Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh

Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta đã và đang có những bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, đời sống kinh tế xã hội ngày càng được cải thiện

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta đã và đang có nhữngbước phát triển vượt bậc về mọi mặt, đời sống kinh tế xã hội ngày càng đượccải thiện Đóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công đó phải kể đếncác thành tựu của ngành nông nghiệp, trong đó có ngành chăn nuôi thú y màđặc biệt là ngành chăn nuôi lợn Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứngnhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ.Theo CIRAD (2006)[43], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêudùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam

Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôilợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làmgiảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợngây nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm Một trong những bệnh thường

gặp phải kể đến là bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai

sữa, còn gọi là bệnh Phó thương hàn tuy không nổ ra thành dịch lớn, nhưngvới đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hạiđáng kể cho người chăn nuôi Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôinào dù quy mô lớn hay nhỏ đều xuất hiện bệnh này

Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao, vấn đề an toàn

thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella

là một yêu cầu cấp thiết Có rất nhiều tác giả đã công bố rằng sự nhiễm

Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Borch và cs, 1996[38]; Berends và cs, 1997[35]) Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh Salmonella sẽ

làm sự an toàn thịt lợn tăng lên Mục tiêu của các nhà khoa học, nhà sản xuất

là xây dựng các đàn gia súc sạch Salmonella

Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn đã được

rất nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Ở Việt Nam đã có một

số công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như:

Nguyễn Thị Nội và cs (1989)[20]; Lê Văn Tạo và cs (1993)[26]; Trần XuânHạnh (1995)[11]; Cù Hữu Phú và cs (2000)[21]; Đỗ Trung Cứ (2004)[6]

Theo Bryan (1988)[40]; Nielsen và Wegener (1997)[62]; Berends và cs

1998[36]; Schwartz (1999)[71]: Các đàn lợn bị nhiễm Salmonella không những gây

thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đốivới con người Bởi vậy mà mỗi biện pháp ngăn chặn có hiệu quả ở gia súc đều cầnthiết và là điều kiện tiên quyết góp phần giảm thiểu dịch bệnh, tăng thu nhập chongười chăn nuôi, chống ô nhiễm môi trường và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định serotyp và các đặc

tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướngphòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết Xuất phát từ thựctiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh"

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hóa

học, serotyp và các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella phân lập được

từ lợn sau cai sữa ở một số tỉnh phía Bắc

- Chế tạo thử nghiệm vacxin đa giá có chứa một số các serotyp thường

gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1880, Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới

kính hiển vi Bốn năm sau (1984), Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩn

này Loài vi khuẩn Salmonella typhi thời gian đầu được gọi với các tên như: Bacillus typhous, Bacterium typhi và Eberthella typhi hay Eberthella typhi tiphosa, còn tên giống Salmonella được Lignires sử dụng đặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả “Hog-cholera bacillus” vào năm 1900 (Selbizt và cs,

1995[72])

Năm 1885, tên gọi S choleraesuis lần đầu tiên xuất hiện trong báo cáo

năm của phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ Thời gian này, Salmon, D.E làtrưởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông được lấy đặt cho vi khuẩn mớinày Song Smith, người cộng sự của Salmon mới thật sự là người phát hiện ra

vi khuẩn Salmonella Một vài năm sau đó, lần lượt các loài Salmonella khác

đã được phát hiện và những loài vi khuẩn đó vẫn có ý nghĩa trong y học chotới ngày nay

Năm 1891 Jensen, đã phân lập được S dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy Cũng vào năm đó, S typhimurium được phát hiện ở vùng

Greiswald và Breslau Hai năm sau đó (1893), tại Breslau đã xảy ra một vụngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh đã xảy ra ở người.Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn, vì vậy vi khuẩn được đặt tên là trựckhuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995[72])

Tất cả các bệnh do Salmonella gây ra lúc đầu được đặt tên chung là

Phó thương hàn “Para-typhus”, cho đến năm 1914, có 12 loài vi khuẩn được

mô tả và xếp vào giống Salmonella.

Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc

kháng nguyên của Salmonella đã bắt đầu một thời kỳ khoa học mới về giống

vi khuẩn này Sau đó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên

cứu về vi khuẩn Salmonella (Selbizt và cs, 1995[72])

Năm 1934, Kauffmann và White đã thiết lập được bảng cấu trúc khángnguyên đầu tiên và đặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White Từ đó đến

nay, bảng cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn luôn được bổ sung Năm 1993 đã có 2375 serovar Salmonella được định danh (Selbizt và cs,

1995[72]) Năm 1997, số serovar đã lên đến 3000 (Plonait và Birkhardt,

1997[65]) Như vậy, giống Salmonella luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà

chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật

Trước năm 1983, sự tồn tại của nhiều loài Salmonella được chấp nhận

trong phân loại Từ đó vì kết quả của những thí nghiệm cho thấy mức tương

đồng DNA cao, tất cả các chủng Salmonella được xếp thành một loài duy nhất là S Choleraesuis (Salmonella choleraesuis) (Crosa và cs, 1973[48];

S enterica được chia nhỏ thành 6 dưới loài đó là: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houterae và indica, tương ứng với số la mã: I, II, IIIa, IIIb, IV và VI dựa trên sự tương đồng DNA và phạm vi vật chủ Do dưới loài

I có nhiều typ huyết thanh khác nhau nên dưới loài này được phân loại đếntyp huyết thanh Để nhấn mạnh rằng typ huyết thanh không phải là loài riêngbiệt nên tên của typ huyết thanh không viết nghiêng và chữ đầu phải viết hoa

Vì vậy, S choleraesuis có tên đầy đủ là S enterica serotyp choleraesuis, hoặc viết tắt ngắn gọn hơn là S choleraesuis Mặc dù hệ thống phân loại mới này

không được công nhận một cách chính thức bởi ủy ban quốc tế về vi khuẩnhọc hệ thống, nhưng nó đã được tổ chức y tế thế giới và hiệp hội vi sinh vậthọc ở Mỹ chấp nhận sử dụng (Euzéby, 1999[50])

Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh Phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S choleraesuis var kunzendorf, S typhimurium và S typhisuis (Barnes và Sorensen, 1975[33]) Trong một vài trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S dublin và S enteritidis Hai serotyp S dublin và S enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ Những

báo cáo gần đây cho thấy: Ở một số nước như Mỹ, Canada, Anh và Bắc Đài

Loan đã phân lập được S choleraesuis từ người bị bệnh (Khakhria &

Johnson, 1995[57]; Chiu và cs, 1996[41]; Su và cs, 2001[74]) Từ việc tìm

thấy vi khuẩn Salmonella trong động vật ốm, sản phẩm động vật, trong nước

và trong các dụng cụ chăn nuôi , các tác giả đã có những đề xuất về các giảipháp tổng hợp cần thiết nhằm tránh sự lây lan vi khuẩn trong hệ sinh thái môitrường để bảo vệ sức khỏe

Nguồn tàng trữ Salmonella chủ yếu là đường tiêu hoá của người và động vật mắc bệnh Một vài loài như S typhi, S paratyphi A, S paratyphi B,

S paratyphi C chỉ ký sinh ở người Những loài khác hay gặp hơn như: S choleraesuis, S enteritidis chủ yếu ký sinh ở động vật nhưng cũng có khả

năng gây bệnh cho người

Do tính chất gây bệnh của vi khuẩn Salmonella không những cho gia

súc, gia cầm, động vật máu nóng, máu lạnh và cả ở trên người nên từ lâutrong nhân y và thú y, người ta đã quan tâm nghiên cứu các đặc tính sinh học,yếu tố gây bệnh và các biện pháp phòng và điều trị bệnh do chúng gây ra

Wilcock và Schwartz (1992)[80] thì tại nước Anh, năm 1972 tìm thấy

vi khuẩn Salmonella có trong phân lợn là 9,9%, năm 1973 tìm thấy vi khuẩn

Salmonella trong hạch ruột là 7,3%.

Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002)[32] cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở

lợn sau cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ

4,5% Tác giả cũng cho biết S typhimurium được phân lập thấy nhiều nhất ở

lợn sau cai sữa là 72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%

Kishima và cs (2008)[58] đã điều tra tỷ lệ nhiễm và phân bố của vi

khuẩn Salmonella trong phân lợn khỏe mạnh bình thường trên toàn lãnh thổ

Nhật Bản giữa năm 2003 và năm 2005 là 3,1%

Theo Barnes và Sorensen (1975)[33];Wilcock và Schwartz (1992)[80]:

Ở lợn, cần phân biệt 2 dạng bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, đó là bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S choleraesuis var kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do S typhimurium Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài S dublin và S entertidis gây ra Ở cừu, do S abortus ovis, S montevideo, S dublin, S anatum gây ra Ở ngựa do S abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và chim do S pullorum, S gallinarum, S typhimurium và S enteritidis gây ra.

Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể được sử dụng đểđiều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa Tuy nhiên, do việc sửdụng rộng rãi kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nên đã xuất hiện các

chủng vi khuẩn Salmonella kháng thuốc (Kishima và cs, 2008[58]).

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu gen kháng

kháng sinh DT104 ở vi khuẩn Salmonella Chủng đa kháng thuốc S typhimurium DT104 được phát hiện lần đầu tiên ở người mắc Salmonellosis

tại Anh vào năm 1980 Sau đó được quan sát thấy cả ở người cũng như vậtnuôi trên khắp thế giới vào những năm 90 và hiện đang là mối quan ngại hàng

đầu đối với sức khỏe cộng đồng Gen này thường xuất hiện ở các serotyp S typhimurium và ít thấy ở các serotyp khác Một tổ hợp kháng thuốc điển hình của S typhimurium DT104 là kháng đồng thời với 5 loại kháng sinh, bao

gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamide vàTetracycline (ACSSuT) (Kishima và cs, 2008[58]) Tuy nhiên, không cóchiều ngược lại, tức là nếu các kết quả xác định lâm sàng cho thấy một chủng

vi khuẩn kháng với cả 5 loại kháng sinh này thì vẫn chưa đủ căn cứ để kếtluận là chủng vi khuẩn này có mang gen kháng kháng sinh DT104 (Kishima

và cs, 2008[58]) Cũng theo tác giả, có 61,5% số chủng thuộc serotyp S typhimurium có mang gen DT104.

Selbitz (1995)[72] còn cho biết: “genom” của Salmonella được nghiên

cứu tương đối kỹ Cho đến nay ít nhất đã chứng minh được 750 gen, trong đó

có 680 gen đã có trong bản đồ gen

Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều

các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Mục đích của các nghiên cứunày nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi

bệnh do Salmonella gây ra ở động vật và ở người

2.1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người

và gia súc cũng đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 50 Viện Pasteur

Sài Gòn trong những năm (1951-1953) đã phân lập được 6 chủng Salmonella

ở người (4 chủng từ máu, 2 chủng từ nước tiểu) Cũng ở Sài Gòn, trong thời

gian này đã phân lập được 35 chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S cholereasuis (Đỗ Đức Diên, 1999[7])

Năm 1989, Nguyễn Thị Nội và cs[19] đã tiến hành điều tra tình hìnhnhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc đã tìm

thấy 37,5% lợn nhiễm Salmonella Trước tình hình như vậy, nhóm tác giả này

đã nghiên cứu và chế tạo thành công vacxin đa giá Salsco phòng bệnh ỉa chảycho lợn con Vacxin đã được áp dụng để phòng bệnh có hiệu quả ở nhiều trạichăn nuôi lợn, tỷ lệ lợn bị tiêu chảy giảm từ 30-50%, tỷ lệ lợn chết do tiêu

chảy giảm xuống còn 10-20%.

Lê Văn Tạo và cs (1994)[27] đã phân lập và xác định serotyp của vi

khuẩn Salmonella gây bệnh ở lợn, kết quả cho thấy: 50% các chủng phân lập được thuộc S choleraesuis; 12,5% S enteritidis; 6,25% S typhimurium và số

còn lại thuộc các serotyp khác

Trần Xuân Hạnh (1995)[11] đã phân lập và giám định vi khuẩn

Salmonella ở lợn tại Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S typhisuis ở lợn bệnh là 16,9%; ở lợn bình thường 6-16 tuần tuổi là 4,2%; S paratyphi ở lợn 6-16 tuần tuổi là 2,8% Đặc biệt, vi khuẩn S choleraesuis chiếm 38,7% ở lợn

bệnh và 2,8% ở lợn bình thường

Theo Phùng Quốc Chướng (1995)[2] ở Tây Nguyên, mùa khô lợn mắc

bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là 20,03%, vụ đông là 28,66% Tạ Thị

Vịnh và cs (1996)[31] đã kiểm tra 75 mẫu phân lợn khoẻ và 65 mẫu phân lợnbệnh tại một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây) và Gia Lâm (Hà Nội) cho thấy:

Tỷ lệ nhiễm Salmonella cao 30-56% ở lợn khoẻ trong giai đoạn 22-60 ngày tuổi Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn mắc hội chứng tiêu chảy cao hơn lợn bình

thường và tăng dần theo lứa tuổi, dao động từ 70-90%

Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4

cơ sở chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs (2000)[21]

cho biết: Tỷ lệ tìm thấy Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy nuôi tại 4 cơ sở

trên là 80% Đây là điều đáng lo ngại đối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta

Theo Nguyễn Bá Hiên (2001)[13], tỷ lệ nhiễm Salmonella ở các đàn

lợn, ngoại thành Hà Nội cao nhất là lợn trên 60 ngày tuổi (88,23%), thấp nhất

là lợn từ 1-21 ngày tuổi (73,68%)

Ngoài ra ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella cũng đã và đang

được rất nhiều tác giả quan tâm Lê Minh Sơn (2003)[25] đã xác định tỷ lệ

nhiễm Salmonella trong thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% và

thịt lợn xuất khẩu trung bình 1,42% Tô Liên Thu (2005)[30] đã xác định tỷ lệ

nhiễm Salmonella của các mẫu thịt gà ở Hà Nội là rất cao: 33% các mẫu lấy

tại siêu thị, 40% các mẫu lấy từ chợ Lò mổ là một mắt xích quan trọng có

nguy cơ cao ô nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ Trần Thị Hạnh và

cs (2009)[12] đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các cơ sở giết mổ lợn

công nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫulau thân thịt là 70%, mẫu lau hậu môn 66%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờgiết mổ là 40%, mẫu lau sàn giết mổ là 28%, còn các mẫu nước kiểm tra

không phát hiện Salmonella Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ

giết mổ là 87,5%, ở mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫulau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%,mẫu nước là 50%

Cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn, các biện pháp phòngbệnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, trong đó có vacxinphòng bệnh Nguyễn Văn Lãm (1968)[15] đã tiến hành nghiên cứu chế vacxin

Phó thương hàn lợn con từ chủng Salmonella chuẩn của Trung Quốc Hiện

nay, các loại vacxin phòng bệnh Phó thương hàn đã được một số công ty, xínghiệp thuốc thú y sản xuất như vacxin nhược độc chủng TS – 177, vacxin có

bổ trợ như vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu

Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện để

từ đó đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn

thực phẩm, bảo vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết

2.2 Một số đặc điểm của vi khuẩn Salmonella

Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm 2 loài: S enterica và S bongori đã được phân chia

thành trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấutrúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng

nguyên vỏ (kháng nguyên K) Gần đây, loài S enterica đã được phân thành 6

phân loài đó là: S enterica subsp enterica, S enterica subsp salamae, S enterica subsp arizonae, S enterica subsp diarizinae, S enterica subsp houtenae, S enterica subsp indica Trong đó phân loài S enterica subsp enterica gồm phần lớn các chủng Salmonella là những tác nhân gây bệnh cho

người và động vật (Quinn, 2002[68])

2.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo Bergeys Manual (1994)[37], vi khuẩn Salmonella là những trực

khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 m, bắt màu Gram

âm, không hình thành nha bào và giáp mô Đa số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S gallinarum-pullorum)

Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di động Lông có hình tròn, dài,xuất phát từ màng cytoplasma Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắnnên có thể co giãn và di động nên lông của chúng rất khó nhuộm Nếu nhuộmbằng phương pháp Haschem (1972) thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển

vi điện tử (Lê Văn Tạo, 1993[26]) Lông có tính kháng nguyên và do các gen

mã hóa tổng hợp protein riêng quy định

Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella đều có các

cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili Chúng có kích thướcchừng 0,01- 0,03 x 1,0 m Số lượng fimbriae trên 1 vi khuẩn có khoảng 250-

400 cái vươn thẳng ra xung quanh bề mặt tế bào Fimbriae có cấu trúc làprotein và có tính kháng nguyên đặc trưng Theo Jones và cs (1981)[56]:Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu

mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc

2.2.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ

nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển được ởnhiệt độ từ 6- 42oC Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ được tạp khuẩn mà

Salmonella vẫn phát triển được (Timoney và cs, 1988[76]) pH thích hợp cho

vi khuẩn phát triển là 7,6, tuy nhiên vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6-9

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water)

và môi trường RV (Rappaports Vassiliadis) sau vài giờ nuôi cấy thấy môitrường vẩn đục nhẹ, sau 18 đến 24 giờ thấy canh trùng đục đều, trên mặt môitrường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn

Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc được các nhà vi sinh vật

thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập Salmonella như môi

trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar), sau 24 giờnuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S), cómàu vàng nhạt Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu đen

Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩnlạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng

Trên môi trường thạch CHROMTM Salmonella, sau 24 giờ nuôi

cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và cómàu tím hồng

Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella

do sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu đỏ (pH=7,3), đáy ốngnghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose Phầngiữa ống nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu để lâu (quá

24 giờ), màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần đáy ốngnghiệm (không nhìn thấy màu vàng) Vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch, có khiđẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm (Quinn và cs, 2002[68])

Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làmchuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt

Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay

đổi màu môi trường

2.2.3 Đặc tính sinh hoá

Theo Quinn và cs (2002)[68], giống vi khuẩn Salmonella được chia

thành 7 phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường

nhất định và không đổi Phần lớn phân loài S enterica subsp enterica gây

bệnh cho động vật máu nóng Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit,

Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol Cũng ở nhóm này, hầu

như các chủng vi khuẩn Salmonella đều không lên men Lactoza và Saccaroza.

Đa số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy

Gelatin, không phân giải Urê, không sản sinh Indol Phản ứng MR, Catalaza

dương tính (trừ S choleraesuis, S gallinarum-pullorum có MR âm tính).

Phản ứng Oxidaza âm tính Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S paratyphi

A, S typhisuis, S choleraesuis) (Ewing và Edwards, 1970[49]).

Trong quá trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella thì đặc tính

sinh hóa có ý nghĩa rất quan trọng Đây là bước không thể bỏ qua khi xét

nghiệm vi khuẩn nói chung và vi khuẩn Salmonella nói riêng.

2.2.4 Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng mạnh.

Ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặcánh sáng mặt trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt được vi khuẩn (Laval,2000[16])

Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như:Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút

Theo Laval, (2000)[16], vi khuẩn Salmonella sống được lâu trong điều

kiện lạnh, chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở điều kiện môitrường có độ pH ≤ 5 chúng chỉ sống được trong thời gian ngắn

Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất độn chuồng tới trên 30 tuần, có

thể sống ở trong đất với độ sâu 0,5cm trong thời gian 2 tháng Ở sàn gỗ, tường

gỗ trong điều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày (Đào Trọng Đạt

và cs, 1995[10]) Trong nước tù đọng, đồng cỏ ẩm thấp S typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100

ngày, trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1970[22])

2.2.5 Đặc điểm dịch tễ học của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi, phân bố ở khắp

nơi trên thế giới, vì vậy các nghiên cứu về cách truyền lây của vi khuẩn nàyđược nhiều nhà khoa học nghiên cứu Một đặc điểm dịch tễ quan trọng của

Salmonella là trạng thái mang trùng và thải trùng của gia súc.

Theo Archie Hunter (2002)[14], một nguồn bệnh đặc biệt quan trọng là

gia súc mang vi khuẩn Salmonella nhưng không biểu hiện lâm sàng Những

con này có thể thải mầm bệnh ra ngoài môi trường trong vài tháng Tác giảcũng cho biết cách lây lan như sau: Gia súc nhiễm bệnh thải vi khuẩn

Salmonella vào trong phân và bệnh xảy ra do tiếp xúc trực tiếp hay ô nhiễm

phân vào thức ăn, nước uống hay chuồng trại gia súc

Theo Gray và cs (1995)[54] , các lợn nhiễm S choleraesuis thường biểu

hiện các dấu hiệu lâm sàng từ 36-48 giờ sau khi nhiễm trùng và có 103- 106đơn vị vi khuẩn trong 1 gram phân vào giai đoạn bệnh cao nhất Cũng theo tácgiả thì phần lớn những lợn nhiễm tự nhiên sau khi khỏi bệnh, có thể loại thảihoàn toàn vi khuẩn vào giữa 9-12 tuần sau khi nhiễm trùng Điều này cho thấyrằng tình trạng mang trùng lâu dài này có thể dẫn tới sự nhiễm khuẩn môitrường và sự tái nhiễm tiếp theo của những động vật mới đưa vào trại

Nhiều nhà khoa học khi nghiên cứu về đường nhiễm Salmonella đều cho rằng: Vi khuẩn Salmonella theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa và có

thể do tiếp xúc Bình thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gâybệnh Chỉ khi nào sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu

và nội tạng gây bệnh Bệnh Phó thương hàn chỉ gây thành dịch địa phương,dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu đàn, tình hình vệ sinh thú y, chế độ chăm sócnuôi dưỡng và đặc điểm dịch tễ học của cơ sở đó (Phan Thanh Phượng,1988[23]; Nguyễn Như Thanh, 2001[28]; Laval, 2000[16])

Theo Phan Thanh Phượng (1988)[23], tỷ lệ lợn mắc bệnh do Salmonella

gây ra thường tăng lên vào thời kỳ lợn cai sữa, vì lúc đó cơ thể lợn con thayđổi, dễ nhiễm bệnh Nguyễn Như Thanh (2001)[28], cũng cho biết: vi khuẩngây ra bệnh Phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ lệ tử vong

khoảng 25%, có khi lên đến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mãn tính và ítgây chết.

Bệnh ít xảy ra ở lợn con trước cai sữa, bởi chúng được bảo hộ nhờ khángthể có trong sữa đầu của lợn mẹ Song nguy cơ nổ ra bệnh tăng dần theo lứatuổi, đặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ động chưa thể bùđắp kịp thời để thay thế miễn dịch thụ động (Laval, 2000[16])

2.2.6 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao

gồm 3 loại chính:

Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ

* Kháng nguyên thân O (O- Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúcLipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoàicủa thành tế bào vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable)

và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên Ogồm 2 nhóm chính:

- Polysaccharide không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng củakháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S(Smooth) sang dạng R (Rough) và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn(Selbitz, 1995[72])

- Polysaccharide nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính khángnguyên và đặc trưng cho từng serotyp

Kháng nguyên O được xem như là một nội độc tố (Endotoxin) mà nóđược cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp Glyco- polypeptide có thể tìm thấy ở màngngoài của vỏ bọc vi khuẩn

Theo CIRAD (2006)[43], kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có

67 loại chính, được chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại đóng vai trò phụ.

* Kháng nguyên lông H (H- Antigen)

- Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lôngcủa vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kémbền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60oC sau 1 giờ, dễphá hủy bởi cồn và axit yếu (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001[28])

* Kháng nguyên vỏ (K- Antigen)( hay Vi- Antigen)

Theo Quinn và cs (2002)[68], kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài

như S typhi, S paratyphi S dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ,

kháng nguyên K có thể làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả,

nếu đun sôi huyễn dịch của các loài Salmonella này trong 10 đến 12 phút sẽ

phá hủy được kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên vỏ là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết

kháng thể O khi phát triển nhiều Kháng nguyên này chỉ gặp ở 2 serotyp là: S typhi và S paratyphi C, ký hiệu kháng nguyên hay Vi trong công thức đứng

sau kháng nguyên O Theo sơ đồ của Kauffmann – White; công thức kháng

nguyên của S paratyphi C là: 6,7, Vi: -1,5 và S Typhi là: 9, 12, Vi: c,d.

Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên

H là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong công tác chẩn đoán

2.2.7 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella

2.2.7.1 Các yếu tố không phải là độc tố

a) Kháng nguyên O

Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh

hưởng tới độc lực của vi khuẩn Salmonella Cụ thể là: S typhimurium nếuthay đổi thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vikhuẩn từ dạng có độc lực chuyển sang dạng không có độc lực (Valtonen,1977[78])

Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năngphòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại

sự thực bào của đại thực bào (Morris và cs, 1976[60])

Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thànhkháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệnày giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

Đến nay, người ta đã xác định được trên 3000 serotyp kháng nguyên O

của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S choleraesuis gồm:

O6, O7; S typhimurium gồm: O1, O4, O5, O12; S enteritidis gồm: O1, O9, O12

c) Kháng nguyên K

Bản chất hóa học của kháng nguyên K là Polysaccharide, nhưng thực

chất chúng chỉ là thành phần của kháng nguyên O Kháng nguyên K tạo hàngrào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thựcbào (Nguyễn Như Thanh, 2001[28])

d) Yếu tố bám dính

Theo Jones và Richardson (1981)[56] khả năng bám dính của vi khuẩn

Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi đầu quan trọng trong quá

trình gây bệnh Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừamang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học và được thực hiện theo 3bước:

Bước 1: Vi khuẩn liên kết từng phần với bề mặt tế bào, thực hiện quátrình này đòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động

Bước 2: Là quá trình hấp phụ, phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của vikhuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và được thực hiện theo hướng thuậnnghịch với sự tương hỗ của những tác động khác nhau

Bước 3: Là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn vớicác điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào Yếu tố bám dính của vi khuẩn được sắpxếp trên các fimbriae

Theo Lê Văn Tạo (1993)[26], trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có

từ 250- 400 fimbriae, chúng giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung maoruột non để gây bệnh

Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] đã công bố: S typhimurium phân lập từ

lợn mắc bệnh Phó thương hàn có khả năng bám dính lên bề mặt tế bào Verovới tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%) Kết quả này tương đương với khả năng

bám dính của chủng S typhimurium chuẩn.

e) Yếu tố xâm nhập

Theo Finlay và cs (1988)[52], khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân

hoặc lớp niêm mạc của đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella

có độc lực Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế

bào thường là các chủng không có độc lực.

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng

hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thayđổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hìnhthành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi

khuẩn Sau đó Salmonella được xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục

nhân lên với số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đường ruột(Enterotoxin), làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ (Frost và cs,1997[53])

f) Khả năng tổng hợp sắt

Theo Benjamin (1985)[34], đây là một yếu tố giúp vi khuẩn Salmonella

tăng nhanh về số lượng làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ do bị

thiếu sắt Cũng theo tác giả, vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay đổi

cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyểntoàn bộ protein màng điều phối sắt lên bề mặt của tế bào vi khuẩn, làm chokhả năng hấp thu sắt tăng cường một cách rõ rệt

Khả năng kháng kháng sinh có thể thay đổi, phụ thuộc vào địa phương,thời điểm làm kháng sinh đồ và loại vật nuôi

Trên đây là 7 yếu tố gây bệnh không phải là độc tố của vi khuẩn

Salmonella Các yếu tố này bằng những cơ chế tác động khác nhau, phương

thức tác động khác nhau, đã tạo điều kiện bất lợi cho cơ thể vật chủ, đồng thời

chúng lại tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Salmonella gây bệnh Chính vì

thế các yếu tố không phải là độc tố đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá

trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella Vì vậy, việc nghiên cứu các yếu tố

này là hết sức cần thiết, góp phần quan trọng trong việc phòng chống bệnh do

vi khuẩn Salmonella gây nên.

2.2.7.2 Các yếu tố là độc tố

Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân

gián tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì

các yếu tố gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh

bệnh Các yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố

(Endotoxin), ngoại độc tố đường ruột (Enterotoxin) và độc tố tế bào(Cytotoxin) (Finlay và Falkov, 1988[52])

a) Độc tố đường ruột (Enterotoxin)

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính:

Độc tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuấtchậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Peterson, 1980[64])

+ Theo Clarke và cs (1988)[44], độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc

thành phần giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat-stabile

toxin: ST)

Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô

của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làmtrương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ST có khả năng chịu đượcnhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -

20oC Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗipolypeptide

Độc tố RPF kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tếbào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP Trong tế bào, GDP tăng cao làmcho nồng độ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải

và nước ở trong xoang ruột Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kíchthích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy.

Theo Đỗ Trung Cứ (2001)[4]: 72,7% các chủng Salmonella phân lập được

từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi Phó thương hàn sản sinh độc tố chịu nhiệt

+ Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat Labile Toxin: LT) Nó

thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ.DPF bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ Cấutrúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptide và một số hợp chất khác, phân tử lượng40.000- 50.000 dalton

Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi

nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ

mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi củathành ruột gây tiêu chảy

Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] đã kết luận: 81,81% số chủng S typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu

nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm

b) Nội độc tố (Endotoxin)

Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và được cấu tạobởi thành phần cơ bản là Lipopolysaccharide (LPS) LPS có cấu tạo phân tửlớn, gồm 3 vùng riêng biệt với các đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưanước, vùng lõi và vùng lipit A

Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysaccharide chứa các đơn vị cấutrúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là acid heterooligosaccharide, ởtrung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A Vùng lipit A đảm nhận chứcnăng nội độc tố của vi khuẩn Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc củakháng nguyên O Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực

của Salmonella Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho

Salmonella không còn độc lực (Trần Quang Diên, 2002[8]).

Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein Điều đóchứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt động của nội độc tố Vùng đa đườngPolysaccharide, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan (Bradley,1979[39])

Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải.Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tếbào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm baocầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách

Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc

tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với cácbiểu hiện bệnh lý như: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào,toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn

c) Độc tố tế bào (Cytotoxin)

Đặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Proteincủa tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell)

Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ

Theo Clarke và cs (1988)[44], làm tổn thương tế bào biểu mô là đặctính quan trọng của Cytotoxin Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin:

+ Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin Độc tốnày có trọng lượng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác động theo cơ chế là ứcchế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

+ Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu

trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E coli (ETEC) sản sinh ra Dạng độc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh.

+ Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin Dạng độc tố này tácđộng lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào Trong phòng thínghiệm, độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO

(Rahman và cs, 1992[69]).

Trên đây là 3 loại độc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella,

chúng là các tác nhân trực tiếp, quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Một số serotyp như: S choleraesuis, S typhimurium, S enteritidis, S dublin, S gallinarum, S pullorum có mang các plasmid có kích thước lớn

(khoảng từ 50- 100 kb) Chính những plasmid này có mang các yếu tố ditruyền quyết định khả năng sản sinh các yếu tố độc lực gây bệnh cho người vàgia súc với tỷ lệ ốm và chết cao (Krause và Fang, 1995[59])

2.3 Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn

2.3.1 Đặc tính sinh bệnh

Theo Quinn và cs (2002)[68], sự lây truyền Salmonella thường qua con

đường phân-miệng, nhưng nhiễm trùng qua niêm mạc của kết mạc mắt vàđường hô hấp trên cũng có khả năng xảy ra

Cũng theo Quinn và cs (2002)[68], Salmonella cần xâm nhập vào ruột

non và kết tràng để gây bệnh đường ruột Tuy nhiên, những axit hữu cơ bayhơi được sản sinh bởi hệ vi sinh vật yếm khí bình thường trong đường ruột có

khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella Hệ vi sinh vật hiếu khí bình

thường cũng có thể ngăn cản việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài

Salmonella Sự rối loạn của hệ vi sinh vật do các yếu tố như: Dùng kháng

sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả năng mẫn cảm của vật chủ với sựnhiễm trùng Nhu động ruột giảm, stress do vận chuyển và chật chội cũng tạo

điều kiện cho sự xâm nhập đường ruột của Salmonella

Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hoá, nhanh chóng đi vào hệlâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết,làm cho lá lách sưng to, lúc đầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nộiđộc tố, gây viêm hoại tử gan và hạch

Bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn có 2 dạng chủ yếu:

Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra và thể

viêm ruột do S typhimurium.

2.3.2 Thể nhiễm trùng huyết do S choleraesuis var kunzendorf gây ra

Bệnh Phó thương hàn lợn thể nhiễm trùng máu xảy ra chủ yếu ở lợn

sau cai sữa do S choleraesuis var Kunzendorf gây nên (Laval, 2000[16]) Lợn

bệnh bỏ ăn, ủ rũ, thích nằm tập trung lại với nhau ở góc chuồng tối hay chuivào ổ rơm, thân nhiệt tăng cao 40,5 – 41,6oC Mí mắt sưng mọng có nốt tímbầm, viêm kết mạc Khi bị biến chứng, gây viêm phổi, ho khan, có dịch đờm.Xuất huyết lấm tấm dưới da, tụ lại thành những vết đỏ thẫm trên da bụng vàtai Sau 3 – 4 ngày bị mắc bệnh, lợn ỉa chảy có màu vàng Tác động lâm sàngcủa bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu rất nghiêm trọng và gây chết.Trong các ổ dịch, tỷ lệ lợn bệnh chết ở mức cao, tỷ lệ những con ốm không cốđịnh, thường dưới 10% tổng đàn (Wilcock, 1995)[81]

Ở thể á cấp tính, hiện tượng ỉa chảy xuất hiện sau 2 – 3 ngày, rồi kéodài cho đến khi lợn chết hoặc khỏi bệnh Phân bài xuất nhiều lần trong ngày,sau đó phân chảy ra liên tục, phân có màu vàng, vàng xám, vàng nâu ở lợncon, còn ở lợn trưởng thành phân nhão, phân nước có lẫn máu Lợn gầy sútnhanh (Laval, 2000[16])

Trên da lợn trưởng thành mắc bệnh cũng xuất hiện các mảng da bị đỏ,hoặc tím bầm ở vùng bụng, tai, bẹn,… sau đó xuất hiện chứng viêm phổi, lợn

ho, thở dốc Những lợn như vậy thường bị chết do chứng viêm phổi thứ phát

15 ngày sau khi bị bệnh Tỷ lệ lợn chết ở lợn bị bệnh thể á cấp tính khoảng 40– 45% Lợn bị bệnh thường mang trùng và đều đặn thải mầm bệnh ra ngoàitheo phân, nhưng khó phát hiện một cách chính xác (Laval, 2000[16])

* Bệnh tích đại thể:

Khi mổ khám lợn bệnh, những bệnh tích đại thể quan sát được baogồm: Các vết tím xanh ở rìa tai, trên bề mặt da bụng, bẹn, chân và đuôi; xuấthuyết lấm tấm dưới da; hạch màng treo ruột, lách và hạch bạch huyết xưngphồng lên, các thuỳ lách cứng lại Trên bề mặt gan có điểm hoại tử nhỏ màuhơi trắng Xuất hiện những đám hoại tử màu hồng như trứng gà tây ở thận và

phổi viêm (Trương Văn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9]).

* Bệnh tích vi thể:

Lưới nội mô và hạch bạch huyết tăng trưởng; hoại tử điểm trắng ở gan;xuất huyết và hoại tử ở hạch bạch huyết của màng treo ruột, màng phổi, màngbụng, màng bao tim, thận và màng não lấm tấm xuất huyết (Trương VănDung và Yoshihara Shinobu, 2002[9])

Theo Wilcock (1995)[81], dấu hiệu biến đổi bệnh tích vi thể là do

Salmonella gây ra là ở hạch lympho màng treo ruột: Sưng, xung huyết, xuất

huyết và có điểm hoại tử màu xám, trên bề mặt gan thấy xuất hiện điểm hoại

tử mô bào Những biến đổi bệnh tích vi thể ở lợn do Salmonella gây ra là

không hề trùng lặp với bất cứ bệnh nào khác ở lợn

* Chẩn đoán:

Chẩn đoán bệnh Phó thương hàn thể nhiễm trùng máu do S choleraesuis var Kunzendorf gây nên không thể chỉ dựa trên các triệu chứng lâm sàng đơn lẻ,

vì các triệu chứng lâm sàng của bệnh giống như nhiều triệu chứng nhiễm trùng

khác ở lợn như bệnh nhiễm trùng do Streptoccocus, bệnh Đóng dấu lợn…

2.3.3 Thể viêm ruột do S typhimurium

Bệnh Phó thương hàn thể viêm ruột thường do các serotyp S typhimurium gây ra ở lợn con từ sau cai sữa đến khoảng 4 – 6 tháng tuổi Các

thể bệnh hay gặp là cấp tính hoặc mãn tính (Laval, 2000[16])

chuyển sang thể mãn tính kéo dài vài tháng Tỷ lệ lợn chết dao động từ 40% –50% Số con còn sống sót chậm lớn, còi cọc Những lợn khỏi bệnh thườngmang trùng và thải mầm bệnh ra ngoài môi trường (Laval, 2000[16]).

* Bệnh tích vi thể:

Sự hoại tử nông hay sâu trên bề mặt của lớp tế bào biểu mô ruột lànhững bệnh lý vi thể đặc trưng của thể viêm ruột; có trường hợp thấy nổi gồlên khỏi niêm mạc xung huyết của ruột những hạt tròn như hạt đậu màu trắngvàng Phần đầu lông nhung trong hồi tràng bị teo ngắn lại Đa số trường hợpthấy mảng payer bị loét dưới đáy như phủ một lớp tổ chức hoại tử màu vàngtrắng, niêm mạc dạ dày có điểm chảy máu rải rác, có một số loét nhỏ tậptrung ở bờ cong nhỏ Gan xung huyết, trên bề mặt gan có thể thấy những nốt

u nhỏ (áp xe) mang tính đặc trưng cho thể bệnh không giống với điểm hoại tửtrong thể nhiễm trùng huyết (Phạm Sỹ Lăng và cs, (2004)[17])

* Chẩn đoán:

+ Chẩn đoán lâm sàng: Ở thể viêm ruột của bệnh Phó thương hàn, căn

cứ vào các triệu chứng điển hình như viêm ruột và dạ dày ở lợn con từ sau caisữa đến 4 tháng tuổi Đồng thời, dựa vào kết quả nuôi cấy, phân lập vi khuẩntrên môi trường pepton và kiểm tra di động trên môi trường thạch và xét

nghiệm huyết thanh học.

+ Chẩn đoán phân biệt với bệnh hồng lỵ; Chứng viêm ruột do

Campylobacter (PHE); Viêm ruột hoại tử; bệnh viêm dạ dày ruột (Transmission Gasto Enteritis- TGE); tiêu chảy ở lợn do E coli Một số tác nhân gây tiêu chảy do vi rút như Rotavirus và Coronavirus gây viêm ruột, bệnh dịch tả lợn, các loại ký sinh trùng như cầu trùng Coccidia…

- Ở bệnh Phó thương hàn, thân nhiệt lợn ốm vẫn giữ cao (41 – 42oC)trong suốt thời gian lợn bị ỉa chảy, điều đó hoàn toàn khác với bệnh hồng lỵ.Hiện tượng tím tái nhiều khu vực trên da lợn bị bệnh Phó thương hàn cũngkhác với lợn bị bệnh hồng lỵ Ở lợn bị bệnh hồng lỵ, phân có màu xám, xám-đen, đen, đen nâu, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn.Lách ở lợn bị bệnh hồng lỵ không bị sưng và không có những biến đổi đặctrưng Màng niêm mạc ruột ở lợn bị bệnh hồng lỵ thường phủ một lớp biểu bìhoại tử, hiện tượng này không có ở lợn bị bệnh Phó thương hàn

Để có thể phân biệt rõ các loại bệnh này thường phải tiến hành các xétnghiệm kiểm tra vi khuẩn trong phòng thí nghiệm

- Ở bệnh viêm ruột do Campylobacter (PHE) thể cấp tính có thể thấy xuất

huyết ruột hay tiêu chảy cấp tính hoặc mãn tính, tổn thương thường lan tràn, làmmất đi những bệnh tích nhỏ, lớp niêm mạc nằm dưới các ổ hoại tử có dấu hiệutăng sinh rất rõ Để tránh nhầm lẫn, cần xét nghiệm, phân lập vi khuẩn

- Đối với bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn C perfringens, bệnh xuất

hiện trong vòng một vài ngày đầu của lợn sơ sinh, lợn bệnh không sốt Hiệntượng tiêu chảy làm cho niêm mạc hậu môn bị tổn thương, có màu đỏ Lợnbệnh chết nhanh Giải phẫu ruột thấy có phủ một lớp hoại tử màu vàng hoặcnhững khối hơi sáng, dễ nát, dính chặt vào niêm mạc ruột Nhung mao củakhông tràng và tiểu nang là nơi xét nghiệm thấy trực khuẩn Gram (+) (TrươngVăn Dung và Yoshihara Shinobu, 2002[9])

- Bệnh viêm dạ dày ruột (TGE) thường mắc và tỷ lệ chết cao ở lợn dưới

2 tuần tuổi Khi mổ khám, thấy dạ dày sưng to với các cục sữa vón, ruột nonsưng to với bọt khí màu vàng và hình thành các cục sữa do không tiêu hoáđược, thành ruột mỏng, gần như trong suốt Các lông nhung của không tràng

và hồi tràng bị teo đi

- Chẩn đoán phân biệt bệnh do Salmonella gây ra ở lợn với các bệnh do

E coli và bệnh dịch tả lợn có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tiễn.

- Lợn bị tiêu chảy do vi khuẩn E coli gây ra ở lứa tuổi sau cai sữa (4- 9

tuần tuổi) cũng khá phổ biến, lợn có biểu hiện phù mắt, phù đầu nên còn gọi

là bệnh phù đầu lợn con Mổ khám bệnh tích thấy tụ máu trong ruột non, cóthể nhìn thấy chất chứa trong ruột non vì thành ruột mỏng và lông nhung

không bị phá huỷ Ở bệnh do Salmonella, lợn tím vành tai, da bụng và vùng

bẹn Các biến đổi bệnh lý ở ruột có tính đặc trưng như mô tả về phần bệnh

tích đại thể và vi thể của bệnh do Salmonella.

- Bệnh dịch tả lợn xảy ra và lây lan nhanh ở tất cả các lứa tuổi lợn.Hiện tượng ỉa chảy ở lợn bị bệnh dịch tả lợn xuất hiện khi nhiệt độ cơ thểgiảm, khi sốt cao lợn lại táo bón; còn ở bệnh Phó thương hàn lợn bị ỉa chảykhi thân nhiệt sốt cao 2 – 3 ngày Mổ khám bệnh tích lợn bị bệnh dịch tả thấyxuất huyết ở khắp các hệ thống cơ quan như hạch lympho, thận, bàng quang

và da, nhồi huyết ở lách, hạch lympho có màu đá hoa cương, viêm loét hìnhcúc áo trên niêm mạc bị viêm Điều trị bằng kháng sinh, lợn không khỏi bệnh,trong khi dùng kháng sinh điều trị bệnh Phó thương hàn có tỷ lệ khỏi cao

2.4 Biện pháp phòng trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn

2.4.1 Phòng bệnh

Phòng bệnh Phó thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuôi lợntập trung quy mô lớn và chăn nuôi lợn nái có nhiều lợn con là một việc quan

trọng, vì đặc điểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella không dễ dàng

khống chế và yêu cầu của quá trình phòng bệnh là phải thực hiện được triệt đểcác nội dung như tiêm phòng vacxin, vệ sinh khử trùng tiêu độc, quản lý chăn

nuôi, sử dụng chế phẩm sinh hoá học…

2.4.2 Điều trị bệnh

Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phòng bệnhtổng hợp như vệ sinh thú y, chăm sóc, nuôi dưỡng, đồng thời phải chẩn đoánbệnh kịp thời thì mới nâng cao hiệu quả chữa bệnh

- Sử dụng kháng huyết thanh Phó thương hàn

Kháng huyết thanh phó thương hàn được chế bằng cách: Gây tối miễn

dịch cho bò đực thiến bằng canh trùng vi khuẩn S choleraesuis chứa độc tố

được vô hoạt bằng formol Tiêm bắp 30 – 60ml cho lợn dưới 45 ngày tuổi; 50

- 80ml cho lợn 45 ngày tuổi trở lên

- Điều trị bằng kháng sinh

Cho đến nay, việc dùng kháng sinh chữa bệnh Phó thương hàn cần chú

ý loại trừ các loại kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng được nhiều tác giả thôngbáo như Streptomycin, Ampicillin,… Cũng phải loại trừ các kháng sinh vikhuẩn mẫn cảm nhưng đã bị cấm sử dụng như Chloramphenicol, Furazolidon,

… Có nhiều loại kháng sinh mà các công ty, xí nghiệp thuốc thú y trong vàngoài nước sản xuất dùng cho điều trị bệnh Phó thương hàn Khi sử dụng theođúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Tốt nhất là làm kháng sinh đồ trên môi trường thạch đĩa để đánh giá vàchọn loại kháng sinh điều trị có hiệu quả nhất

2.5 Một số hiểu biết về vacxin và vacxin phòng bệnh Phó thương hàn

Vacxin cổ điển hay vacxin thế hệ mới đều là một chế phẩm sinh họccủa vi sinh vật hay tế bào, chứa chính tác nhân gây bệnh hay các sản phẩmcủa chúng (kể cả vật liệu di truyền như ADN hay ARN của chúng), nếu đượclàm giảm độc lực hay vô độc bằng các phương pháp lý, hóa hay sinh học (đốivới vacxin cổ điển) hoặc các phương pháp sinh học phân tử (đối với vacxinthế hệ mới), lúc đó chúng không còn khả năng gây bệnh đối với đối tượngđược hưởng vacxin (là người và động vật), nhưng khi đưa vào cơ thể bằng các

phương pháp khác nhau, đều có khả năng kích thích cơ thể sinh miễn dịchthuộc các loại hình như miễn dịch dịch thể (humoral immunity) hay miễn dịchqua trung gian tế bào (cellular- mediated immunity).

Khi cơ thể đã tiếp nhận vacxin, miễn dịch được tạo ra chính là sự huyđộng toàn bộ hệ thống miễn dịch tham gia, bao gồm hệ thống miễn dịch trungương và hệ thống miễn dịch ngoại biên cũng như sự tham gia của nhiều loại tếbào có thẩm quyền miễn dịch khác

Cơ thể chịu sự kích thích của kháng nguyên (do vacxin đưa đến) đã sảnxuất một loại protein mới có chức năng bảo vệ và là thành phẩm tham gia tạonên miễn dịch cho cơ thể gọi là kháng thể (antibody)

Với một cơ thể đã được miễn dịch, khi vi sinh vật gây bệnh xâm nhậpvào, chúng sẽ không thực hiện được quá trình gây bệnh và nhanh chóng bịloại trừ ra khỏi cơ thể

Điều kiện cần của một vacxin: một vacxin phải có đủ 3 điều kiện chính:

An toàn, vô trùng và có hiệu lực

An toàn là tiêu chuẩn đánh giá khi sử dụng vacxin trên chính đối tượngđược hưởng, tức là vacxin không được gây bệnh và không hay ít gây phảnứng có hại

Vô trùng tức là vacxin chỉ chứa duy nhất một hay một vài loại đượcchọn làm vacxin mà không bị nhiễm tạp các loại khác

Hiệu lực điều quan trọng nhất là vacxin phải có hiệu lực, tức là vacxinphải kích thích sinh miện dịch cho cơ thể Tính hiệu lực thực chất là mức độbiểu hiện gây miễn dịch của kháng nguyên Vacxin có hiệu lực cao hay thấptức là mức độ gây miễn dịch của vacxin đó

Vacxin Phó thương hàn lợn cũng nằm trong cơ chế này Bệnh Phó

thương hàn do vi khuẩn Samonella gây ra ở lợn đã được biết đến từ những năm

đầu của thế kỷ XX Do đó, cùng với quá trình nghiên cứu chi tiết về vi khuẩn,các biện pháp phòng bệnh đã được nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên thế

giới quan tâm nghiên cứu, trong đó có vacxin phòng bệnh.

Hiện nay đã có nhiều loại vacxin để phòng bệnh Phó thương hàn nhưvacxin nhược độc chủng TS – 177 và vacxin nhược độc có bổ trợ như vacxinkeo phèn hay vacxin nhũ hoá có bổ trợ dầu Vacxin chống một số chủng phổ

biến là S typhimurium, S dublin, S choleraesuis,…

Ưu điểm của vacxin nhược độc: Vacxin có hiệu quả cao có khả năngkích thích sinh miễn dịch cục bộ trong ruột nên có khuynh hướng làm giảm sự

xâm nhiễm của Salmonella qua ruột Vacxin tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào nên bảo hộ được vật nuôi chống lại Salmonella xâm nhiễm đại thực

bào Nhưng cũng có những hạn chế của vacxin nhược độc: Không ổn định vềmặt di truyền; khó kiểm soát được ảnh hưởng của chủng vacxin nhược độc vớimôi trường và các động vật khác

Ưu điểm của vacxin vô hoạt: là an toàn với môi trường, động vật và conngười, nhưng cũng có hạn chế là vacxin không có khả năng tăng sinh tế bào T

gây độc và không bảo hộ gia súc hiệu quả từ sự xâm nhiễm Salmonella ở niêm

mạc ruột như vacxin nhược độc

Xu hướng nghiên cứu vacxin phòng Salmonella trên thế giới và ở Việt

Nam là sản xuất vacxin theo con đường tái tổ hợp gen Ưu điểm của vacxin nàylà: Thành phần protein tinh khiết; an toàn vì thành phần vacxin chỉ là proteinkháng nguyên tinh chế; có thể phối hợp các kháng nguyên để tạo thành vacxin

đa giá, nhưng cũng có những nhược điểm như: Chủng sản xuất vacxin bị lọt rangoài và chuyển tính trạng kháng kháng sinh cho vi khuẩn ngoài môi trường;không có khả năng kích hoạt tế bào T gây độc nên đáp ứng miễn dịch kém; ít

có hiệu quả khi có biến chủng xảy ra

Ở nước ta, để phòng bệnh Phó thương hàn, các loại vacxin đã được một

số công ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất và sử dụng phổ biến hiện nay như sau:

+ Vacxin Phó thương hàn heo do công ty (NAVETCO) sản xuất, là

vacxin vô hoạt chế từ vi khuẩn S choleraesuis chủng Kunzendorf 1 ml

vacxin chứa 1010 tế bào vi khuẩn, chất bổ trợ là keo phèn Tiêm dưới da hoặcbắp thịt cho heo con 2 lần: lần 1 (heo từ 20 – 30 ngày tuổi) liều 1 ml/con; lần

2 cách lần một sau 3 tuần, liều tiêm như lần 1

+ Vacxin Phó thương hàn lợn do Xí nghiệp thuốc thú y TW sản xuất,

dạng nước, chế tạo từ toàn bộ canh trùng (giải độc tố và tế bào) của S choleraesuis kháng nguyên typ O: 6,7; H: 1,5 vô hoạt bằng formalin, bổ trợ

keo phèn Tiêm dưới da cho lợn con từ 20 ngày tuổi 2 lần, cách nhau 7 –

15 ngày; lợn sau cai sữa 5 ml/con/lần Có thể tiêm vacxin 2 – 3 lần cho lợn

mẹ ở thời kỳ tháng đầu có chửa để phòng bệnh cho lợn con ngay sau khi đẻqua sữa mẹ

- Vacxin Phó thương hàn nhược độc đông khô, được chế tạo từ vi

khuẩn nhược độc S choleraesuis typ O: 6,7; H: 1,5 qua tổ chức FAO, vacxin

được chế ở dạng đông khô Mỗi liều vacxin có chứa 2 – 2,5 tỷ vi khuẩn.Vacxin gây miễn dịch nhanh và mạnh Sau khi tiêm 9 – 10 ngày bắt đầu cómiễn dịch vững chắc Vacxin được pha với nước sinh lý hoặc nước cất vôtrùng, mỗi liều pha ra 1 ml, tiêm dưới da hay bắp thịt cho lợn con từ 25 ngàytuổi trở lên, kể cả lợn mẹ có thai ở nửa thời kỳ đầu Liều miễn dịch là 1 mlđồng đều cho các loại lợn

+ Vacxin tam liên do phân viện Thú y Miền Trung sản xuất: Phòng 3bệnh: Phó thương hàn, dịch tả, tụ huyết trùng lợn; vacxin dạng đông khô, tiêmdưới da cho lợn từ 20 ngày tuổi trở lên; liều 2 ml/con/lần, nhắc lại liều trênsau một tuần Đây là loại vacxin có ý nghĩa sử dụng trong thực tiễn cao

Trên đây là các lọai vacxin để phòng bệnh Phó thương hàn đã và đangđược sử dụng trong cả nước Mục đích của chúng tôi trong nghiên cứu này làđưa ra một loại vacxin có chứa những serotyp thường gặp nhất từ những

trường hợp nhiễm bệnh Salmonella lâm sàng ở lợn

3 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

3.1.1 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy nuôi tại

một số tỉnh phía Bắc và xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella ở các cơ

quan phủ tạng của lợn bệnh

3.1.2 Xác định một số đặc tính sinh vật hóa học, serotyp và xác định khả năng

mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được

3.1.3 Xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập được

bằng phản ứng PCR: khả năng sản sinh độc tố, khả năng xâm nhập và khảnăng kháng kháng sinh

3.1.4 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được trên chuột bạch

và gây bệnh thực nghiệm trên lợn

3.1.5 Xác định hiệu lực phòng bệnh của vacxin được chế tạo từ vi khuẩn

Salmonella phân lập được trên động vật thí nghiệm.

3.2 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Lợn con sau cai sữa nuôi tại các trại chăn nuôi ở

Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình

- Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng ViệnThú y

- Thời gian thực hiện: Từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009

3.3 Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu

chăn nuôi tại Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình.

3.3.2 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 18-20 g/con

- Lợn sau cai sữa 35 ngày tuổi khỏe mạnh, chưa được tiêm vacxin Phó

thương hàn

3.3.3 Các loại môi trường, hóa chất

* Các loại môi trường

Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (củacác hãng: Eiken, Oxoid, Biorad, ) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo côngthức có sẵn bao gồm:

- Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM

Salmonella và thạch DHL dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella

- Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng để giám định vi

- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader

- Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)

3.3.4 Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella

Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo,Nhật Bản sản xuất) dùng để định type kháng nguyên O và H của vi khuẩn

Salmonella

3.3.5 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR

- Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, đệm điện

di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm điện di (Gel loading buffer), nhuộm

DNA (Ethidium Bromide)

- Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương gồm: S choleraesuis,

S typhimurium, S enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp.

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- Đối với mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng

của các lợn từ 4- 9 tuần tuổi có triệu chứng tiêu chảy, phân có màu vàng, lẫnchất nhầy, có mùi thối đặc biệt, rồi cho vào các typ vô trùng, bảo quản lạnh

4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm

- Đối với những lợn sau cai sữa bị ốm hoặc chết có các triệu chứng: ỉachảy phân có mùi thối đặc biệt, vùng da bụng, quanh tai và bẹn có những đốm

đỏ hoặc tím bầm, tiến hành mổ khám tại chỗ, rồi lấy các bệnh phẩm như: gan,

lách, hạch ruột, chất chứa ruột non vào các túi nilon riêng rẽ, máu tim đượchút vào sơranh, bảo quản ở 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm

3.4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp

Được tiến hành dựa trên cơ sở quy trình phân lập và giám định vikhuẩn của Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng đồng, trường Đại học NôngNghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản, với một số cải tiến để phù hợp với điềukiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam

Sơ đồ 3.1 trình bày tóm tắt quy trình phân lập và giám định vi khuẩn

Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm

Hình 3.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella

từ các mẫu bệnh phẩm và phân

Bệnh phẩm(Phân, máu tim, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột)

BPW(370C/ 18- 24 h)

LIM

(370C/ 20- 24 h)

Malonate(370C/ 18- 24 h)

TSI(370C/ 18- 24 h)

Xác định

serotyp

Giữ giống

RV(420C/ 18- 24 h)

DHL (370C/ 20- 24 h)

CHROMTM Salmonella

(370C/ 20- 24 h)

Phản ứng lên men đường

Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm

Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh

Xác định các yếu tố độc lực

3.4.3 Phương pháp giám định vi khuẩn Salmonella phân lập được

Bao gồm các phương pháp sau:

* Kiểm tra hình thái học

* Kiểm tra khả năng di động

* Phản ứng sinh Indol

* Phản ứng Oxidaze

* Phản ứng Catalaze

* Phản ứng lên men đường

3.4.4 Phương pháp xác định serotyp của vi khuẩn Salmonella phân lập được

Xác định serotyp của các chủng Salmonella phân lập được bằng các

phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyếtthanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd Tokyo, Nhật Bản) đối với khángnguyên thân O và kháng nguyên lông H Trên cơ sở kết quả thu được, tiếnhành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann

và White (Popoff, 2001[66])

3.4.4.1 Xác định nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá nhóm O

Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Slide

Aglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella.

Đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được sử dụng rất phổ biếntrong phòng thí nghiệm để chẩn đoán và giám định các loại vi khuẩn

TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở haibên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên.

+ Nhỏ tiếp vào bên thí nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh đa giá nhóm

O, còn bên đối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý Trộn đều, lắcnhẹ phiến kính trong khoảng 30 – 60 giây

+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết kiểu hạtxuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong Bên đối chứng âm huyễn dịch vẫn đục đều

3.4.4.2 Xác định kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O

Các chủng cho kết quả dương tính với kháng huyết thanh O đa giá, tiếptục được xác định với các kháng huyết thanh đơn giá Cách làm tương tự nhưphương pháp đã được trình bày ở phần 3.4.4.1

3.4.4.3 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella

Sau khi đã xác định kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục

tiến hành xác định kháng nguyên H của chúng

3.4.4.3.1 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)

- Chuẩn bị:

+ Các chủng vi khuẩn Salmonella cần định typ được cấy trên môi

trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ

+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml)

để tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng Sau đó, thêm vàocanh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước sinh

lý + 1% Formalin) nhằm mục đích là để cố định kháng nguyên H

+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL,

Hr, Hy, He,n, H1

- Tiến hành:

+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha đến H1 vào mỗi ống nghiệm

+ Dùng Micropipet, hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và

cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh

+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống

nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ.

+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây,các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo Phản ứng âm tính thì dung dịch trongống nghiệm đục đều

3.4.4.3.2 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)

Sau khi có kết quả xác định kháng nguyên H pha 1 của các chủng

Salmonella, chúng tôi tiến hành xác định tiếp kháng nguyên H pha 2 của

chúng

+ Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0.25% thạchvào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 đầu

+ Để ống nghiệm đó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau đó nhỏ

50 µl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm

+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần địnhtyp, cấy thẳng vào phía trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm Sau

đó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ

+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn đã phát triển trong môitrường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấyvào 1 ống nghiệm có chứa 5 ml BHI, để nghiêng týp trong tủ ấm 37oCtrong vòng 6 giờ

+ Thêm vào đó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin(nước muối sinh lý + 1% Formalin), để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ

+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủngtạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm

+ Dùng Micropipet hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và

cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh

+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ốngnghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt độ 50oC trong 1 giờ

+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây,các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo Phản ứng âm tính thì dung dịch trongống nghiệm đục đều.

3.4.5 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh

Sử dụng phương pháp của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khảnăng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giákết quả của NCCLS (2000) (Các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệmcủa Hội đồng quốc gia Mỹ - National committee for Clinical LaboratoryStandards)[61]

Bảng 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn

với một số loại kháng sinh

TT Loại kháng sinh Hàm

lượng

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Mẫn cảm cao

Mẫn cảm trung bình

Kháng thuốc

* Tách DNA:

Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạchmáu ở 37oC trong 24 giờ Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vôtrùng Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong

10 phút Hút phần dịch nổi có chứa DNA để làm phản ứng PCR

- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl)

- 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene)