Phân loại sinh học phân tử

Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ơ ̉ mức độ phân tử. Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cưú tương tác giữa các hê ̣ thôń g câú trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tôn̉ g hơp̣ DNA, RNA, Protein và cách thức điêù hoà cać môí tương tác này.

SEMINAR NGUYÊN TẮC PHÂN LOẠI SINH VẬT

LỚP K53A - SINH HỌC

PHÂN LOẠI

SINH HỌC PHÂN TỬ

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Trung Thành

Sinh viên thực hiện:

Đào Trọng Khoa

Hoàng Thị Xoan

Phan Hồng Anh

NỘI DUNG CHÍNH

I Tổng quan về phân loại Sinh học phân tử

II Các phương pháp cơ bản của phân loại Sinh học phân tử

II Các phương pháp cơ bản của phân loại Sinh học phân tử

III Ứng dụng của phương pháp phân loại Sinh học phân tử

III Ứng dụng của phương pháp phân loại Sinh học phân tử

IV Giá trị phân loại học của các đặc điểm Sinh học phân tử

IV Giá trị phân loại học của các đặc điểm Sinh học phân tử

I TỔNG QUAN VỀ PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ

1.1 ĐỊNH NGHĨA SINH HỌC PHÂN TỬ

 Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức

độ phân tử

 Sinh học phân tử chủ yếu nghiên cứu tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, gồm quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp DNA, RNA, Protein và cách thức điều hòa các mối tương tác này

1.2 PHÂN LOẠI SINH HỌC PHÂN TỬ

 Là phương pháp phân loại sinh vật bằng

đặc điểm gen ở mức độ phân tử Tức là

phân loại bằng các dẫn liệu so sánh hóa sinh

các phân tử lớn như DNA, RNA, protein

 Hiện nay phân loại sinh học phân tử đã và

đang trở thành khoa học mũi nhọn trong

phân loại học, bổ sung cho phân loại học

truyền thống những phương pháp nghiên

cứu mới và một loại đặc điểm phân loại

hoàn toàn khác với những đặc điểm phân

loại đã̃ dùng trước đây

II CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI

SINH HỌC PHÂN TỬ

2.1 So sánh Protein 2.2 Kỹ thuật điện di.

2.3 Phân tích và so sánh DNA.

2.5 Phân tích trình tự r-RNA

2.4 Phân tích trình tự DNA.

2.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).

2.1 SO SÁNH PROTEIN

 Số liệu so sánh Protein là một đăc điểm phân loại quan trọng, đáng tin cậy để xác định quan hệ giữa các taxon sinh vật, kể cả sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn

 Có nhiều phương pháp so sánh Protein

 Nguyên lý: Protein của một loài sinh vật có phản ứng kháng thể đối với protein của một loài có quan hệ gần mạnh hơn đối với protein của loài có quan hệ xa hơn.

 Phương pháp này được áp dụng để kiểm tra một số kết quả phân loại theo đặc điểm hình thái và các đặc điểm phân loại khác

 Kỹ thuật nghiên cứu định lượng phản ứng kháng thể.

 VD: phương pháp cố định vi bổ thể lượng (microcomplement faxation) do Champion đề xướng

 Hiện nay, phương pháp xác định và so sánh trình

tự acid amin của các protein có cùng chức năng

là phương pháp trực tiếp

và được sử dụng rộng rãi nhất.

 Số liệu so sánh trình tự cytochrome, các protein vận chuyển điện tử (electron transport protein), trình tự các histone, các protein sốc nhiệt, protein phiên mã, dịch mã được dùng rất phổ biến trong phân loại học.

 Một số phương pháp so sánh gián tiếp:

 Phương pháp điện di

 Kỹ thuật miễn dịch học so sánh kháng thể

 Kỹ thuật điện di enzyme đa locut

2.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI

 Trước đây, trong kỹ thuật nghiên cứu hóa sinh, kỹ thuật sắc ký (chromatographic mathods) được sử dụng rộng rãi.

 Tuy nhiên hiện nay trong nghiên cứu sinh học phân tử, phương pháp sắc ký được thay thế bằng phương pháp điện di (electrophoresis).

2.2.1 KỸ THUẬT ĐIỆN DI

 Các bước chính của kỹ thuật điện di:

• Đặt gel điện di đã nạp vật mẫu nghiên cứu vào dung dịch đệm của môi trường điện di có độ pH thích hợp

• Cho dòng điện một chiều chạy qua môi trường điện di

• Trong điều kiện nhiêt độ thích hợp, thời gian thích hợp các cấu tử điện di (các phần

tử tích điện) sẽ di chuyển trên giá thể điện di hay bản gel điện di với tốc độ khác nhau, tạo thành phổ băng điện di

• Sau khi bản gel được nhuộm màu bằng thuốc nhuộm thích hợp, ta có thể quan sát phổ băng điện di dưới kính hiển vi quang học, hoặc chụp ảnh với độ phóng đại cần thiết

• Kết quả phân tích cuối cùng được thể hiện bằng biểu đồ hình cây (dendrogram - cây

VIDEO

2.2.2 ĐIỆN DI GEL TRƯỜNG ĐIỆN XUNG

Là dạng cải tiến của kỹ thuật điện

di

• Hạn chế cơ bản của kỹ thuật điện

di là không có khả năng phân tách

vật mẫu có kích thước phân tử lớn

• Hạn chế này đã được khắc phục

bằng kỹ thuật gel trường điện xung

(PFGE = pulssed field gel

electrophoresis) là một dạng cải tiến

của kỹ thuật điện di

• Thủ pháp chính của kỹ thuật PFGE

là: đổi chiều dòng điện chạy qua gel

điện di, gây xung điện theo chu kỳ

• Ưu điểm: kỹ thuật PFGE có khả năng phân tách theo kích thước những đoạn DNA kích thước tới vài megabase.

• Với ưu điểm vượt trội trên, hiện nay kỹ thuật PFGE được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm hóa sinh và công nghệ sinh học.

2.3 PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH DNA

Gồm có các phương pháp chính

sau:

 So sánh thành phần base hữu cơ của nucleic acid

2.3.1 SO SÁNH THÀNH PHẦN BASE HỮU CƠ CỦA NUCLEIC ACID

• Đây là phương pháp so sánh DNA

được sử dụng đầu tiên và có thể

cũng là phương pháp đơn giản nhất

• Phương pháp này dựa trên tỷ lệ

(G+C)/(A+T) hoặc thành phần G+C

trong DNA:

Mol% G+C =

• Số liệu so sánh tỷ lệ G+C là đặc

điểm phân loại đáng tin cậy để kiểm

tra kết quả phân loại bằng những

loại đặc điểm khác Tỷ lệ G+C cũng

là đặc điểm phân loại tin cậy để xác

định các chi, thường là các chi sinh

vật nhân sơ.

100

x T A

C G

C

G

+ +

+

+

• Xác định thành phần base hữu cơ của DNA qua nhiệt độ nóng chảy

(Tm) của DNA.

• Tm là nhiệt độ làm 50% sợi kép tách thành sợi đơn.

2.3.2 LAI DNA/DNA

• Có thể so sánh trực tiếp các nguồn gen khác nhau của sinh vật nhờ phương pháp lai DNA

• Mức độ lai của những đoạn DNA sợi đơn từ những nguồn khác nhau biểu thị mức độ giống nhau của các sinh vật mang các nguồn gen đó.

• Phương pháp này chỉ có thể

áp dụng để so sánh và phân biệt với những sinh vật có quan hệ gần.

• Phản ứng lai của những đoạn DNA sợi đơn của 2 nguồn gene khác nhau

có thể xảy ra ngay cả khi trình tự nucleotide của 2 nguồn gene khác nhau 15%

• Những nucleotide không ghép cặp

bổ sung sẽ làm cho sợi kép lai kém bền và sẽ tách thành 2 sợi đơn ở Tm thấp

• Trong điều kiện tối ưu, nếu mức độ lai DNA của 2 nguồn gene thí nghiệm đạt từ 70 – 100%, Tm của sợ kép lai giảm dưới 5% thì 2 nguồn gene là của cùng một loài

2.3.3 LAI DNA/RNA

• Phương pháp này cho phép so sánh và phân biệt nguồn gene của những sinh vật thuộc các taxon khác nhau có quan hệ xa

• Trong phép lai DNA/RNA sử dụng r-RNA hoặc t-RNA

• Kỹ thuật lai cũng gồm có các khâu cơ bản tương tự như lai DNA/DNA

• Kỹ thuật lai DNA/DNA và DNA/RNA không ngừng được cải tiến Hiện nay

có khá nhiều kỹ thuật lai Thường dùng là phương pháp lai với mẫu dò:

sử dụng đoạn DNA tổng hợp nhân tạo

có trình tự ngắn(20-30 Nu) làm mẫu dò.

 lai với mẫu dò trong pha rắn (solid phase hybridization)

 lai với mẫu dò trong pha lỏng (solution phase hybridization)

 lai tại chỗ (in situ hybridization)

Lai với mẫu dò trong pha rắn (Solid phase hybridization): nucleic acid đối tượng nghiên cứu được gắn vào màng nylon hoặc màng nitrocellulose để lai với mẫu dò đặc hiệu.

Lai với mẫu dò trong pha lỏng (solution phase hybridization): yếu tố bảo đảm cho kết quả phản ứng là các mẫu dò DNA trình tự ngắn không tự lai với nhau.

Lai tại chỗ (in situ hybridization): nguyên lý cơ bản giống như phép lai trong pha rắn hoặc pha lỏng, nhưng phản ứng lai xảy ra trong mô tế bào bị nhiễm.

2.3.4 PHÂN TÍCH CÁC ĐOẠN DNA CẮT GIỚI HẠN (REA)

Là kỹ thuật sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt

sợi DNA đối tượng nghiên cứu thành những

đoạn nhỏ, sau đó phân tích số lượng và kích

thước các đoạn cắt giới hạn bằng kỹ thuật

điện di gel agaroza

• Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme hay endonucleaza) là những enzyme cắt DNA ở điểm trình tự đặc biệt thành những đoạn ngắn 4 – 8 nucleotide.

• Tên các enzyme cắt giới hạn được viết tắt theo tên loài vi khuẩn có enzyme đó.

• Các loại enzyme cắt giới hạn gồm 3 typ:

– Typ I và II cắt DNA ở các điểm trình tự nhận biết

– Typ III cắt DNA ở vị trí trình

tự nhận biết đặc biệt

• Ưu điểm: kỹ thuật REA không phức tạp, tương đối dễ tiến hành và có thể lặp lại cho kết quả giống nhau, bảo đảm độ chính xác

và đáng tin cậy

• Nhược điểm: khó phân tích và so sánh kết quả vì số lượng sản phẩm cắt lớn, phổ băng

điện di nhiều khó phân biệt

• Ứng dụng: dùng phổ biến trong phân loại vi sinh vật nhân thật và sinh vật nhân sơ để xác định các dòng chuẩn cũng như là một trong những kỹ thuật hay dùng trong thực tiễn dịch

tễ học để phân biệt và xác định các dòng vi sinh vật như vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm

2.3.5 KỸ THUẬT THẤM TÁCH SOUTHERN

• Phương pháp tương tự kỹ thuật REA

nhưng không phân tích tất cả các đoạn

gen DNA cắt giới hạn mà chỉ phân tích

chọn lọc những đoạn có liên quan đến

một số locut nhiễm sắc thể đặc biệt

• Số lượng và kích thước các đoạn DNA

lai được gọi là đa hình độ dài các đoạn

cắt giới hạn (RFLP = restrict fragment

length polymorphism)

• Vấn đề lựa chọn mẫu dò có ảnh

hưởng quyết định đến kết quả phân

tích Southern

• Kỹ thuật này được áp dụng khá phổ biến trong thực tiễn dịch tễ học để phân biệt và xác định các dòng vi khuẩn gây bệnh, cho phép phân tích phát hiện tất cả các dòng vi khuẩn có locut tương đồng với mẫu dò.

• Áp dụng để phân tích những gene mã hóa các độc tố và chức năng trao đổi chất để xác định các dòng phân lập

2.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA

• Phương pháp phân tích trình tự DNA ưa

chọn hiện nay là phương pháp Sanger

• Thủ pháp cơ bản: trong quá trình phản

ứng tổng hợp DNA, khi chuỗi đang tiếp tục

kéo dài, đưa ddNTP gắn vào chuỗi DNA ở

đầu mà phản ứng đang tiếp tục, thế chỗ

cho deoxynucleotide làm ngừng phản ứng

Phương pháp Sanger sử dụng mồi oligonucleotide tổng hợp nhân tạo có thể tiến hành thủ công hoặc bằng máy phân tích tự động.

Phương pháp thủ công Phân tích trình tự DNA bằng máy tự động

Kỹ thuật phân tích trình tự DNA phát triển nhanh chóng và không ngừng được cải tiến Nguồn dữ liệu cơ bản về

bộ gen các sinh vật (ngân hàng gen) không ngừng được tăng nhanh Một trong những ngân hàng gen lớn nhất hiện nay là International Nucleic Acid Sequence Data Library

2.5 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ r-RNA

• r-RNA là thành phần cơ bản chủ yếu

có chức năng giống nhau trong tất cả

các loại ribosome

• Cấu tạo r-RNA biến đổi chậm trong

quá trình tiến hóa, trình tự nucleotide

của r-RNA đa dạng, ổn định Vì vậy

phân tích và so sánh trình tự

nucleotide của r-RNA cung cấp những

bằng chứng khách quan tin cậy làm cơ

sở để xác định quan hệ tiến hóa giữa

các loài, giữa các taxon bậc trên loài

2.5.1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ r-RNA TỔNG THỂ Các bước tiến hành gồm có:

 Phân lập và làm tinh khiết r-RNA.

 Dùng enzyme mã ngược và mồi

oligonucleotide ghép cặp bổ sung

với trình tự của r-RNA để chuyển

r-RNA thành DNA bổ sung.

 Nhân bội cDNA bằng kỹ thuật

PCR (Polymerase Chain Reaction)

 Phân tích trình tự sản phẩm PCR

thep phương pháp Sanger bằng

máy phân tích tự động như

phương pháp phân tích trình tự

DNA.

• Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu bệnh học

và dịch tễ học để phân tích xác định các dòng vi khuẩn trong tự nhiên và

cả những vi khuẩn gây bệnh không thể nuôi cấy lại trong phòng thí nghiệm, cung cấp những dữ liệu khách quan và chính xác cho các nghiên cứu định lượng tiếp theo.

• Các đặc điểm nghiên cứu

• r-RNA là nguồn đặc điểm phân loại làm cơ sở cho việc phân tích, đánh giá quan hệ tiến hóa giữa các nhóm loài sinh vật nhân thật bậc thấp và sinh vật nhân sơ.

2.5.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MỘT ĐOẠN TRÌNH TỰ r-RNA NGẮN, ĐẶC TRƯNG

• Các bước chính:

+ phân lập và làm tinh khiết r-ARN 16S,

gắn chất phóng xạ hoặc thuốc nhuộm

theo kích thước trên gel điện di

+ phân tích trình tự nucleotit của tất cả

các đoạn từ 6 nucleotit trở lên

+ Kết quả phân tích trình tự ngắn của

các sinh vật khác nhau được so sánh

và tính hệ số tương đồng

Đoạn phân tử r-RNA 16S trong ribosome của hầu hết các sinh vật nhân sơ cũng như nhân thật thường

có một hay nhiều đoạn trình tự ngắn đặc trưng cho từng loài hoặc nhóm loài, gọi là trình tự chữ ký ngắn Kết quả phân tích so sánh

trình tự những đoạn đó là đặc điểm chẩn loại làm căn cứ định loại chính xác và sắp xếp các loài, các nhóm sinh vật vào các taxon thích hợp

Cây phát sinh chủng loại của sinh giới theo quan điểm của Carel Woese (1993) dựng

theo số liệu phân tích, so sánh trình tự r-RNA 16S

2.6 KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

• Kỹ thuật PCR là một kỹ thuật

hiệu năng cao đã và đang

được áp dụng rộng rãi trong

nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh

học phân tử.

• Nguyên lý: dựa trên khả

năng xúc tác của enzyme DNA

polymerase trong phản ứng

kéo dài đoạn trình tự bổ sung

bắt đầu từ đoạn mồi trình tự

ngắn gắn trên 2 sợi đơn của

đoạn DNA khuôn để tạo phiên

bản của đoạn DNA cần phân

tích.

Các thành phần thiết yếu tham gia phản ứng PCR

Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt 4 loại deoxyribonucleotide triphosphate

+ Bước gắn mồi: cho các đoạn mồi (primer) lai ghép cặp bổ sung với 2 đoạn trình tự ở 2 đầu đoạn DNA sợi khuôn.

+ Bước tổng hợp: tiến hành phản ứng tổng hợp để tạo ra sợi DNA mới theo trình tự nucleotide của sợi khuôn

• Sau mỗi chu kỳ 3 bước thì số lượng đoạn DNA được nhân gấp đôi

PCR machine

II CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN CỦA PHÂN LOẠI

SINH HỌC PHÂN TỬ

VIDEO

2.6.2 CÁC CẢI TIẾN CỦA KỸ THUẬT PCR

Kỹ thuật PCR luôn được đổi mới và cải tiến, cụ thể có những phương pháp cải tiến sau:

+ PCR mồi ngẫu nhiên (RADP)

+ Rep - PCR

• Kỹ thuật đa hình độ dài các

đoạn nhân bội (AFLP) Phân tích các đoạn cắt giới hạn sản phẩm PCR

III ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI

SINH HỌC PHÂN TỬ

phân tử, nhiều ý tưởng, chương

trình khoa học đã được xây dựng

phục vụ đắc lực cho công tác phân

loại sinh vật

tử và mô hình cây nguồn gốc

chủng loại

 Ý tưởng về đồng hồ phân tử do

Zuckerkandl và Pauling đề xuất

(1965)

các phân tử là không đổi thì đồng

hồ phân tử sẽ chạy khác nhau ở các

loài khác nhau

niên đại của các điểm phân nhánh

giữa các taxon bậc cao

nhánh đã tính được cùng với số

lượng các acid amin khác nhau đã

biết, tính số trung bình các acid

amin được thay thế trong 10 triệu

3.1 ĐỒNG HỒ PHÂN TỬ (MOLECULAR CLOCK)