Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)

Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)Nghiên cứu đặc tính sinh học, sinh học phân tử chủ yếu của chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ TOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦ YẾU CỦA CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01 VÀ PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi

Mã số:62.64.01.02

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2017

Công trình hoàn thành tại:

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: 1 PGS TS NGUYỄN THỊ LAN

2 PGS TS PHẠM CÔNG HOẠT

Phản biện 1: PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2: PGS.TS TÔ LONG THÀNH

Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương

Phản biện 3: PGS.TS CÙ HỮU PHÚ

Hội Thú y

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh tai xanh hay hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi Bệnh xuất hiện đầu tiên ở Mỹ năm 1987 (Keffaber, 1989), rất nhanh chóng sau đó bệnh lan sang Canada và sau đó lan sang các nước Châu Âu Năm 1991,

virus được tìm thấy tại Hà Lan (Terpstra et al., 1991) Năm 1998, bệnh

được phát hiện ở Hàn Quốc, Nhật Bản thuộc khu vực Châu Á Từ năm

2005 trở lại đây, bệnh lây lan khắp các nước trên toàn thế giới Bệnh tai xanh do một loại virus gây ra, virus tấn công là các đại thực bào dẫn đến hiện tượng suy giảm miễn dịch ở lợn, tạo điều kiện cho các virus, vi khuẩn gây bệnh khác tấn công.Tác nhân gây bệnh - virus PRRS (PRRSV) là một

thành viên của giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales (Collins

et al., 1992) PRRS lần đầu tiên được ghi nhận ở Việt Nam vào năm 1997,

thực tế cho thấy virus vẫn tồn tại và không ngừng biến đổi, cần có những nghiên cứu mới về PRRSV tại Việt Nam, để thấy rõ có sự khác biệt hay không với các chủng cổ điển đã phân lập trên thế giới cũng như trả lời cho câu hỏi tại sao vắc-xin PRRS được sử dụng mà dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra Nguyên nhân chúng ta chưa có thông tin chính xác về các chủng PRRSV thực tế đang lưu hành tại Việt Nam, cũng như những đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này

Trong các nghiên cứu gần đây của Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu được một số triệu chứng lâm sàng, đặc điểm bệnh lý của lợn mắc PRRS tự nhiên và cũng đã phân lập được một số chủng PRRSV gây bệnh từ đàn lợn nuôi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam trên môi trường tế bào Marc 145 Trong các chủng phân lập được, có các chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được phân lập từ các lợn có triệu chứng và bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS, gây tỷ lệ ốm, tỷ

lệ chết cao Tuy nhiên vẫn chưa đánh giá hết được đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng virus này Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vắc-xin, đánh giá hiệu quả của vắc-xin hoặc sản xuất chế phẩm sinh học phòng, trị bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học

và sinh học phân tử của các chủng virus phân lập được là vô cùng quan trọng và cấp thiết

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu chung

Mục tiêu của luận án nhằm chọn ra chủng virus PRRS tiềm năng có đặc tính sinh học, sinh học phân tử điển hình để làm phong phú nguồn quỹ gene nhằm phục vụ các nghiên cứu chuyên sâu như: sản xuất vắc-xin phù

hợp có hiệu quả bảo hộ cao; chế kháng thể đạt chuẩn dùng trong phòng, trị PRRS; công cường độc để đánh giá hiệu quả của vắc-xin; gây bệnh thí nghiệm để nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm bệnh lý PRRS; sử dụng làm chủng tham chiếu để nghiên cứu các virus mới phân lập và các biến chủng dùng trong dịch tễ học phân tử

1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 đã được khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi về không gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên

đối tượng là chủng virus PRRS HUA 01 được phân lập tại tỉnh Hải Dương (năm 2013) và chủng virus PRRS HUA 02 được phân lập tại tỉnh Hưng Yên (năm 2013)

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh

học Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý, khu nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ năm

6/2014-12/2016

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Những vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh tại Việt Nam hiện nay chưa mang lại hiệu quả rõ rệt Điều này cho thấy có một sự sai khác đáng

kể về tính kháng nguyên của chủng virus PRRS gây bệnh trên đàn lợn ở Việt Nam với chủng virus PRRS của vắc-xin nhập ngoại vì vậy mà kháng thể kháng virus PRRS có trong lợn được tiêm phòng không thể bảo hộ được chúng khỏi các chủng virus PRRS thực địa Nghiên cứu sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS phân lập và các chủng virus vắc-xin cho phép xác định được tính tương đồng giữa các chủng virus này, từ đó đưa ra các thông tin chính xác về sự lưu hành của các chủng virus PRRS ở Việt Nam Đồng thời cho phép lựa chọn được các chủng virus PRRS thích hợp để sử dụng làm vắc-xin

Luận án nghiên cứu đặc tính sinh học và sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS đã được phân lập từ trước đó là một trong những nghiên cứu mới và cần thiết để lựa chọn ra được các chủng virus điển hình cho virus gây bệnh tại Việt Nam và có tiềm năng để sản xuất vắc-xin, thử độc

lực của vắc-xin hoặc các chế phẩm sinh học nhằm phục vụ cho chẩn đoán, phòng, trị bệnh cho lợn

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Các thông tin khoa học, những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh

học và sinh học phân tử của 02 chủng PRRSV phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam là cơ sở khoa học quan trọng cho các nghiên cứu sâu hơn về PRRS như nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng, nghiên cứu sản xuất vắc-xin, nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán, bảo tồn nguồn gene virus

thực địa với các đặc tính sinh học rõ ràng và đầy đủ

Kết quả của luận án sẽ chỉ ra được các đặc tính sinh học và sinh học phân tử cũng như độc lực của một số chủng PRRSV sẽ rất có ích cho lĩnh vực thú y nói riêng và lĩnh vực công nghệ sinh học nói chung Tạo ra được những tiến bộ khoa học, phát triển các hướng nghiên cứu về công nghệ sinh học trong lĩnh vực thú y

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của luận án sẽ đưa ra những thông tin về đặc tính sinh học, sinh học phân tử của một số chủng virus PRRS nghiên cứu để có thể lựa chọn được chủng virus tiềm năng dùng để chế vắc-xin phòng bệnh hoặc chế kháng nguyên chẩn đoán bệnh hoặc làm chủng cường độc để thử hiệu lực của vắc-xin Như vậy các chủng virus này có thể giúp ích cho các công ty sản xuất vắc-xin hoặc các cơ sở nghiên cứu Sản xuất được vắc-xin trong nước, giúp chúng ta không phải lệ thuộc vào sự nhập khẩu vắc-xin và có thể chủ động trong việc phòng chống dịch PRRS nhằm giảm thiểu tối đa thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi, giúp phát triển một ngành chăn nuôi bền vững

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TÌNH HÌNH VỀ PRRS TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) được ghi nhận lần đầu tiên trong các báo cáo về các thiệt hại của ngành công nghiệp chăn nuôi tại Mỹ Tại các ổ dịch có biểu hiện các triệu chứng lâm sàng của PRRS đã được báo cáo ở

Mỹ vào cuối những năm 80 của thế kỉ trước (1987) người ta thấy số lượng lợn chết trong điều kiện bình thường tăng lên và lợn chậm lớn Các triệu chứng lâm sàng bao gồm rối loạn sinh sản nghiêm trọng, viêm phổi ở lợn con sau cai sữa, chậm lớn, giảm năng suất và tỷ lệ tử vong tăng (Keffaber, 1989) Hai năm sau các ổ dịch có các triệu chứng lâm sàng tương tự đã được báo cáo ở CHLB Đức (1990) Năm năm sau kể từ khi có báo cáo đầu tiên về bệnh, năm 1991 virus được tìm thấy lần đầu tiên tại Hà Lan

(Terpstra et al., 1991) Sau đó không lâu, virus PRRS được Mỹ đặt tên là ATCC VR – 2332) (Collins et al., 1992)

2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam

Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam Kết quả kiểm tra thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007)

Theo thống kê của Cục Thú y, đợt dịch đầu tiên xảy ra vào ngày 12/3/2007 và sau đó lây lan ra khắp cả nước Từ năm 2007 đến nay, PRRS luôn là vấn đề thời sự bởi tính nguy hiểm của nó

2.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VIRUS PRRS

2.2.1 Cấu trúc virus PRRS

Virus PRRS là một virus RNA chuỗi đơn dương, virus này được xếp

vào bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992)

Họ Ateriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm hai thành viên là:

Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai và viêm phổi

ngựa non; Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus (PRRSV)

gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn

2.2.2 Phân loại virus PRRS

Về tính đa dạng di truyền, virus PRRS có hai prototyp, phân lập ở châu Âu (virus Lelystad-LV) và phân lập ở Bắc Mỹ (VR-2332) Ngoài sự khác biệt giữa các lần phân lập người ta đã chứng minh được có sự biến dị

di truyền mạnh trong cả hai typ phân lập, được khẳng định qua phân tích trình tự Nucleotid và Aminoacid của các khung đọc mở (ORFs) của LV và VR-2332 Trình tự Aminoacid của VR-2332 so với LV là 76% (ORF2), 72% (ORF3), 80% (ORF4&5), 91% (ORF6) và 74% (ORF7) Phân tích trình

tự cho thấy các virus đang tiến hóa do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp

trong gene Theo Murtaugh et al (1995), Meng et al (1995) và Nelsen et

al (1999) các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh

cảnh giống nhau nhưng chúng lại đại diện cho 2 genotyp khác biệt

2.2.3 Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học của virus PRRS

2.2.3.1 Tính chất nuôi cấy của virus PRRS

Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus Tuy nhiên virus PRRS chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang lợn (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (Marc

145, CL2621)

2.2.3.2 Một số nghiên cứu về khả năng nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 thông qua khả năng gây bệnh tích tế bào

Nghiên cứu của Martha et al (2009) đã sử dụng 2 dòng tế bào là đại

thực bào phế nang (PAM) và MA104 để phân lập virus PRRS từ các mẫu thu

thập được Nghiên cứu của Fang et al (2006) đã chọn chủng virus PRRS là

YA được phân lập từ phổi lợn mắc triệu chứng cấp tính với PRRS tại một tỉnh của Trung Quốc và được xác định là thuộc serotype Bắc Mỹ độc lực cao

2.2.3.3 Một số nghiên cứu về quy luật nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào

Nghiên cứu của Fang et al (2006) đã thực hiện nghiên cứu đặc điểm

sinh trưởng của virus trong điều kiện môi trường nuôi cấy tế bào Marc-145 Virus được tiến hành gây nhiễm trên môi trường Marc 145 với giá trị MOI

= 0,1 Nghiên cứu của Han et al (2007) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm

sinh trưởng của virus trên dòng tế bào MA 104 trên môi trường nuôi cấy tế bào bằng bình T25 với giá trị MOI là 5 x 104 PFU Nguyễn Thị Lan và Lương Quốc Hưng (2012) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng phân lập tại Việt Nam

2.2.4 Một số nghiên cứu về đặc tính sinh học phân tử của virus PRRS

Dựa trên phân tích về phát sinh loài virus phân lập khác nhau trên thế

giới (Nelson et al., 1993) PRRSV có thể được phân biệt thành hai kiểu

gene: loại I, European gienotype gồm virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện

là chủng Lelystad (LV), gồm 3 subtype đã được xác định trong đó, subtype

1 được chia thành 12 clade khác nhau, subtype 2 được chia thành 9 clade

(Shi et al., 2010); loại II: Northern American gienotype gồm những virus

thuộc dòng Bắc Mỹ mà tiêu biểu là chủng virus Bắc Mỹ ATCC - VR2332 PRRSV phân lập ở Trung Quốc được chỉ định là thành viên của kiểu gene II Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007) Sợi đơn RNA của virus bao gồm một bộ gene có khoảng 15

kb, mã hóa 9 ORFs Bộ gene PRRSV bao gồm hai gene polymerase là ORF1a

và ORF1b và bảy gene cấu trúc là ORF2a, 2b, 3, 4, 5, 6, và 7 Một số nghiên cứu khác về gene ORF5: ORF5 là gene mã hóa cho một glycoprotein xuất hiện phần lớn trên bề mặt của virus PRRS Trình tự protein GP5 được dự đoán có chứa vùng trình tự tín hiệu (từ amino acid 1-32), 2 vùng trình tự ectodomain ngắn (từ amino acid 32-64 và amino acid 89-109) và vùng trình tự endodomain

(từ amino acid 110-200) (Li and Murtaugh, 2012; Kim et al., 2014) Nghiên

cứu mức độ tương đồng của gene ORF5 cho thấy, các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam có mức độ tương đồng cao với các chủng của Trung Quốc (Metwally, 2010) Nghiên cứu phân tử mở rộng cho thấy rằng PRRSV là rất khác nhau về kháng nguyên, độc lực và đa dạng trình tự nucleotide (Nguyễn

Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007) Những nghiên cứu còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotid khá cao đến 20% về trình tự và số lượng ribonucleotide, điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007) Nghiên cứu của Đỗ Hải Quỳnh và cs (2016) khi phân tích đa dạng di truyền gene ORF5 của một số chủng virus phân lập tại miền Bắc Việt Nam từ năm 2011-2013 cũng chỉ ra mức độ tương đồng về nucleotide giữa các chủng virus nghiên cứu với chủng JXA1 là rất cao

2.3 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRS)

2.3.1 Truyền nhiễm học

2.3.1.1 Loài vật mắc bệnh

PRRSV gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi, nòi giống nhưng mẫn cảm nhất vẫn là lợn con và lợn nái mang thai Thông thường virus PRRS chỉ gây bệnh cho lợn không gây bệnh cho người và các động vật khác Tuy nhiên, một số loại gia cầm như vịt trời (Mallard duck) đã được chứng minh là rất mẫn cảm với virus PRRS và virus có thể nhân lên ở loài vịt này

(Zimmerman et al., 1997)

2.3.1.2 Cơ chế sinh bệnh

Virus có đặc điểm rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào vùng phổi Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp phụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này

và phá huỷ nó Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bệnh thường dễ dàng

bị nhiễm khuẩn kế phát (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007)

Bệnh tích tập trung ở phổi Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như không xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám đỏ, rắn, chắc Mô phổi lồi ra và có màu đỏ xám loang lổ như tuyến ức hay như đá granito Cắt miếng phổi nhỏ bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016

3.2 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02 được Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam phân lập từ mẫu bệnh phẩm thu thập từ

02 trang trại thuộc 2 tỉnh Hải Dương và Hưng Yên vào năm 2013

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ, hóa chất, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu

3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 phân lập tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam

3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào

Khôi phục tế bào; Cấy chuyển tế bào; Thu tế bào

3.4.2 Phương pháp gây nhiễm virus

Gây nhiễm virus lên môi trường tế bào; Quan sát bệnh tích tế bào; Thu virus

3.4.3 Phương pháp xác định hiệu giá virus (TCID 50 /ml)

Tế bào Marc 145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng (2,0 x 104 tế bào/giếng) Huyễn dịch virus được pha loãng theo cơ số 10 rồi đem ủ trên

bề mặt tế bào một lớp các giếng theo thứa tự đánh dấu trước (25µl/giếng), mỗi độ pha loãng lặp lại 5 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch duy trì DMEM (10% TBP) được bổ sung vào (100 µl/giếng) CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm TCID50 được xác định theo công thức Spearman-Karber

3.4.4 Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus

Tế bào Marc 145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên

Virus PRRS phân lập được và chủng virus vắc-xin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI = 0.01 Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0.5 ml PBS Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong

tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các bình gây nhiễm tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus

Thự hiện phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014

3.4.7 Phương pháp giải trình tự gene

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước: Tinh sạch sản phẩm của phản ứng RT-PCR, thực hiện phản ứng PCR sequence, tinh sạch sản phẩm PCR sequence

3.4.8 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm

Bước 1: Chọn lợn

Bước 2: Theo dõi lợn trước khi gây nhiễm

Bước 3: Gây nhiễm cho lợn

Bước 4: Theo dõi lợn sau khi gây nhiễm

3.4.9 Phương pháp khám lâm sàng

Tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn tại một số ổ

dịch từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên đến hết thời gian theo dõi 3.4.10 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể

Lợn thí nghiệm được mổ khám theo quy trình quy định trong TCVN 8402:2010

3.4.11 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản

Thực hiện theo quy trình làm tiêu bản vi thể của bộ môn Bệnh lý Thú y

3.4.12 Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch

Thực hiện theo quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch của Bộ môn Bệnh lý Thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.4.13 Xử lý số liệu

Xác định nguồn gốc phả hệ phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gene của chủng virus thu nhận bằng phần mềm Genetyx và MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Để xử lý các số liệu thống kê như: thân nhiệt của lợn thí nghiệm trước và sau gây nhiễm, hàm lượng kháng thể của lợn thí nghiệm, luận án sử dụng Microsoft Office Excel 2007 để phân tích

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA 02 CHỦNG VIRUS PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM

4.1.1 Kết quả nghiên cứu xác định hiệu giá (TCID50) của 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng tế bào Marc 145 để gây nhiễm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và chủng PRRSV vắc-xin (vắc-xin nhược độc chủng JXA1) nhằm xác định hiệu giá virus (TCID50), kết quả được thể hiện ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS HUA 01,

PRRS HUA 02 và chủng virus vắc-xin

3 Chủng virus PRRS vắc-xin (JXA1) 1,74x106

Nghiên cứu đã tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50/25µl) của

02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02 và 01 chủng virus PRRS vắc-xin Qua kết quả xác định hiệu giá virus (TCID50) của 03 chủng virus PRRS được gây nhiễm trên môi trường tế bào Marc 145, chúng tôi thấy rằng các chủng virus này có hiệu giá tương đối cao, có khả năng phát triển

và nhân lên tốt trên môi trường tế bào Marc 145

4.1.2 Kết quả nghiên cứu xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của

02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA 02

Tiến hành gây nhiễm 02 chủng virus PRRS HUA 01, PRRS HUA

02 và chủng virus vắc-xin lên môi trường tế bào Marc 145 nhằm đánh giá khả năng nhân lên của các chủng virus này trên môi trường tế bào ở các thời điểm sau khi gây nhiễm virus

Bệnh tích tế bào (CPE) của 02 chủng virus nghiên cứu xuất hiện sớm, chủng virus PRRS HUA 01 xuất hiện bệnh tích sau 24 giờ gây nhiễm

và ở 36 giờ sau khi gây nhiễm chủng virus PRRS HUA 02 tế bào đã bắt đầu phá hủy Tế bào bị phá hủy muộn nhất là 84 giờ sau khi gây nhiễm So sánh bệnh tích tế bào với các chủng vắc-xin chúng tôi thấy có sự khác biệt

về thời gian xuất hiện bệnh tích tế bào và thời gian tế bào bị phá hủy hoàn toàn Chủng vắc-xin có thời gian xuất hiện bệnh tích sớm tại thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm, CPE đạt 10%, và bệnh tích đạt 40% ở thời điểm sau gây nhiễm 36 giờ, tốc độ nhân virus nhanh, sau 60 giờ - 72 giờ virus đã phá hủy hoàn toàn tế bào

Bảng 4.2 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus

PRRS HUA01, PRRS HUA 02

CPE theo thời

gian sau khi

4.1.3 Kết quả nghiên cứu xác định sự ổn định của các đời virus qua các đời cấy chuyển

Quan sát bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS đang nghiên cứu qua các đời cấy chuyển và xác định hiệu giá TCID50 tại các đời cấy chuyển của các chủng virus này Kết quả được thể hiện ở bảng 4.4 và bảng 4.5

Bảng 4.3 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS

HUA 01, PRRS HUA 02 qua các đời cấy chuyển

Hiệu giá và khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus PRRS

mà chúng tôi nghiên cứu tương đối ổn định, chứng tỏ các chủng virus có khả năng thích ứng gây bệnh tích trên tế bào Marc 145 ngày càng cao Thời điểm gây xuất hiện bệnh tích tế bào của chủng virus PRRS HUA 01

sớm hơn tại 24 giờ sau gây nhiễm Bệnh tích tế bào của chủng virus PRRS HUA 02 xuất hiện sau 36 giờ gây nhiễm và các tế bào bị phá hủy nhiều nhất ở 60 đến 84 giờ sau gây nhiễm

Bảng 4.4 Hiệu giá 02 chủng virus PRRS HUA 01 và PRRS HUA 02

qua các đời cấy chuyển

Hình 4.1 Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 01

Hình 4.2 Hình biểu diễn sự nhân lên của chủng virus PRRS HUA 02