Phân lập vi khuẩn lactobacillus spp từ cơm mẻ

từ cơm mẻ” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng sinh nhiều acid lactic, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn mạnh nhất để làm vật liệu sản xuất p

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về cơm mẻ 5

1.1.1 Giới thiệu cơm mẻ 5

1.1.2 Vi sinh vật có trong cơm mẻ 5

1.2 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus 6

1.2.1 Phân loại 6

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp 6

1.2.3 Đặc điểm phân bố 7

1.2.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp 8

1.2.5 Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp 8

1.2.6 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactobacillus spp 8

1.2.7 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus spp 14

1.2.8 Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus spp 14

1.2.9 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh 14

1.2.10 Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm phân bón vi sinh hữu cơ trong nông nghiệp 15

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 16

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu 16

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus 16

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 16

2.2.3 Hóa chất và môi trường 17

2.3 Bố trí thí nghiệm 18

2.3.1 Bố trí thí nghiệm chi tiết 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu 27

2.4.2 Phương pháp tăng sinh 27

2.4.3 Phương pháp pha loãng mẫu 28

2.4.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic 28

2.4.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được 30

2.4.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái 30

2.4.7 Các thử nghiệm sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập 31

2.4.8 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD600nm) 33

2.4.9 Phương pháp đục lỗ thạch 34

2.4.10 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân giải tinh bột, protein 34

2.4.11 Phương pháp xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Phân lập một số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ 36

3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập từ cơm mẻ 36

3.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 50

3.3 Xác định hàm lượng acid tổng 50

3.4 Khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 52

3.4.1 Khảo sát khả năng đối kháng bằng sinh khối của của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được với nấm Neoscytalidium 52

3.1.1 Khảo sát khả năng đối kháng bằng dịch nuôi cấy của của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được với nấm Neoscytalidium 54

3.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

1 Kết luận 60

2 Đề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 63

TÀI LIỆU INTERNET 66

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC BẢNG

- Ϊ  Ϊ -

Bảng 3 1 Danh sách các chủng vi khuẩn phân lập 36 Bảng 3 2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 37 Bảng 3 3 Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu

DANH MỤC HÌNH ẢNH

- Ϊ  Ϊ -

Hình 1 1 Vi khuẩn Lactobacillus sakei 6

Hình 1 2 Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus 8

Hình 2 1 Sơ đồ tổng quát bố trí các bước thí nghiệm 18

Hình 2 2 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic từ cơm mẻ 19

Hình 2 3 Quy trình định danh sơ bộ các chủng phân lập được 21

Hình 2 4 Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 22

Hình 2 5 Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm bằng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 24

Hình 2 6 Quy trình khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 26

Hình 3 1 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L1 39

Hình 3 2 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L2 40

Hình 3 3 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L3 41

Hình 3 4 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L4 42

Hình 3 5 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L5 43

Hình 3 6 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L6 44

Hình 3 7 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L7 45

Hình 3 8 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L8 46

Hình 3 9 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L9 47

Hình 3 10 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L10 48

Hình 3 11 Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng L11 49

Hình 3 12 Khảo sát khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn Latobacillus phân lập được 50

Hình 3 13 Hàm lượng % acid lactic sinh ra của 11 chủng Lactobacillus sau 24 giờ nuôi cấy 51

Hình 3 14 Tỷ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp 53

Hình 3 15 Đĩa nấm đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với nấm Neoscytalidium 53

Hình 3 16 Tỷ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 55

Hình 3 17 Đĩa nấm đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với nấm Colletotrichum 55

Hình 3 18 Trung bình đường kính vòng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 57

Hình 3 19 Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn E coli 58

Hình 3 20 Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Salmonella 58 Hình 3 21 Đĩa đối kháng của vi khuẩn Lactobacillus với vi khuẩn Staphylococcus

59

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, lượng rác thải từ thực phẩm như rác thải nông nghiệp, rác thải từ các khu công nghiệp sản xuất và chế biến thực phẩm hoặc rác thải nhà bếp đang không ngừng tăng nhanh đã trở thành một vấn đề mang tính toàn cầu Đây là những loại rác thải hữu cơ, khi phân hủy sẽ phát tán ra môi trường một lượng lớn các loại khí nhà kính như methane và carbon dioxide làm tình trạng nóng lên toàn cầu ngày một xấu hơn [45] Theo nghiên cứu vào năm 2012 cho thấy có gần 9.278 tấn chất thải rắn đô thị, trong đó có khoảng 3.337 tấn là rác thải từ thực phẩm được xử lý tại bãi rác mỗi ngày [46] Việc các loại chất thải này được xử lý bằng cách chôn lấp như hiện nay là không thân thiện với môi trường và thiếu tính bền vững Vì việc xử

lý chúng tiêu tốn gần 75% đến 80% chi phí xử lý rác thải đô thị trong ngân sách chưa

kể đến phí chôn lấp chúng chiếm đến 30% Ngoài ra chôn lấp rác thải từ thực phẩm làm hao phí đi rất nhiều giá trị về năng lượng, giá trị dinh dưỡng mà các loại rác thải này đem lại từ quá trình phân hủy trong đất [47], [48]

Mới đây nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc tái sử dụng các nguồn rác thải hữu cơ như thức ăn thừa bằng cách sử dụng vi khuẩn LAB để lên men lactic nhằm tạo ra các loại phân bón hữu cơ đang là xu hướng phát triển mang tính bền vững [51], [53], [54] Đây không những là phương pháp có tính khả thi cao, hiệu quả, ít tốn chi phí mà việc tái tạo các nguồn tài nguyên này sẽ tạo ra một lượng lớn phân bón hữu thân thiện với môi trường, không những có khả năng kháng các loại vi khuẩn gây bệnh cho cây mà còn có khả khăng kích thích sự tăng trưởng của cây trồng [55]

Hiện nay việc sử dụng các chủng vi khuẩn lên men lactic (LAB) như các chủng Lactobacillus spp để lên men các loại rác thải nhà bếp có nhiều tiềm năng to lớn [49] Thông thường các loại rác thải từ nhà bếp bao gồm hầu hết là tinh bột, các loại đường hòa tan, lipid, protein, một số những hợp chất dễ phân hủy sinh học [50] Đây là một nguồn cơ chất lý tưởng để tiến hành lên men vi khuẩn lactic vì không những giàu chất dinh dưỡng, ít tốn chi phí mà còn giúp làm giảm ô nhiễm môi trường [51] Đối với các chủng vi khuẩn LAB, chúng đặc trưng bởi khả năng lên men các nguồn cơ chất

như cellulose, hemicellulose và tinh bột tạo ra đường và acid lactic Ngoài ra theo Wang và đồng tác giả (2002) việc sử dụng vi khuẩn LAB trong lên men lactic có thể được kiểm soát ổn định bằng cách kiểm soát thích hợp điều kiện lên men (nhiệt độ, oxy, pH,…) [56]

Dựa trên cơ sở đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng

sinh nhiều acid lactic, khả năng kháng nấm, kháng khuẩn mạnh nhất để làm vật liệu sản xuất phân bón lá từ nguồn rác thải nhà bếp là một đề tài rất thiết thực

2 Mục đích nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Phân lập và chọn lọc vi khuẩn Lactobacillus

- Định danh sơ bộ

- Khảo sát đặc điểm nuôi cấy, hình thái và khả năng lên men lactic

- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được đối với các chủng nấm Neoscytalidium sp., Fusarium sp và nấm Colletotrichum sp

- Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh Salmonella, Ecoli và Staphylococcus

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp tổng hợp tài liệu:

Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet và tổng hợp những tài liệu

có liên quan đến mục tiêu đề ra của đề tài

- Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

+ Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ

+ Khảo sát hình thái, thực hiện các thử nghiệm sinh lý sinh hóa để định danh

sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được

+ Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh acid lactic, khả năng kháng các chủng nấm và các chủng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp đã được phân lập

- Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

+ Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm ở từng thời điểm khảo sát

+ Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để xử lý số liệu và vẽ đồ thị

+ Sử dụng phần mềm Statgraphics, phân tích ANOVA

5 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng:

+ Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

- Phạm vi giới hạn:

+ Phân lập các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp từ cơm mẻ

+ Thực hiện lên men tạo chế phẩm phân bón lá ở quy mô phòng thí nghiệm

6 Các kết quả đạt được của đề tài

- Phân lập được 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic từ cơm mẻ Từ kết quả phân lập và định danh sơ bộ cho thấy 11 chủng vi khuẩn trên đều có

đặc tính của vi khuẩn Lactobacillus spp

- Khảo sát khả năng sinh acid lactic, kháng nấm, kháng khuẩn và chọn lọc ra 4 chủng có đủ tiêu chí đề ra

- Ứng dụng 4 chủng vi khuẩn chọn lọc vào lên men sản xuất phân bón lá

- Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu được

Phần kết luận và kiến nghị: Nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cơm mẻ

1.1.1 Giới thiệu cơm mẻ

Trong ẩm thực Việt Nam, mẻ là một gia vị đặc trưng có vị chua xuất xứ từ miền Bắc không thể thiếu trong những bữa ăn hàng ngày Với nguyên liệu lên men đơn giản là cơm hoặc bún, mẻ được tạo ra có hương thơm dịu nhẹ và có hàm lượng dinh dưỡng cao, giàu đạm, acid lactic và vitamin Cơm mẻ thường được bán ở các chợ dưới dạng làm sẵn như một loại gia vị kèm theo, hoặc có thể được làm tại nhà với cách làm rất đơn giản

Là một vị trong 5 vị cơ bản của ẩm thực người Việt, mẻ luôn khẳng định được giá trị khác biệt của nó so với những thứ gia vị quả chua khác

1.1.2 Vi sinh vật có trong cơm mẻ

Cơm mẻ bao gồm các thành phần như con mẻ, nấm men, vi khuẩn lên men acid lactic:

- Con mẻ là một loại tuyến trùng hữu ích mang tên nematode rất nhỏ nhưng có thể nhìn thấy bằng mắt thường, bò ngọ nguậy trên bề mặt cơm trong hũ mẻ và thành dụng cụ chứa đựng Thức ăn của con mẻ là nấm men Chúng có hàm lượng protein rất cao, có vai trò hỗ trợ dinh dưỡng Bản chất con cơm mẻ không đóng vai trò cốt yếu đối với tiến trình lên men cơm hay bún thành cơm mẻ mà chỉ cho người sử dụng biết chất lượng của cơm mẻ.[41]

- Nấm men là thành phần thứ hai trong cơm mẻ, có dạng hình chùm, cung cấp nhiều vitamin và đạm, hỗ trợ dinh dưỡng

- Vi khuẩn lactic là thành phầm thứ ba và thành phần chính của cơm mẻ Đây là một nhóm các trực khuẩn Gram dương, kị khí tùy nghi, có khả năng lên men các loại đường khác nhau sinh ra acid lactic [28] Chính nhờ acid lactic mà tạo thành vị chua của cơm mẻ

C6H12O6 + 2CH3  CHOCOH + Kcal (lên men đồng hình) (Axit lactic) Những sản phẩm mà những vi khuẩn Lactic này tạo ra trong quá trình lên men đường sẽ làm giảm pH đến khoảng 3 - 3.5 [18], sẽ giúp ức chế các vi khuẩn có hại

cho đường ruột như Escherichia coli, Samonella (pH: 5 – 5.5); vi khuẩn gây thối (pH:

4.5 -5); nấm men dại (pH: 1.2 -3) phát triển

Bản thân vi khuẩn lactic tạo nên chất kháng sinh cần thiết để diệt các vi sinh vật

có hại [20], [21] nên rất có lợi cho người ăn Cũng nhờ những đặc tính này mà ăn cơm mẻ sống có lợi hơn nhiều khi ăn cơm mẻ chín

1.2 Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus

Chi (Genus): Lactobacillus

Loài (Species): Lactobacillus spp

1.2.2 Lịch sử nghiên cứu về Lactobacillus spp

Trong suốt 15 năm qua, các nhà nghiên cứu đã tìm ra được gần hơn 25 loài

khác nhau từ các chi Lactobacillus trong đó phải kể đến các chủng tiêu biểu như Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus), Lactobacillus casei (L.casei),

Lactobacillus fermentum (L.fermentum), Lactobacillus plantarum (L.plantarum), Lactobacillus brevis (L.brevis) hay Lactobacillus bulgaricus (L.bulgaricus),…[22]

Phần lớn các chủng Lactobacillus có nguồn gốc từ dạ dày – ruột người và

trong âm đạo Hầu hết chúng đều có khả năng chuyển đường thành acid lactic, ngoài ra nó còn có thể tiết ra Bacteriocin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng

Hình 1 1 Vi khuẩn Lactobacillus sakei

khuẩn có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng và không gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh [24] Hiện nay chúng là đối tượng nghiên cứu chính về

probiotic cho con người[23] vì có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm, kháng các vi khuẩn gây bệnh, khử cholesterol huyết thanh, chống ung thư,

[24] … mang nhiều lợi ích đối với sức khỏe con người Ngoài ra Lactobacillus còn

điều hòa các miễn dịch không đặc hiệu bằng cách kích thích hoạt động của lympho bào, các đại thực bào và giảm cytokine

Bên cạnh đó Lactobacillus từ lâu đã được ứng dụng trong thương mại đặc biệt

là trong lĩnh vực thực phẩm nhất là trong công nghiệp sản xuất các thực phẩm lên men chua như sữa chua, phô mai, bắp cải muối, dưa chua, bia, rượu vang, rượu táo, kim chi,….hoặc trong lĩnh vực y học một số chủng đáng chú ý được biết đến như

Lactobacillus acidophilus sản xuất niacin, acid folic và pyridoxine, một nhóm các hợp chất chung được gọi là vitamin B hay chủng Lactobacillus GG được phân lập từ

người trong những năm 1980 bởi tiến sĩ Sherwood Gorbach và Barry Goldin [25]

Lactobacillus GG là một hứa hẹn tuyệt vời do chúng có thể sống trong đường ruột, ở

đó các vi khuẩn tạo ra một hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp duy trì hệ vi sinh đường ruột khỏi vi khuẩn xâm nhập

1.2.3 Đặc điểm phân bố

Phần lớn các loài Lactobacillus là nhóm vi khuẩn có nguồn gốc từ dạ dày –

ruột người, âm đạo Trong tự nhiên phân bố tương đối rộng rãi trong tự nhiên, có nhiều ở các môi trường sống chứa nhiều cacbohydrate và trong hầu hết các thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, phô mai, trong đường ruột của động vật, thủy sản và trong đường ruột, đường tiết niệu, đường sinh dục của người [25]

1.2.4 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Lactobacillus spp

Lactobacillus là một nhóm gồm đa dạng các loài vi sinh vật Chúng là những

vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn 0,5 – 1,2 μm × 1 - 10 μm, đại bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử [34], hình dạng thay đổi: dạng que thẳng dài, que hơi cong như hình lưỡi liềm cho đến hình cầu có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng

rẽ [33]

1.2.5 Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus spp

Vi khuẩn Lactobacillus là vi khuẩn kị khí tùy nghi, chịu môi trường acid, có

nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp, phát triển trong điều kiện kị khí và sinh acid lactic [29] Nhiệt độ phát triển tối ưu thường là 30 – 450 C, pH tối ưu là 5,5 – 6,8 Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất acid lactic là một sản phẩm của

quá trình chuyển hóa glucose

Dựa trên các sản phẩm của quá trình biến dưỡng để phân chia các loài

Lactobacillus thành 2 nhóm: Các loài lên men đồng hình và lên men dị hình

Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng đục hoặc trắng sữa

có bờ đều, láng và lồi, mờ đục Chúng không tạo mùi đặc trưng trên môi trường nuôi cấy thông thường [30]

1.2.6 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Lactobacillus spp

Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao và các loài khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Để sinh trưởng bình thường, ngoài nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản như nguồn carbon, nitơ một phần

Hình 1 2 Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn Lactobacillus

dưới dạng các acid amin, photphate và lưu huỳnh mà chúng còn có nhu cầu về một

số vitamin, các chất sinh trưởng và chất khoáng

❖ Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccarit (glucoza, fructoza, manoza) và các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin) Các loài vi khuẩn khác nhau đòi hỏi các nguồn cacbon khác nhau, chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic,

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là các monosaccarit và disaccait Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như các acid glutamide và galacturonic tạo thành CO2, acid acetic và acid lactic như Lactobacterium lycopersici,

Streptobacterium hassice fermentatae Trong quá trình lên men các cơ chất như

cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các acid amine như acid glutamic, arginine, tyrosine làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra các quá trình decacboxyl và tạo ra CO2

❖ Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,

Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất tuy nhiên ở quy mô công nghiệp người ta không sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém [1]

❖ Nhu cầu về vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống như acid nicotinic và acid pantothenic rất cẩn

cho sự sinh trưởng của tất cả các loài vi khuân lactic Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men [1] Cần lưu ý vitamin bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ nuôi cấy, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường [35]

❖ Nhu cầu các chất hữu cơ khác

Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

❖ Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

❖ Nhu cầu dinh dưỡng oxy

Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiếu khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề

mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí [32] Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

❖ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men - quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Acid lactic lần đầu tiên được tách ra từ sữa bò lên men chua nhờ nhà khoa học Thụy Điển Scheele vào năm 1780

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactic Trong thự tiễn người ta đã biết đến hiện tượng này từ lâu và đã sử dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, dưa muối, cà muối…) ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại lactate

Sản phẩm trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic Tùy theo các sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men mà người

ta chia làm hai loại: lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình:

• Vi khuẩn lên men lactic đồng hình:

Lên men đồng hình chỉ tạo ra sản phẩm là acid lactic chiếm gần như 90%, ngoài

ra còn có thể xuất hiện lượng acid bay hơi, rượu ethylic hoặc các sản phẩm khác ở một lượng rất nhỏ không đáng kể acid acetic, acetol, diacetyl

Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men:

C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng này

là lactathydrogenaza và tùy thuộc vào sự tồn tại của men lactatraxemaza mà có thể xuất hiện các acid lactic dạng D (-), L (+) hay DL Chỉ có một phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành acid axetic, ethanol và CO2 cũng thành aceton Mức độ tạo thành sản phẩm này rõ rang phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hóa theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho quy trình này, còn hydro tách ra khi dehydro hóa triozophophat được chuyển đế pyruvat Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic không thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic

• Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài acid lactic còn có các sản phẩm khác như acid acetic, ethanol, acid succinic, CO2,…

Phương trình chung biễu diễn quá trình len men:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH+ HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic

và acid acetic 10% các loại khí 20%, đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy một lượng lớn acid formic Như vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình

có nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể được tạo thành, chứng tỏ quá trình này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học, người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình

Thành phần môi trường nuôi cấy

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này Sự phát triển của vi khuẩn lactic trên các loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái

và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước trước

những áp lực của các quá trình sử lý sau này Khả năng sống sót của L bulgaricus

trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men tử maltose thì tỷ lệ tế bào chết sẽ nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose Tuy nhiên việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [1]

Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài Thành phần môi trường MRS (Phụ lục A) để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic

Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon

(chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dưỡng trên với liều lượng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men

Yếu tố môi trường

1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 - 400C Một số có thể sinh trưởng dưới

150C và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 500C [31]

3 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người

ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3

4 Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men

Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men

1.2.7 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus spp

Lactobacillus sp được thử nghiệm nhận biết qua các phản ứng sinh hóa đặc

trưng như phản ứng catalase, oxydase, khả năng sinh acid lactic, khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate đặc biệt là các loại đường [14] Bên cạnh đó, khả năng sinh

bacteriocin đã được kiểm tra và minh chứng đối với các chủng Lactobacillus được

thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch [34]

1.2.8 Khả năng phân giải protein của vi khuẩn Lactobacillus spp

Đại đa số các loài Lactobacillus có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein Phổ biến trong số đó là các chủng Lactobacillus bulgaricus, L casein, L paracasein,

L fermentum và L plantarum Hệ enzyme phân giải protein của nhiều loài Lactobacillus mang tính đặc hiệu cao tuy nhiên ở enzyme của một số loài lại có tính đặc hiệu ở phổ rộng dẫn đến có nhiều vùng cắt đặc hiệu cho một cơ chất

Hoạt tính này giúp cho các chế phẩm lên men từ Lactobacillus trở thành nguồn

dinh dưỡng có giá trị cao cho con người, động vật hoặc trong phân bón

1.2.9 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn

gây bệnh

Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn như các acid

hữu cơ (acid lactic, acid acetic), hydrogen peroxide, carbondioxide và diacetyl và đặc biệt là bacteriocin [1], [37] Nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) bị ức chế bởi hydrogen peroxide [1], [27]

Acid lactic do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra cùng với các cơ chất khác sẽ tạo

một môi trường bất lợi cho vi sinh vật gây thối trong đường tiêu hóa phát triển do đó lượng urase trong ruột giảm, hơn nữa pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột Những vi khuẩn gây thối rửa ở ruột kết tạo các enzyme β-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase thành carcinogen (chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u), bằng các ức chế cạnh tranh và tạo môi trường acid không thuận lợi [41]

Lactobacillus đã kiềm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết điều này làm

giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [39], [40]

Ngoài ra còn phải đặc biệt kể đến các bacteriocin, đây là các hợp chất không có tính kháng sinh điển hình tức chỉ kìm hãm mà không tiêu diệt vi sinh vật Điển hình

như plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum [42] Bacteriocin hoạt động

trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên các tác động lên kênh màng tế bào vi khuẩn và làm thay đổi tính thấm của màng, vi khuẩn bị rối loạn các quá trình sinh hóa trong tế bào từ đó gây ức chế hoặc gây chết vi khuẩn Bacteriocin có tính diệt khuẩn cao ở pH thấp, tương đối bền

ở nhiệt độ cao, không bị ảnh hưởng nhiều bởi các dung môi hữu cơ và có thể mất hoạt tính nếu như gặp các enzyme thủy phân protein có điện tích âm

1.2.10 Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm phân

bón vi sinh hữu cơ trong nông nghiệp

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium- loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm câyyếu và

là cơ hội gây bệnh cho cây trồng Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường [44]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học

- Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ Thời gian: tháng 3/2016 đến tháng 8/2016

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Cơm mẻ được thu mua tại các chợ ở quận Gò Vấp, Bình Thạnh thành phố Hồ

- Que cấy trang

- Dây cấy vòng, dây cấy thẳng

2.2.3 Hóa chất và môi trường

2.2.3.1 Hóa chất

- Thuốc nhuộm Safranin

- Thuốc nhuộm Crystal violet

- Thuốc nhuộm Lugol

- Các loại thuốc nhuộm khác

- Môi trường MRS agar

- Môi trường MRS broth

- Môi trường Nutrient broth (NB)

- Môi trường thạch mềm MRS

- Môi trường Tryptone Broth

- Môi trường canh MR - VP

- Môi trường LB – Agar

- Môi trường Simmon Citrate

- Môi trường MRS

- Môi trường Starch Agar

- Môi trường Ashby

- Môi trường thạch mềm MRS 0.5% agar

- Một số loại môi trường khác

Ứng dụng chủng chọn lọc vào sản xuất phân

bón lá

Hình 2 1 Sơ đồ tổng quát bố trí các bước thí nghiệm

2.3.1 Bố trí thí nghiệm chi tiết

2.3.1.1 Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Thuyết minh quy trình

Mẫu cơm mẻ

Tăng sinh trong môi trường MRS broth,

24 giờ

Hút 0.1 ml mẫu ở nồng độ pha loãng 10-1,

10-2,10-3 cấy trang trên môi trường thạch

MRS có chứa 5 g/l CaCO3

Pha loãng mẫu bằng nước muối sinh lý từ

nồng độ 10-1 đến 10-3

Ủ ở 370C, 24 giờ

Cấy ria nhiều lần trên môi trường MRS agar

Chọn ra các khuẩn lạc xung quanh có vòng

phân giải trong suốt

Tiến hành: Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus trong cơm mẻ được thực hiện

Dùng micropipette vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu từ ba độ pha loãng 10 -1,

10 -2 và 10-3 cho vào đĩa petri chứa môi trường thạch MRS đã được hấp khử trùng Dùng que cấy trang, trang đều mẫu trên bề mặt đĩa thạch và đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt

độ 37oC trong 48 giờ Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Quan sát kết quả sau 24 – 48 giờ: quan sát hình thái khuẩn lạc, ghi nhận lại kết quả Chọn lọc các khuẩn lạc xung quanh có vòng phân giải trong suốt

Làm thuần bằng cách cấy ria liên tục trên môi trường thạch MRS cho đến khi thu được các khuẩn lạc rời rạc, đồng nhất về hình dạng và kích thước

Các chủng vi khuẩn được cấy chuyển vào ống thạch nghiêng chứa môi trường thạch MRS và trong glycerol 40% tồn trữ ở 40C để bảo quản và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

2.3.1.2 Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được

Tiến hành quan sát, ghi nhận hình dạng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, kích thước khuẩn lạc Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học để chọn những vi khuẩn có đặc tính như: dạng trực khuẩn, hình que hay hình cầu, dạng đơn hay kết chuỗi

Các chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành định danh sơ bộ và tuyển chọn dựa trên những chỉ tiêu sau: là vi khuẩn gram dương bắt màu xanh tím, không sinh

Nhuộm gram Nhuộm bào tử Quan sát hình thái, sinh lý

bào tử, thử nghiệm catalase âm tính, không có khả năng di động Chọn lựa các chủng phù hợp và loại bỏ những chủng không phù hợp

2.3.1.3 Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của các vi khuẩn Lactobacillus phân

lập được đối với nấm Neoscytalidium sp

Đĩa vi khuẩn sau khi cấy

24 giờ

Đĩa MT thạch MRS cải tiến

Ủ ở nhiệt độ phòng, đo đường kính vòng ức

chế của vi khuẩn

Tỉ lệ ức chế nấm của chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp

Đặt khoanh thạch

Thuyết minh quy trình:

Mục đích: Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp nấm Neoscytalidium sp của các

chủng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được

Tiến hành: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp sau khi được tăng sinh trong

môi trường MRS cải tiến đã hấp khử trùng ở 370C trong 24 giờ

Sau khi tăng sinh, tiến hành cấy ria trên đĩa môi trường thạch MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút

Chuẩn bị đĩa petri chứa môi trường thạch MRS cải tiến đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml

Khi thạch đã đông, ta tiến hành lấy sinh khối của vi khuẩn cấy 2 đường lên đĩa thạch mới đổ (mỗi đường cấy cách tâm đĩa 25mm)

Sau khi cấy vi khuẩn ta tiến hành cấy nấm Neoscytalidium sp vào tâm các

đĩa Mẫu đối chứng nấm là đĩa chỉ cấy nấm và không cấy sinh khối vi khuẩn Mẫu đối chứng vi khuẩn là đĩa không cấy nấm và chỉ cấy 2 đường sinh khối vi khuẩn trên đĩa

Sau khi cấy, các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng và quan sát, đọc kết quả

đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm Neoscytalidium sp mỗi ngày, đến khi nấm Neoscytalidium sp mọc đầy đĩa đối chứng Phần trăm ức chế được tính theo công

thức:

Tỉ lệ ức chế (%) = 𝐷đ𝑐 − 𝐷𝑡𝑛

𝐷đ𝑐 × 100

Trong đó:

Dđc: là đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng

Dtn: là đường kính (cm) đĩa thí nghiệm

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics

2.3.1.4 Khảo sát khả năng đối kháng bằng dịch nuôi cấy của các vi khuẩn

Lactobacillus phân lập được đối với nấm Fusarium sp và Colletotrichum sp

Đặt khoanh thạch

Lactobacillus spp

Tăng sinh trong MT MRS broth cải tiến

Hình 2 5 Quy trình khảo sát khả năng kháng nấm bằng dịch nuôi cấy của

các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Thuyết minh quy trình:

Mục đích: Khảo sát khả năng đối kháng bằng dịch nuôi cấy của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus spp phân lập được

Tiến hành: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp sau khi được tăng sinh trong

môi trường MRS lỏng cải tiến đã hấp khử trùng ở 370C trong 48 giờ

Tiến hành đổ môi trường thạch MRS cải tiến đã được hấp khử trùng ở

1210C, 1atm trong 15 phút Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều Sau đó bơm 0.1ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào 4 lỗ của các đĩa thạch petri

Sau khi hút dịch vi khuẩn ta tiến hành cấy nấm Fusarium sp.và

Colletotrichum sp vào tâm các đĩa Mẫu đối chứng nấm là đĩa chỉ cấy nấm và

không cấy sinh khối vi khuẩn Mẫu đối chứng vi khuẩn là đĩa không cấy nấm và chỉ hút dịch vi khuẩn vào 4 lỗ thạch trên đĩa

Sau khi cấy, các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng và quan sát, đọc kết quả

đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm Fusarium sp.và Colletotrichum sp mỗi

ngày, đến khi nấm mọc đầy đĩa đối chứng Phần trăm ức chế được tính theo công thức:

Tỉ lệ ức chế (%) = 𝐷đ𝑐 − 𝐷𝑡𝑛

𝐷đ𝑐 × 100

Trong đó:

Dđc: là đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng

Dtn: là đường kính (cm) đĩa thí nghiệm

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics

2.3.1.5 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp

Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (Agar Well Diffusion Assay)

Ủ ở 280C, 48 giờ Đo đường kính

vòng vô khuẩn

So sánh khả năng kháng khuẩn của các chủng

Thuyết minh quy trình

Mục đích: Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus spp phân lập được

xác định bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch

Đây là phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các sản phẩm trao đổi chất của

vi khuẩn lactic lên vi sinh vật chỉ thị mà không cần sự tiếp xúc trực tiếp giữa chúng

Tiến hành: Vi khuẩn phân lập được tăng sinh trong 10ml môi trường MRS broth đã

được hấp khử trùng đem lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Tương

tự tăng sinh vi khuẩn chỉ thị trong 10 ml môi trường NB rồi đem lắc ở 150 vòng/phút

ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Sau khi tăng sinh pha loãng dịch vi khuẩn chỉ thị đến nồng độ pha loãng 10-6

Đổ môi trường NA đã đã trên đĩa petri để thử hoạt tính kháng khuẩn, sau khi môi trường đã đông cứng tiến hành hút 0,1ml dịch pha loãng của vi khuẩn chỉ thị cấy trang lên bề mặt thạch NA Tiếp theo đục 4 lỗ thạch đường kính 8mm lên đĩa thạch rồi nhỏ 0,1ml dịch trong (dịch nuôi cấy đã li tâm) vào các giếng thạch đã đục Ủ ở

370C trong 24 giờ Sau đó quan sát sự tạo vòng kháng khuẩn và đo đường kính vòng phân giải Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật tuyển chọn được tính bằng đường kính vòng kháng khuẩn ∆D (Schillinger và cộng sự, 1989)

∆D = D-d (mm) với D: đường kính vòng vô khuẩn (mm); d: đường kính lỗ thạch (mm)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu

Thu mẫu: Lấy mẫu vào buổi sáng Mẫu cơm mẻ được mua tại các chợ đựng trong chai nhựa có dung tích 250 ml, đậy nắp kín, tránh ánh nắng trực tiếp và trong thời gian dài trong quá trình vận chuyển

Xử lý mẫu: Mẫu cơm mẻ sau khi vận chuyển về phòng thí nghiệm sẽ được tăng sinh ngay

2.4.2 Phương pháp tăng sinh

Tiến hành cân 5 g cơm mẻ cho vào Erlen có dung tích 250 ml chứ 50 ml môi trường MRS lỏng đã được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút để tăng sinh Sau đó lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ

2.4.3 Phương pháp pha loãng mẫu

Mục đích: Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu, giúp cho việc phân lập riêng lẻ từng tế bào vi khuẩn dễ dàng hơn

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp giúp cho quá trình định lượng cũng như phân tích dễ dàng hơn Phương pháp pha loãng mẫu chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

Dung dịch pha loãng: Nước muối sinh lý (0,85%) Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút

Tiến hành pha loãng theo Oyetayo (2004): Dùng micropipet vô trùng hút 1ml dịch tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng vô trùng, khi đó ta

sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục hút 1ml từ ống nghiệm có độ pha loãng

10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10-2 Tiến hành tương tự cho đến nồng độ 10-7

2.4.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic

2.4.4.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết

Mục đích: Tách riêng các chủng vi khuẩn có trong dịch tăng sinh mẫu giúp cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn đồng nhất Tiến hành các bước phân lập theo Oyetayo (2004)

Môi trường phân lập là MT1 được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút Sau khi hấp khử trùng, chai môi trường được cho vào bể ủ 600C để môi trường hạ nhiệt độ xuống còn 600C rồi tiến hành phối vào đĩa petri đã được

hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15 – 20ml

Các bước phân lập cơ bản như sau:

Dùng micropipette vô trùng hút 0,1 ml dịch pha loãng ở các nồng độ 10-5,

10-6, 10-7 cho vào các đĩa petri vô trùng chứa 15 – 20 ml MT1 Mỗi nồng độ lặp lại 3 đĩa Tiến hành cấy trang, dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô Sau đó, các đĩa được ủ trong tủ ấm ở 370C trong 24 – 48 giờ Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được thực hiện trong tủ cấy vô trùng (Xiao-Hua Guo

và cộng sự, 2010)

Kiểm tra các đĩa cấy hàng ngày, đọc kết quả sau 24 – 48 giờ: Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, ghi nhận và chọn lọc sơ bộ các khuẩn lạc vi khuẩn được cho là

thuần và thuộc giống Lactobacillus có khả năng sinh acid lactic phân giải CaCO3

trong môi trường tạo ra vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc theo Kandler

và Wiss (1986)

Làm thuần VSV: Cấy chuyển nhiều lần đối với từng loại khuẩn lạc riêng rẽ bằng phương pháp cấy ria trên môi trường MT1 Dùng que cấy vòng (đã khử trùng bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn) bắt lấy khuẩn lạc rời rạc đặc trưng Tiến hành cấy ria, ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ Khi khuẩn lạc đơn trên môi trường phát triển thành một loại duy nhất, có hình thái giống nhau và giống với khuẩn lạc ban đầu khi quan sát dưới kính hiển vi tức VSV đã được làm thuần Thao tác vô trùng được tuân thủ nghiêm ngặt

Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc: Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch, sau đó pha loãng ra các nồng độ cần thiết bằng nước muối sinh lý vô trùng, tiến hành cấy trang đối với các nồng độ pha loãng Ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ Quan sát nếu khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng, màu sắc thì được giữ lại, ngược lại khuẩn lạc không thuần nhất thì loại bỏ Cần đảm bảo tính thuần khiết của khuẩn lạc

vì như vậy giống mới đạt độ thuần khiết cao

2.4.4.2 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

Mục đích: Giữ và bảo quản các chủng phân lập được nhằm đảm bảo nguồn giống để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo có liên quan đến vi khuẩn

a Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn phân lập được cấy giữ giống trong ống thạch nghiêng chứa môi trường thạch MRS đã được hấp khử trùng và để nguội Dùng que cấy vòng

vô trùng (hơ trên ngọn lửa đèn cồn) lấy sinh khối VSV cấy zich zắc trên bề mặt môi trường Đậy nút bông kín, quấn paraffin và ủ ở 370C trong 24 giờ, khi thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống thạch nghiêng vào tủ lạnh 40C để giữ giống

Cấy chuyển định kì mỗi tháng 1 lần, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Giống phải được hoạt hóa trước khi nhân giống

b Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Để thời gian lưu giữ của của giống được lâu hơn (có thể từ 3-5 tháng), thường VSV được giữ giống trong điều kiện làm lạnh sâu

Tiến hành: Cấy sinh khối VSV vào chai 100ml chứa 20ml môi trường MT2, lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ Tiếp theo hút 0,85 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf vô trùng rồi hút tiếp 0,25ml glycerol cho vào eppendorf lắc đều và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.4.5 Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được

Nguyên tắc: Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hóa lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp được giữ giống trên môi trường thạch

nghiêng MRS hoặc trong Eppendorf chứa glycerol được tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường MRS lỏng (MT2)

đã được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ

2.4.6 Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái

2.4.6.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc

Các chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu cơm mẻ có khả năng sinh acid lactic được cấy ria trên môi trường thạch MRS có chứa 5 g/l CaCO3 sẽ hình thành các khuẩn lạc riêng rẻ xung quanh có vòng phân giải trong suốt ở nhiệt độ 370C trong 24 – 48 giờ Quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc của từng chủng khác nhau

2.4.6.2 Soi khuẩn lạc

Sinh khối vi khuẩn phân lập sau khi được cấy ria bằng dây cấy vòng trên môi trường thạch MRS, ủ ở 370C trong 24 giờ tiến hành dùng dao sắc, nhỏ cắt một miếng

thạch mỏng sát với mép khuẩn lạc Quan sát dưới kính hiển vi từ trên xuống và soi nghiêng ở vật kính 40X

2.4.6.3 Phương pháp nhuộm gram

Nguyên tắc nhuộm Gram

Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau:

Loại phức chất thứ nhất vẫn giữa nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này là vi khuẩn gram dương

Loại phức chất thứ hai không giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc gram âm

Đối với các chủng Lactobacillus sp sau khi được làm thuần tiến hành nhuộm

gram nhằm xác định vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương hay Gram âm Tăng sinh vi khuẩn phân lập được trong môi trường MT2 và E.coli trong môi trường NB trong 24 giờ, lắc 150 vòng/ phút Các bước nhuộm Gram xem phụ lục D

2.4.6.4 Phương pháp nhuộm bào tử

Tiến hành nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn theo phương pháp Fulton Tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được trong môi trường MT2 trong 36 - 48 giờ, lắc 150 vòng/ phút Phương pháp nhuộm bào tử xem phụ lục D

Schaeffer-2.4.7 Các thử nghiệm sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập

2.1.1.1 Thử nghiệm Indol

Môi trường sử dụng: Canh Tryptone

Tiến hành: Phối môi trường vào các ống nghiệm rồi đem hấp khử trùng ở

1210C trong15 phút Chờ môi trường nguội, cấy sinh khối chủng vi khuẩn thuần vào ống nghiệm chứa canh Tryptone, ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ

Nhỏ vài giọt ether vào ống dịch nuôi cấy sau đó nhỏ thêm vào giọt Kovac’s (2

- 4 giọt) vào, không lắc ống nghiệm để yên vài phút nhằm theo dõi sự tạo thành vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường

2.4.7.3 Thử nghiệm VP (Voges Proskauer)

Môi trường sử dụng: Môi trường MR - VP

Tiến hành: Phối môi trường vào các ống nghiệm rồi đem hấp khử trùng ở

1210C trong15 phút Chờ môi trường nguội, dùng que cấy vòng cấy sinh khối VSV vào môi trường MR - VP đã hấp khử trùng Ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ

Nhỏ 3 giọt α -Napthol, sau đó nhỏ 1 giọt KOH 40%, lắc nhẹ Đọc kết quả sau

20 phút, chậm nhất là 4 giờ

2.4.7.4 Thử nghiệm MR (Methyl Red)

Môi trường được sử dụng: Môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR – VP Broth)

Tiến hành: Phối môi trường vào các ống nghiệm rồi đem hấp khử trùng ở

1210C trong15 phút Chờ môi trường nguội, dùng que cấy vòng lấy 1 lượng sinh khối

từ khuẩn lạc thuần cấy vào mô trường lỏng MR-VP broth Ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ Bổ sung vài giọt thuốc thử methyl Red vào ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay

2.4.7.5 Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate

Môi trường sử dụng: Môi trường Phenol red carbohydrate broth

Tiến hành: Phối vào ống nghiệm 4,5ml dịch môi trường có bổ sung ống Durham Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút Môi trường có màu đỏ nhạt Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Ủ ở 37 0C theo dõi trong 24 – 48 giờ

2.4.7.6 Thử nghiệm TSI

Môi trường sử dụng: Môi trường TSI

Tiến hành: Pha môi trường TSI sau đó đun tan môi trường rồi phối vào các ống nghiệm, đem hấp khử trùng ở 1210C trong15 phút Để ống thạch nghiêng sao cho

có phần sâu khoảng 2,5 cm và chiều cao khoảng 2,5 cm Chờ môi trường nguội, dùng que cấy thẳng lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần đâm sâu que cấy vào phần sâu của ống thạch nhưng tránh chạm vào đáy ống nghiệm Sau đó tiếp tục cấy ria trên môi trường thạch nghiêng TSI Đem đi ủ ở 370C trong 24 giờ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.4.8 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang (OD600nm)

Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lửng Do vi sinh vật trong phần lớn trường hợp

là không màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch nuôi cấy của tế bào hấp thụ ánh sáng không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được Trong giới hạn nhất định,

số lượng ánh sáng bị tán xạ do dịch nuôi cấy vi sinh vật tỷ lệ thuận với mật độ tế bào Nên trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào mà sự tán xạ ánh sáng càng nhiều nghĩa là môi trường càng đục tương đương với mật độ tế bào vi sinh vật càng nhiều

Lấy 3 ml dịch nuôi cấy để tiến hành đo OD ở bước sóng 600 nm trên máy quang phổ kế với đối chứng là môi trường không chứa vi khuẩn