecanoic acid ethyl ester, Octadecanoic acid methyl ester, Octadecanoic acid ethyl, Ethyl oleate, Squalen…

Về tác dụng dược lý, hiện nay các nghiên cứu đã chỉ ra vị thuốc Hà thủ ô đỏ

có các nhóm tác dụng chính như sau: hiệu quả chống lão hóa, hiệu ứng miễn dịch, tác dụng chống tăng mỡ máu, tác dụng bảo vệ gan, tác dụng chống lại tế bào ung thư, tác dụng chống viêm và nhiều tác dụng khác [13], [24], [25], [27], [30]

Về công dụng, Hà thủ ô đỏ là một vị thuốc đã được sử dụng rất lâu đời trong nền Y học dân tộc cổ truyền Người xưa dùng hà thủ ô đỏ làm thuốc bổ gan thận, bổ máu, thuốc dùng cho những người có râu tóc bạc sớm, lưng gối đau mỏi, di tinh, đại tiện ra huyết, ung nhọt, tràng nhạc, thần kinh suy nhược, sốt rét lâu ngày Ngày dùng

12 – 20g dưới dạng thuốc sắc, rượu thuốc, dùng với hà thủ ô đã chế biến Dây hà thủ

ô dùng làm thuốc an thần, thuốc cầm mồ hôi Dùng ngoài trị lở ngứa Đỗ Tất Lợi viết

về vị thuốc Hà thủ ô với các công dụng chính làm thuốc bổ, trị thần kinh suy nhược, các bệnh về thần kinh, ích huyết khỏe gân cốt, sống lâu, làm đen râu tóc [15], [17] Phạm Hoàng Hộ trong Cây cỏ Việt Nam có ghi công dụng Hà thủ ô đỏ như sau:

Củ ăn được, bổ, trị liệt dương, làm giảm cholesterol và glucose/máu; trấn thống, an thần, giúp ngủ; trị sốt; trị huyết bạch, có kinh khó, giảm đau, trị đau đầu gối, trị bướu, chống vi khuẩn thủy bào chẩn [10]

1.2 Các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

1.2.1 Phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ theo DĐVN V

Củ thu hoạch vào mùa thu, khi lá khô úa, đào lấy củ cắt bỏ hai đầu, rửa sạch, củ

to cắt thành miếng, phơi hay sấy khô Nếu đồ chín rồi phơi thì tốt hơn Trước khi

dùng thường nấu, đồ với đậu đen

Chế Hà thủ ô: Rửa sạch củ, ngâm nước vo gạo 1 ngày 1 đêm, sau đó rửa lại

Đổ nước đậu đen cho ngập (cứ 1 kg Hà thủ ô cần 100 g đậu đen, 2 lít nước, nấu đến khi đậu đen nhừ nát), nấu đến khi gần cạn, cần đảo luôn cho chín đều Khi củ đã mềm, lấy ra, bỏ lõi (nếu có) Thái hoặc cạo mỏng rồi phơi khô Nếu còn nước đậu đen thì tẩm phơi cho hết Nếu đồ, phơi 9 lần (cửu chưng cửu sái) thì càng tốt Khi đun nên đặt vỉ ở đáy nồi cho khỏi cháy dược liệu [6]

1.4.2 Các phương pháp chế biến khác

Vũ Văn Điền và cộng sự năm 1995 đã tiến hành nghiên cứu về các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ trong các tài liệu và trên thực tế ở một số địa phương thống kê lại có 16 phương pháp hay được sử dụng (Bảng 1.2) [8]

Bảng 1.2 Tập hợp các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ

STT Phương pháp chế biến

1 Hà thủ ô đỏ được thái phiến mỏng 1 – 2 mm, phơi khô để dùng

2 Hà thủ ô đỏ ngâm nước, ủ mềm, thái phiến mỏng 1 – 2 mm, phơi khô để dùng

3 Hà thủ ô đỏ tẩm rượu, ủ mềm, thái phiến mỏng phơi khô để dùng

4 Hà thủ ô đỏ tẩm rượu, ủ kỹ, thêm nước ngập, chưng chín, thái phiến

mỏng, phơi tẩm nhiều lần cho hết dính

5 Hà thủ ô đỏ chưng với nước, ủ lại chưng làm nhiều lần, thái phiến phơi khô, tẩm nhiều lần cho hết dịch

6 Hà thủ ô đỏ nấu với nước 4 – 6h, thái phiến phơi khô

7 Hà thủ ô đỏ chưng với nước đậu đen 2 – 4h, ủ lại chưng nhiều lần, thái phiến phơi khô, ủ nhiều lần cho hết dịch

8 hà thủ ô đỏ nấu kỹ với nước đậu đen cặn còn 50% nước, đem chưng 8h sau đó thái phiến phơi khô tẩm nhiều lần cho hết dịch

9 Hà thủ ô đỏ nấu với đậu đen đã sao thơm 8h, lấy ra phơi khô qua, chưng tiếp, sau đó thái phiến phơi khô

10 Hà thủ ô đỏ nấu với nước đậu đen và nước gạo rang ngày nấu đêm phơi sương, sau đó thái phiến phơi khô tẩm nhiều lần cho hết dịch

11 Hà thủ ô đỏ nấu với nước đậu đen chín kỹ, thêm rượu ủ 4h, chưng 24h, thái phiến phơi tẩm nhiều lần cho hết dịch

12 Hà thủ ô đỏ chưng với nước đậu đen và rượu 10h, thái phiến phơi tẩm nhiều lần cho hết dịch

13 Hà thủ ô đỏ nấu kỹ với nước đậu đen, sinh khương, thái phiến phơi khô tẩm nhiều lần cho hết dịch

14 Hà thủ ô đỏ nấu với nước đậu đen, cam thảo 12h, thái phiến phơi khô, tẩm cho hết dịch

15 Hà thủ ô đỏ nấu với nước sắc thục 4h, thái phiến phơi khô, tẩm cho hết dịch

16 Hà thủ ô đỏ ngâm nước vo gạo 24h, nấu với nước đậu đen đến mềm ra,

bỏ lõi, thái phiến phơi khô, tẩm cho hết dịch

Như kết quả nghiên cứu, các phương pháp chế biến Hà thủ ô đỏ rất phong phú, tùy theo quan niệm và kinh nghiệm ở các nơi khác nhau Các phụ liệu được dùng để chế biến Hà thủ ô đỏ gồm có: đậu đen, nước gạo rang, nước vo gạo, sinh khương, cam thảo, nước sắc thục, tuy nhiên hay dùng hơn cả là nước đậu đen Cùng với sự

đa dạng về phụ liệu, các thủ thuật chế biến được sử dụng cũng đa dạng, như ngâm,

ủ, tẩm, đồ, chưng, nấu, Các phương pháp khác nhau là do có sự phối hợp các thủ thuật và các nguyên liệu chế biến khác nhau

1.3 Vài nét về emodin và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Emodin có cấu trúc hóa học như hình

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của emodin

Tên khoa học: 1, 3, 8 – trihydroxy – 6 – methyl – 1,9,10 – anthracenedion

Tính chất:

- Bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam

- Nhiệt độ nóng chảy khoảng 2560C – 2570C

- Không tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ (ether, ether dầu hỏa, chloroform, benzene, aceton, acid acetic băng) Tan trong dung dịch kiềm, dung dịch natri carbonat, dung dịch ammoniac

- Độ tan của emodin trong một số dung môi hữu cơ ở 250C (tính theo g/100ml dung môi) được thể hiện ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Độ tan của emodin trong một số dung môi hữu cơ

STT Dung môi hữu cơ Độ tan của Emodin (g/100ml)

1.3.1.2 Một số nghiên cứu về emodin

Emodin là một hợp chất nhóm anthraquinon đã được tìm thấy trong 17 họ thực vật trên toàn thế giới, trong đó tiêu biểu là họ Polygonaceae và Rhamnaceae Trong

họ Polygonaceae, các nghiên cứu đã phát hiện ra emodin và các anthraquinon khác

không chỉ có mặt trong Hà thủ ô đỏ mà còn có mặt trong rất nhiều loài như Fallopia

bohemica, Fallopia japonica, Reynoutria japonica, Fallopia sachalinensis, P auberti, P culiinerve, P Cuspidatum [20], [21], [24], [26], [28], [29] Trong y học

cổ truyền Trung Quốc và Nhật Bản, người ta sử dụng các loài này trong điều trị tăng

mỡ máu, viêm da mủ, lậu Các hợp chất đã được phân lập cùng emodin được báo cáo thuộc nhóm dẫn xuất anthraquinon có thể kể đến như: emodin, physcion, glycosid của physcion và emodin, dẫn xuất stilben, bao gồm: resveratrol, acid chrysophanic (1,8- dihydroxy-3-methyl-9,10-anthracenedion), [23], [25], [27], [28]

Về tác dụng sinh học, nhiều kết quả nghiên cứu đã báo cáo rằng emodin là một trong những hoạt chất chính nhóm anthraquinon có đặc tính chống ung thư Nghiên cứu của Hsu H Y., Kapchan S M và cộng sự báo cáo emodin có hoạt tính chống lại bệnh bạch cầu lympho ở chuột [20], [22] Nhiều nghiên cứu khác cũng chỉ ra các chất hiệu quả chính trong việc tạo nên tác dụng ức chế tế bào ung thư được cho là anthraquinon, tiêu biểu là emodin và aloe-emodin [23], [24], [25]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Nguyên liệu nghiên cứu là rễ củ Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) đã được rửa sạch, thái mỏng Hà thủ ô đỏ (Fallopia multiflora (Thunb.)

được sử dụng đật tiêu chuẩn DĐVN IV

Hình 2.1 Mẫu Hà thủ ô đỏ trước khi chế bíến

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1.Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm

- Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG bao gồm: Bộ máy phun mẫu bán tự động (dùng cho hệ thống sắc ký bản mỏng) Camag Linomat 5; máy triển khai sắc ký bản mỏng Camag ADC 2; máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer, 2 phần mềm winCATS và VideoScan

Hình 2.2 Hệ thống máy sắc ký HPTLC hãng CAMAG

- Bể siêu âm WISD

- Bình triển khai sắc ký

- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merck)

- Tủ sấy WiseVen (R) WOF

2.1.2.2 Hóa chất

- Ethanol, nước cất, toluen, acid acetic

- Chất đối chiếu Emodin: chất chuẩn đối chiếu emodin được phân lập, tinh chế

từ dược liệu làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu (được cung cấp bởi Viện Dược liệu Việt Nam)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chế biến Hà thủ ô đỏ bằng các phương pháp khác nhau

- Định tính và so sánh thành phần hóa học của các mẫu cao trước và sau chế biến bằng SKLM

- Bán định lượng emodin trong các mẫu cao trước và sau chế biến

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp điều chế cao đặc Hà thủ ô từ các mẫu chế với các

phương pháp chế biến khác nhau

2.3.1.1 Quy trình chế biến

Có 10 mẫu Hà thủ ô đỏ được chế biến như sau:

- Mẫu 1: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước lã qua đêm, thái mỏng rồi mang

đi sấy khô

- Mẫu 2 và 3: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước lã trong vòng 7 ngày, mang

đi nấu với nước đậu đen với tỷ lệ HTOĐ (H) : đậu đen (Đ) : nước (N) = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit) đến khi cạn và chia ra thành 2 phần gồm phần một 1kg (mẫu 2) để nguyên

và phần hai 1kg (mẫu 3) mang đi nấu tiếp với nước đậu đen với tỷ lệ H : Đ : N = 1 : 0,1 : 4 (kg/kg/lit)

- Mẫu 4: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước vo gạo qua đêm rồi nấu nước đậu đen như DĐVN V theo đúng tỷ lệ H : Đ : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit)

- Mẫu 5 và 6: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước lã trong vòng 1 tuần, sau đó đem đi nấu nước lã với tỷ lệ H : N = 1 : 2 (kg/lit), sau đó chia ra thành 2 phần, phần đầu 0,75 kg (mẫu 5) để nguyên và phần hai 0,75 kg (mẫu 6) mang đi nấu với nước đậu đen tiếp với tỷ lệ H : Đ : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit)

- Mẫu 7 và 8: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước lã trong vòng 1 tuần, mang

đi nấu nước muối NaCl 5% (M) với tỷ lệ H : M : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit) Thu được 1,5kg, sau đó chia ra thành 2 phần, phần một 0,75 kg (mẫu 7) để nguyên và phần hai 0,75 kg (mẫu 8) mang đi nấu với nước đậu đen với tỷ lệ H : H : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit)

- Mẫu 9 và 10: Rễ củ Hà thủ ô rửa sạch, ngâm nước lã trong vòng 1 tuần, mang

đi nấu nước vo gạo (G) với tỷ lệ H : G : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit) Sau đó chia ra hai phần, phần đầu 0,75 kg (mẫu 9) để nguyên còn phần hai 0,75 kg (mẫu 10) mang đi nấu với nước đậu đen với tỷ lệ H : Đ : N = 1 : 0,1 : 2 (kg/kg/lit)

Hình 2.3 Sơ đồ quá trình chế biến Hà thủ ô đỏ

Hà thủ ô sống, rửa sạch

Ngâm nước gạo qua đêm Ngâm nước lã một tuần

Ngâm nước lã qua đêm

Nấu nước đậu đen (H:Đ:N=1:1:2)

Nấu nước lã (H:N=1:2)

Nấu nước vo gạo (H:G:N=1:0,1:2)

Nấu nước đậu đen (H:Đ:N=1:0,1:2)

Nấu nước muối (H:M:N=1:0,1:2)

Nấu nước đậu đen (H:Đ:N=1:0,1:4)

Nấu nước đậu đen (H:Đ:N=1:0,1:2)

Để

nguyên

Để nguyên

Để nguyên

Để nguyên

M1

M3 M2

M4

M10 M8

2.3.1.2 Xác định một số chỉ tiêu chất lượng cao

- Quan sát, mô tả tính chất cao đặc về cảm quan

 Thể chất, độ đồng nhất: Cho cao lên lam kính, đặt la men lên trên ép sát đem soi dưới kính hiển vi, kiểm tra độ đồng nhất

 Màu sắc: Lấy 1 g cao cho lên một tờ giấy trắng hoặc mặt kính đồng hồ không màu, đặt lên tờ giấy trắng, quan sát

 Mùi: Trên một mặt kính đồng hồ, đường kính từ 6 -8 cm, lấy 0,5 – 2,0 g cao trải thành lớp mỏng, sau 15 phút, xác định mùi

 Vị: Xác định bằng cảm quan

- Tỷ lệ cao chiết được tính theo công thức

H (%) = Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối Khối lượng cao khô tuyệt đối × 100%

- Xác định hàm ẩm cao đặc: Tiến hành theo Phụ lục 9.6 (PL – 203) DĐVN V: Lấy khoảng 1g cao đặc sấy ở nhiệt độ 1000C đến khối lượng không đổi (chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0,5 mg), làm 3 lần với mỗi mẫu rồi tính kết quả trung bình

2.3.2 Phương pháp định tính

2.3.2.1 Phương pháp chiết xuất bột dược liệu:

Tất cả các mẫu (10 mẫu) sau khi nấu xong mang ra thái thành miếng nhỏ

và mỏng rồi mang đi sấy khô ở 600C tới khối lượng không đổi, vừa sấy vừa tẩm với gạn phần dịch còn lại của từng mẫu Sau khi sấy khô mang đi nghiền thành bột tương đối mịn Nghiền nhỏ dược liệu bằng thuyền tán, bột dược liệu được rây qua rây 500 µm

Cân 150g bột dược liệu cho vào bình nón 500 ml, thêm 450 ml dung môi EtOH 96% Siêu âm ba lần, mỗi lần 45 phút ở nhiệt độ thường Dịch chiết của ba lần được gộp chung lại sau đó đem cô thu hồi dung môi ở áp suất giảm tới cắn bằng máy cất quay Cắn được đem sấy khô tới khối lượng không đổi thu được cao đặc

2.3.2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1 Mẫu thử

- Cân chính xác khoảng 0,25 g cao khô cho vào bình nón 250 ml, thêm khoảng 8 ml EtOH, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường Sau đó, lọc sang bình định mức 10ml, bổ sung dung môi tới vạch

Bước 2 Mẫu chuẩn

- Chuẩn bị mẫu chuẩn emodin: Cân chính xác khoảng 0,0010g emodin chuẩn vào bình định mức 10 ml Bồ sung dung môi EtOH tới vạch được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch chuẩn ở nồng độ lần lượt

là 50 25 12,5 6,25 3,125 ( µg/ml ) từ dung dịch chuẩn gốc trên

2.3.2.3 Tiến hành định tính các chất trong cao Hà thủ ô đỏ bằng TLC

- Bản mỏng được hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút Tiến hành đưa mẫu lên bản mỏng bằng máy chấm mẫu Linomat 5 Vị trí chấm mẫu cách mép dưới bản mỏng 1,0 cm, cách mép dung môi từ 0,8 - 1 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng

và mép ngoài bản mỏng là 1,5 cm Độ dài băng chấm 6 mm

- Hệ dung môi khai triển Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

- Thể tích các vết chấm như sau:

o Mẫu chuẩn emodin nồng độ 0,01 mg/ml: 10 µl

o Mẫu dược liệu chưa chế biến nồng độ 0,50 mg/ml : 10 µl

- Mẫu dược liệu đã chế biến có nồng độ 0,50 mg/ml : 10 µl

- Sắc ký đồ sau khi khai triển được phát hiện vết ở bước sóng 254nm,

366nm, hiện màu bằng hơi NH3 và quan sát ở ánh sáng khả kiến

Sau khi khai triển thu được sắc ký đồ là hình ảnh các vết được tách nhau trên bản mỏng Xử lý kết quả bằng hệ thống chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu hình ảnh Camag TLC Visualizer cùng 2 phần mềm winCATS và VideoScan sẽ giúp ta xác định được sự có mặt các vết với Rf tương ứng trên sắc ký đồ

2.3.3 Phương pháp bán định lượng emodin trong cao Hà thủ ô đỏ bằng TLC – videoscan

2.3.3.1.Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ được chế biến bằng các phương pháp theo sơ đồ ở Hình 2.3, sau đó chiết xuất với EtOH 96%, 3 lần, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 3/1 (thể tích/ khối lượng)

2.3.3.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bước 1 Mẫu thử

- Cân chính xác khoảng 0,25 g cao chiết cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 8 ml EtOH, siêu âm 30 phút ở nhiệt độ thường Sau đó, bổ sung dung môi tới vạch Lắc đều Lọc qua giấy lọc Dịch lọc thu được đem đi chấm sắc ký

Bước 2 Mẫu đối chiếu

- Pha dung dịch đối chiếu gốc emodin: Cân chính xác khoảng 0,0010g emodin đối chiếu vào bình định mức 10 ml Bổ sung dung môi EtOH tuyệt đối tới vạch, thu được dung dịch gốc có nồng độ 0,1 mg/ml

- Pha dãy dung dịch emodin đối chiếu để xây dựng đường chuẩn: Từ dung dịch gốc, hút chính xác 5ml cho vào bình định mức 10 ml, bổ sung dung môi tới vạch Làm như vậy 5 lần thu được một dãy dung dịch có nồng độ tương ứng 3,125 µg/ml; 6,25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml để xây dựng đường chuẩn emodin

cm, cách mép dung môi từ 0,8 - 1 cm Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép

ngoài bản mỏng là 1,5 cm Độ dài băng chấm 6 mm

- Hệ dung môi khai triển: Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

- Thể tích các vết chấm như sau

o Mẫu chuẩn emodin nồng độ 0,01 mg/ml: 10 µl

o Các mẫu dược liệu chế biến (M1-M10) 0,5 mg/ml: 10 µl

Bản mỏng sắc ký thu được sau khi khai triển được đem đi phát hiện vết ở ánh sáng có bước sóng 254nm, 366nm, và hiện màu bằng hơi NH3 – quan sát ở dưới ánh sáng khả kiến

2.3.3.4 Thẩm định phương pháp

a) Độ thích hợp của hệ thống:

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu dung dịch emodin đối chiếu có nồng độ 0,01 mg/ml Chấm sắc ký 6 lần dung dịch emodin, triển khai TLC [1] Đánh giá: Tính RSD của diện tích pic, chiều cao pic, Rf Giá trị RSD của diện tích (chiều cao, Rf) pic giữa các lần chấm mẫu (n > 5) nên nhỏ hơn 2,0% [36]

b) Tính tuyến tính:

Cách tiến hành: Chuẩn bị chấm sắc ký TLC dãy dung dịch mẫu để xây dựng đường chuẩn với nồng độ: 3,125; 6,25; 12,5; 25,0; 50,0 (µg/µl) tương ứng với thể tích chấm mẫu lần lượt là 2, 4, 6, 8, 10 µl dung dịch emodin đối chiếu nồng độ 3,125 µg/µl Tiến hành triển khai TLC với dãy dung dịch đường chuẩn trên Xây dựng phương trình đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu [9]

Đánh giá kết quả: Dựa vào hệ số tương quan r của đường chuẩn để đánh giá độ tuyến tính Thông thường với giá trị r > 0,995 có thể kết luận phương pháp có tương quan tuyến tính tốt [9]

2.3.4.5 Bán định lượng emodin trong cao chiết Hà thủ ô đỏ

- Hệ dung môi khai triển Toluen : Ethanol : Acid acetic (8 : 2 : 0,5)

Xây dựng đường chuẩn định lượng dựa trên diện tích pic và nồng độ emodin của các mẫu chuẩn Xác định nồng độ emodin trong các mẫu thử Từ đó tính hàm

lượng emodin trong dược liệu theo công thức:

k là độ pha loãng cao với EtOH (k = )

m là khối lượng mẫu thử (g)

a là hàm ẩm của mẫu thử (%)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Hiệu suất và một số chỉ tiêu cảm quan cao chiết Hà thủ ô đỏ

3.1.1 Xác định các chỉ tiêu cảm quan

Cao chiết Hà thủ ô đỏ thu được có đặc điểm như sau:

 Thể chất, độ đồng nhất: Cao thu được có thể chất mềm mịn, đồng nhất (M1 – M10)

 Màu sắc: Cao thu được có màu nâu đen (M1 – M10)

 Mùi: Cao Hà thủ ô thu được có mùi thơm đặc trưng (M1 – M10)

Bảng 3.1 Hàm ẩm các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ

-* Nhận xét: 10 mẫu cao chiết có hàm ẩm nằm trong khoảng từ 15,56% đến

17,75% và đều có trị số hàm ẩm dưới 20%, các mẫu cao chiết đạt tiêu chí về

hàm ẩm trong DĐVN V về chất lượng cao đặc (Phụ lục 1.1)

3.1.3 Hiệu suất điều chế cao chiết hà thủ ô đỏ

Các mẫu Hà thủ ô đỏ được chuẩn bị theo quy trình trong sơ đồ ở hình 2.1

Tỷ lệ cao chiết thu được thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tỷ lệ (%) cao đặc Hà thủ ô đỏ thu được

0.167 0.177

0.101 0.048 0.132

0.078

3.2 Định tính cao chiết Hà thủ ô đỏ trước và sau khi chế biến với các phương pháp khác nhau bằng TLC

3.2.1 Kết quả định tính bằng TLC các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ

Chấm các mẫu cao chiết Hà thủ ô đỏ chế với các phương pháp theo sơ đồ ở hình 2.1 và chấm dung dịch emodin đối chiếu trên cùng một bản mỏng Thể tích chấm mẫu & ký hiệu các mẫu như sau:

Bảng 3.3 Thể tích chấm các mẫu cao Hà thủ ô đỏ định tính

Vết 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Mẫu Emodin M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10

Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở ng 254 nm

(1 Emodin; 2 – 11 Hà thủ ô đỏ M1-M10)

Hình 3.3 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở ánh sáng trắng

(1 Emodin; 2 – 11 Hà thủ ô đỏ M1-M10)

Hình 3.4 Sắc ký đồ định tính các mẫu cao Hà thủ ô đỏ ở 366 nm

(1 Emodin; 2 – 11 Hà thủ ô đỏ M1-M10)

Giá trị Rf của các vết được thể hiện ở Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả định tính các pic sắc ký trong 10 mẫu cao ở 366 nm

TT Rf

Màu sắc

Mẫu nghiên cứu

+ : Trên sắc ký đồ xuất hiện vết có giá trị Rf tương ứng

M1 – M10: Cao Hà thủ ô đỏ chiết xuất từ Hà thủ ô đỏ chế bíến với các phương pháp khác nhau như trong Hình 2.3