Các pt pro càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lổ.vì vậy time chạy qua cột dài hơn và time hồi lưu muộn hơn Nested PCR: là PCR có 2 gđ, gđ đầu là PCR dùng 1cặp mồi
Trang 1Sắc kí trao đổi ion: sử dụng các vật liệu làm cột là các hạt mang các nhóm chức tích điện âm hoặc
dương sẽ được hồi lưu ( elute dung ly) khi sử dụng một dd muối loãng chảy qua cột sau đó( muối làm trung hòa các vùng mang điện tích nên cho phép các phân tử protein được giải phóng khỏi cột)
Sắc kí lọc gel: các loại protein về hình dạng và kích thước Các pt pro càng nhỏ càng có nhiều khả
năng thâm nhập vào tất cả các lổ.vì vậy time chạy qua cột dài hơn và time hồi lưu muộn hơn
Nested PCR: là PCR có 2 gđ, gđ đầu là PCR dùng 1cặp mồi ngoài( PCR vòng ngoài) dùng để
khuếch đại 1 đoạn DNA trong đó chứa các trình tự đặc hiệu muốn tìm Sau đó dùng sản phẩm PCR vòng ngoài này làm khuôn cho vào ống PCR có cặp mồi trong( gọi là PCR vòng trong) để khuếch đại trình tự đặc hiệu muốn tìm này
Ưu điểm:+ tăng độ nhạy của PCR khi mồi cho trình tự muốn tìm có độ nhạy thấp
Nhược điểm:+ nguy cơ ngoại nhiễm cao ( do phải mở tube PCR vòng trong để cho sản phẩm PCR
vòng ngoài vào )
Real Time PCR TaqManProbe: đoan nu có trình tự bổ
sung với 1 đoạn nằm giữa 2 đoạn mồi Tm của đoạn dò
luôn cao hơn 2 đoạn mồi,vì theo chu kì nhiệt đoạn probe
gắn trước đoạn mồi Sp PCR có chiều dài 150 bp Đoạn dò
gắn 2 màu Reporyer và Quencher ở 2 đầu.Khi Reporter ở
gần quencher, quencher ức chế sự phát quang màu của
Tamra Ở mỗi chu kì, đoạn dò gắn vào vị trí của 2 đoạn
mồi trước, sau đó 2 đoạn mồi sẽ gắn vào Reporter phát
quang khi đoạn dò bị đánh bật lên gãy ra làm 2, tách
quencher và reporter, làm reporter phát quang Số lượng
màu phát quang sẽ tăng theo sản phẩm pcr sinh ra
Ưu điểm: ko cần điện di geo agarose, chính xác và phát
hiện nhanh vsv gây bệnh
Khuyết điểm: tổng hợp đoạn dò khác nhau cần các trình
tự khác nhau
Syber green: phát màu huỳnh quang
khi bám vào sợi DNA đôi lượng sản phẩm sinh ra càng nhiều thì màu càng cao Tạo ra sợi DNA đôi ngắn 20-40 bp , phải tính toán DNA vừa đủ cho các đoạn mồi ko tự bắt cặp với nhau
Ưu điểm: rẻ hơn Taq Man Probe, ko
cần đoạn dò,giảm công sức,đc sd theo dõi sự khuếch đại của bất kì mạch đôi nào
Khuyết điểm: đắt tiền hơn PCR
thường, ko biết đc kích thước sp DNA sinh ra, phải chạy điện di, ko chuyên biệt, dễ bị nhiễu hoặc sai số dương tính giả vì nó lk với bất kì sợi Dna đôi nào,
kể cả sợi đôi ko đặc hiệu
Hài cốt liệt sĩ:
dựa vào DNA ti
thể( dùng DNA
họ ngoại) vì DNA
ti thể bền hơn
nhân
Quan hệ huyết thống: lấy DNA của đứa bé
so sánh DNA,có cùng huyết thống nếu giống 50% của cha và 50% của mẹ dựa vào phổ điện di của DNA khuôn trên 27 loci
Hung thủ: lấy dấu vết tại hiện
trường đem khuếch đại DNA Lấy mẫu DNA của những đối tượng tình nghi đem khuếch đại
và so sánh, nếu giống 100% là hung thủ
Vàng lá gân xanh: lấy mẫu có chịu chứng
đốm vàng hoặc lá non rồi trsich DNa từ gân lá,
gây pứ bằng các dd trong bộ thí nghiệm kit để
chạy pCR Cuối cùng dùng pp điện di để phát
hiện vi khuẩn nếu mẫu lá cây có muối nhiễm
bênh sẽ có những dấu hiệu đặc trưng xuất hiện
trên phổ điện di
Đốm trắng trên tôm: lấy mẫu DNA có nhiễm
virus WSSVtrong mẫu tôm , ốc trong ao Lấy ở các ao nuôi tôm có mầm bệnh, những mẫu này đem kiểm tra cường độ WSSV với kit Dùng nested PCR sử dụng các đoạn mồi P1, p, p3để phát hiện WSSV và các cặp mồi deca 20a2 và deca 20s9 để phát hiện gen của các giáp xác
Gradient PCR: công nghệ gradient nhiệt cho PCR truyền thống: block nhiệt có 96 giếng
Trang 2phép cài đặt nhiệt độ khác nhau giữa các hàng
hoặc các giếng pứ trên cùng block nhiệt Giúp
tiến hành thử nghiệm nhiều nhiệt độ bắt cặp
khác nhau trong cùng 1 lần chạy máy Sử dụng
enzyme taq pol chịu nhiệt nên ko cần thêm vào
sau mỗi chu kì PCR tự động thay đổi nhiệt độ
theo mỗi giai đoạn
trong toàn pứ PCR các giếng sẽ có nhiệt độ như nhau chỉ thử nghiệm đươc 1 nhiệt độ bắt cặp 1 lần sử dụng 3 warter baths ở 3 nhiệt độ khác nhau đẻ thay đổi chu kì nhiệt, việc chạy 30-35 chu
kì khá phiền phức dễ sai sót
Enzyme giới hạn: +là enzyme có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu
+enzyme này phân hủy lk photphodieste của bộ khung DNA mà ko gây tổn hại đến base +lk hh bị cắt bởi enzyme này có thể nối lại bằng enzyme nối ligase
+có tên là enzyme giới hạn là do enzym này đc khám phá từ các chủng E.coli đang hạn chế sự phát triển của thực khuẩn thể
+được cho là cơ chế ngăn chặn của vi khuẩn trước sự tấn công của virus,và loại
bỏ trình tự của virus
+ Chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5-3 trên DNA gọi là trình
tự nhận biết.( vị trí enzyme cắt giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết)
+có 3 loại enzyme cắt giới hạn
Hiểu biết về PCR:
+là kỉ thuật cho phép nhân bản một đoạn DNA mong muốn thành nhiều bản sao
+ là phát minh của Kary mullis
+PCR là một chuỗi nhiều chu kì, gồm 3 gđ : biến tính (94-98độ,2-5p), gắn mồi(40-65độ,20s-2p),kéo dài(68-72độ,20s-5p)
+ Thành phần phản ứng PCR
:nước tiệt trùng
Buffer: dùng đề tạo môi trường pH thích hợp 8,3-8,6 Ion Mg 2+ trong buffer gắn lk dNTP với dNA pol làm tăng khả năng bám nối của mồi Mg2+ cao gây pư dương tính giả và ngược lại
dNTP ( 4 loại nu tự do ATGC), lượng dNTP tối ưu là 200μMMcho mỗi loại dNTP Việc tăng dNTP ko làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với hiệu chỉnh các yếu tố khác
enzyme DNA Taq pol là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nu AtgC vào mạch DNA mới tổng hợp enzyme DNA Taq pol trích từ vi khuẩn có trong suối nước nóng Themus aquaticus chịu được nhiệt độ cao, có khả năng giải quyết vấn đề enzyme bị biến tính sau mỗi chu kì Người ta ko còn dùng enzyme trích từ Thermus aquaticus mà dùng DNA tái tổ hợp gen vào E.Coli mang enzyme Taq pol
Mồi( yêú tố quan trọng nhât của pư PCR, mồi được chọn phải có tính chuyên biệt, gồm mồi xuôi , mồi ngược) mồi đc chọn cần đặc trưng cho trình tự DnA cần khuếch đại ko trùng với các trình tự lặp lại trên DNA