Mục tiêu nghiên cứu của luận án là phát hiện được các gen carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN DIỆU LINH
NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC
VÀ BỆNH VIỆN QUÂN ĐỘI 108
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62420107
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội, 2017
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Người hướng dẫn khoa học:
1 GS.TS Đặng Đức Anh
2 GS TS Phạm Văn Ty
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án Tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên vào hồi giờ …, ngày …tháng …năm 201
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam;
- Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 3MỞ ĐẦU
Vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề nghiêm trọng và đóng vai trò trọng tâm trong công tác chăm sóc sức khoẻ con người trên toàn thế giới Sự quan ngại ngày càng lớn do sự xuất hiện và lây lan nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem, hiện vẫn
được coi là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” điều trị các
trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc gây ra trong các bệnh viện Do vậy vấn đề này đã và đang giành được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới với số lượng các nghiên cứu về
vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng
Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của
vi khuẩn kháng kháng sinh Hiện nay các báo cáo cho thấy vi khuẩn Gram âm đã kháng lại carbapenem trong các bệnh viện ở mức độ cao Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các gen NDM-1, KPC, OXA-
23 và OXA-58 trong cơ chế kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm được phân lập tại một số bệnh viện ở Việt Nam và bước đầu xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kháng carbapenem phân lập được Để giải quyết các vấn đề còn tồn tại từ các nghiên cứu trước đây như: sự tồn tại của các gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme carbapenemase (gọi tắt là gen carbapenemase) khác; mối liên
hệ về kiểu gen, sequence type (ST) giữa các chủng mang gen kháng ở Việt Nam và trên thế giới đặc biệt là trong bối cảnh giao thông và du lịch phát triển mạnh, tạo cơ hội cho sự lây lan của các chủng kháng trên phạm vi thế giới; và đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem phân lập trong những bệnh viện lớn tại Việt Nam, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật tiên tiến nhất để thực
hiện đề tài: "Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng
Trang 4carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Quân đội 108"
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1 Phát hiện được các gen carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem phân lập tại
Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
2 Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
- Kết quả nghiên cứu cho thấy vai trò của cơ chế sinh carbapenemase
trong đặc tính kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm phân lập tại bệnh viện, qua đó bổ sung các số liệu quan trọng ở mức độ phan tử về thực trạng kháng carbapenem ở Việt Nam
- Luận án cung cấp các thông tin hữu ích về nguồn gốc và sự lây lan
của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem tại các địa điểm nghiên cứu và mối quan hệ với các chủng kháng trên thế giới
- Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp kiểm
soát nhiễm khuẩn hiệu quả trong bệnh viện, đồng thời góp phần giảm gánh nặng và nguy cơ lan truyền vi khuẩn kháng thuốc ra ngoài cộng đồng
- Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến nhất trên thế
giới vào nghiên cứu này góp phần nâng cao được năng lực của NCS nói riêng và của toàn nhóm nghiên cứu nói chung cũng như chất lượng các công trình nghiên cứu ngang tầm với các quốc gia khác trong khu vực và trên thế giới
Trang 5NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Là nghiên cứu đầu tiên áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến
nhất hiện nay (giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn) để xác định
cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử bằng sinh tổng hợp enzyme carbapenemase của một số chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng phổ biến được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng
- Kết quả nghiên cứu cho thấy một bức tranh rõ nét hơn về mối liên
hệ kiểu gen, sequence type giữa các chủng vi khuẩn kháng carbapenem trong nghiên cứu này với các chủng vi khuẩn sinh carbapenemase của một số bệnh viện khác tại Hà Nội và trên thế giới
- Nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm phân tử của các plasmid và yếu
tố di truyền di động mang gen carbapenemase
CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN
Luận án bao gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ lục; gồm 3 chương, 37 hình, 10 bảng, 234 tài liệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt, 220 tài liệu tiếng Anh) Bố cục luận án gồm: Mở đầu
4 trang, Tổng quan 37 trang, Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15 trang, Kết quả và bàn luận 59 trang, Kết luận 1 trang, Kiến nghị 1 trang; 4 bài báo có liên quan trực tiếp đến luận án đã được công bố
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Gram âm và tính kháng kháng sinh
1.1.1 Vi khuẩn Gram âm
Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có nhiều gen quan trọng nằm trên những ADN vòng tách biệt, rải rác trong nguyên sinh chất của vi khuẩn gọi là các plasmid Plasmid thường chứa các gen sản xuất kháng sinh, một số gen sản xuất các loại độc tố và các protein có hoạt tính cao có chức năng tăng cường độc
Trang 6lực cho vi khuẩn Plasmid là công cụ giúp vận chuyển ADN từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua hiện tượng truyền gen ngang nên chúng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược
và môi trường
1.1.2 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm
Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể bắt nguồn từ hai yếu tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi khuẩn kháng Tính đề kháng sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu
tố này trong môi trường hoặc vật chủ Các gen quy định đặc tính kháng
và tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới áp lực chọn lọc của kháng sinh có trong môi trường
1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm
Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm thường được phân thành 3 nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn, thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản sinh ra các enzyme để ức chế hoặc biến đổi kháng sinh
1.1.4 Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh
Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể là đề kháng tự nhiên hoặc đề kháng thu được Đề kháng tự nhiên là đặc điểm sinh học của một loài, thường có được do yếu tố di truyền với mục đích bảo vệ vi khuẩn khỏi tác động của kháng sinh Đề kháng thu được là đề kháng
có được nhờ đột biến gen, nhận được gen đề kháng từ bên ngoài thông qua truyền gen ngang hoặc kết hợp cả 2 cơ chế này
Trang 71.2 Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm
1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm
Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao gồm: các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng hợp các enzyme carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo
ra các đột biến làm giảm tính thấm của màng tế bào thông qua việc thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các lỗ màng và phân tử PBP;
và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp carbapenemase là cơ chế phổ biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất
Các enzyme carbapenemase được phát hiện chủ yếu thuộc nhóm A (ví dụ như enzyme KPC và GES), nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ như enzyme VIM, IMP và NDM) và nhóm D (ví dụ các enzyme họ OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181) Đối với các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, các carbapenemase có ý nghĩa lâm sàng nhất bao gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm B) và OXA-48 (nhóm D)
Trang 81.3 Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng
Các phương pháp nghiên cứu đặc tính và cơ chế kháng carbapenem
ở mức độ phân tử của các chủng vi khuẩn kháng thuốc bao gồm: kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR); thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung Triton (Triton Hodge Test - THT) và Carba NP cải tiến; S1-PFGE kết hợp với Southern blotting; phân loại plasmid và giải trình tự gen
Các phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng bao gồm: phương pháp điện di xung trường (PFGE), phân loại trình tự đa vị trí (MLST) và tiếp hợp
1.4 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm trên thế giới
Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí ngay cả một số kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” như nhóm carbapenem đang mất dần hiệu lực Vi khuẩn mang gen carbapenemase nhóm A, B và
D đã xuất hiện trên toàn thế giới ở cả mức độ gây ra những vụ dịch lớn hoặc các trường hợp riêng rẽ
1.4.2 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm tại Việt Nam
Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức
độ cao Tại 6 bệnh viện vào năm 2008 đã ghi nhận mức độ kháng
carbapenem của các chủng P aeruginosa là 20% và của các chủng A baumannii là gần 50% Theo một nghiên cứu mới nhất ở bệnh nhân
nhi thuộc Khoa hồi sức cấp cứu tại 3 bệnh viện tuyến đầu của Việt
Trang 9Nam đã cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem ở các chủng K pneumoniae,
P aeruginosa và A baumannii lần lượt là 55%, 71% và 65%
Các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam cho thấy
sự xuất hiện của các gen NDM-1, KPC, 23, 51 và
OXA-58 ở các chủng vi khuẩn đường ruột và A baumannii phân lập tại một
số bệnh viện lớn Tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem đang có xu hướng tăng và ngày càng lan rộng ở Việt Nam
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu
Chọn có chủ đích Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội (TƯQĐ) 108
2.2 Thiết kế nghiên cứu
Mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm
2.3 Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm
2017 Địa điểm thực hiện: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Đơn
vị nghiên cứu lâm sàng Oxford tại Hà Nội (OUCRU), Việt Nam; Trường Đại học Cardiff và Trường Đại học Oxford, Vương quốc Anh; Viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh truyền nhiễm, Nhật Bản
2.4 Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu
622 chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii phân lập
từ mẫu bệnh phẩm tại 2 bệnh viện Việt Đức và TƯQĐ 108 cho kết quả kháng sinh đồ kháng với ít nhất một loại kháng sinh thuộc nhóm carbapenem
2.6 Phương pháp nghiên cứu
Nuôi cấy vi khuẩn; tách chiết ADN; phản ứng PCR; Hodge test và Carba NP cải tiến; thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu
Trang 10ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC); PFGE; giải trình tự toàn bộ
hệ gen của vi khuẩn (WGS); S1-PFGE và Southern blotting; tiếp hợp
vi khuẩn
2.7 Xử lý và phân tích số liệu
Phần mềm Excel và các phần mềm tin sinh học chuyên dụng khác
2.9 Đạo đức trong nghiên cứu
Mọi thông tin cá nhân của bệnh nhân đều được bảo mật
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1 Một số đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập tại
2 bệnh viện
Tổng số chủng vi khuẩn thu thập trong giai đoạn nghiên cứu là 622 chủng trong đó từ Bệnh viện Việt Đức là 318 chủng và từ Bệnh viện TƯQĐ 108 là 304 chủng
Trong tổng số 622 chủng thu thập được, A baumannii chiếm tỉ lệ lớn nhất là 53% (n=330), tiếp theo là K pneumoniae 26% (n=162) và thấp nhất là E coli với 21% (n=130) Tỉ lệ A baumannii kháng
carbapenem rất cao phù hợp với các công bố trước đây về tỉ lệ chủng
A baumannii chiếm ưu thế tại các bệnh viện của Việt Nam
3.2 Phát hiện các gen mã hoá khả năng sinh tổng hợp enzyme carbapenemase ở các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập tại 2 bệnh viện
Trong 3 loại vi khuẩn nghiên cứu, chủng A baumannii có tỷ lệ
mang gen carbapenemase cao nhất với 92,12% (304/330 chủng), tiếp
theo là K pneumoniae với 54,32% (88/162 chủng) và cuối cùng là E coli với 30,0% (39/130 chủng) (Bảng 3.2) Điều này cho thấy nhiều
khả năng cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem chủ yếu của các
chủng A baumannii và K pneumoniae phân lập tại Bệnh viện Việt
Đức và Bệnh viện TƯQĐ 108 là thông qua việc sinh tổng hợp enzyme
Trang 11carbapenemase, phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác tại Việt Nam và trên thế giới
Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện mang các gen carbapenemase thuộc cả 3 nhóm: nhóm A (KPC), nhóm B (NDM, IMP) và nhóm D (OXA-48, OXA-23 và OXA-58) (Bảng 3.2)
Bảng 3.2: Số lượng chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang các gen
carbapenemase
Gen OXA-23 là gen carbapenemase phổ biến nhất chiếm 45% (280/622
chủng) tuy nhiên lại chỉ được tìm thấy ở A baumannii Gen NDM đứng
thứ 2 với 19,8% (123/622 chủng) nhưng lại được tìm thấy ở cả 3 loại vi khuẩn, phù hợp với các phát hiện trước đây tại Việt Nam và trên thế giới
Các gen khác chỉ xuất hiện với số lượng hạn chế: OXA-58 ở A baumannii (n=20; 3,2%), KPC và OXA-48 đều có ở E coli và K pneumoniae với tỉ
lệ lần lượt là 2,9% (n=18) và 1,6% (n=10) Đây là báo cáo đầu tiên về sự
có mặt của gen KPC ở chủng E.coli và gen OXA-48 ở các chủng vi khuẩn đường ruột phân lập tại các bệnh viện của Hà Nội 13 trong tổng số 622
chủng mang đồng thời 2 hoặc 3 gen carbapenemase khác nhau cho thấy nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp giữa các plasmid mang gen dẫn đến việc các gen kháng khác nhau sẽ nằm trên cùng 1 plasmid
Gen NDM có 4 biến thể mới gồm: NDM-1, NDM-4, NDM-6, NDM-9; OXA-48 có 1 biến thể OXA-181 Sự xuất hiện của các biến
Trang 12thể cho thấy các gen carbapenemase đã và đang biến đổi cùng với sự
tiến hoá tính đề kháng của các chủng vi khuẩn
Tất cả các chủng E coli và K pneumoniae được giải trình tự toàn
bộ hệ gen đều chứa ít nhất 1 gen mã hoá sinh tổng hợp ESBL điển hình như TEM, SHV và CTX; gen mã hoá khả năng kháng nhiều nhóm kháng sinh khác như quinolones, aminoglycoside, sulphonamide v.v Việc phát hiện được nhiều loại gen carbapenemase phổ biến trên thế giới trong các chủng vi khuẩn phân lập tại bệnh viện ở Việt Nam đã cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam thực sự là vấn
đề rất cấp thiết, cần được kiểm soát chặt chẽ
3.3 Xác định khả năng sinh carbapenemase và mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen
3.3.1 Xác định khả năng sinh carbapenemase của các chủng vi khuẩn mang gen
Kết quả thử nghiệm có > 90% số chủng E coli và K pneumoniae
cho kết quả dương tính với thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung
Triton (THT) còn ở A baumannii tỉ lệ này chỉ là 52,30% (Bảng 3.4)
Trong khi đó, thử nghiệm Carba NP cải tiến có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao với các chủng A baumanni (91,78%) Tỉ lệ sinh carbapenemase của các chủng E coli và K pneumoniae lần lượt là 97,44% và 85,23%
Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh carbapenemase của các chủng
kháng bằng phương pháp THT và CarbaNP cải tiến
Trang 13Do độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 phương pháp với các chủng và các gen carbapenemase khác nhau là khác nhau nên tổng hợp kết quả
của cả 2 phương pháp có 100% (39/39) chủng E coli, >90% chủng K pneumoniae và A baumannii mang gen có khả năng sinh
carbapenemase
Các bệnh viện ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa áp dụng 2 kỹ thuật này để phát hiện và kiểm soát sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng sinh carbapenemase như khuyến cáo của CLSI Từ kết quả của nghiên cứu này cho thấy Carba NP cải tiến có độ nhạy cao với cả 3 loại vi khuẩn, thời gian thực hiện ngắn (khoảng 2 giờ), thao tác thực hiện đơn
giản và giá thành hợp lý nên việc đưa Carba NP cải tiến vào áp dụng tại các bệnh viện Việt Nam để sàng lọc và phát hiện nhanh các chủng sinh carbapenemase là hoàn toàn khả thi và cần thiết, đặc biệt là khi
nhận thức được tầm quan trọng của việc phát hiện sớm các chủng sinh carbapenemase đối với các nỗ lực tăng cường hiệu quả cho công tác điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện
3.3.2 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen kháng theo tiêu chuẩn lâm sàng
Kết quả MIC cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng lại IMP và MEM theo
tiêu chuẩn lâm sàng đều ở mức cao, cao nhất là ở A baumannii (85,56% và 90%), thấp nhất là ở E coli (76,92% và 69,23%) Trong
đó nhiều chủng kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem ở nồng độ cao 32-256 µg/ml Mức độ đề kháng của các chủng vi khuẩn với các kháng sinh khác như CIP, CAZ rất cao, trong đó cao nhất là CTX với tỉ lệ
các chủng E coli, K pneumoniae và A baumannii kháng lần lượt là
94,87%, 96,3% và 96,67% Sự có mặt rất phổ biến của các gen sinh ESBL như TEM, SHV, CTX trong các chủng kháng là cơ sở giải thích cho mức độ đề kháng cao với các kháng sinh này Đa số các chủng