phân lập vi khuẩn lactobacillus spp. từ cá tra và cá trê có khả năng ức chế vi khuẩn edwardsiella ictaluri

34 Hình 9 Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng CT1-TB1 phân lập khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt .... Lactobacilli mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp TỪ CÁ TRA

VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ

VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri

MSSV:3102719 LỚP:CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

PGS.TS Ngô Thị Phương Dung

LỜI CẢM TẠ

Đầu tiên con xin cảm ơn ba mẹ đã có ơn sinh thành và nuôi nấng con cho đến ngày con nên người

Xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giảng dạy

và truyền đạt những kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Cảm ơn cô Bùi Thị Minh Diệu đã luôn dõi theo, tư vấn, dìu dắt cho em Và đặc biệt em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Văn Thành đã tận tình hướng dẫn, ân cần giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em thực hiện đề tài

Và cũng cám ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của anh Huỳnh Xuân Phong, anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang cùng toàn thể các anh chị, các bạn học viên cao học

và các em sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn với tấm lòng trân trọng nhất!

NGUYỄN TRƯƠNG DUY ANH

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với mục đích tìm ra dòng Lactobacillus spp có những đặc

tính tốt nhằm sản xuất probiotic và bacteriocin trong phòng và trị bệnh cho cá tra Từ các

mẫu cá tra và cá trê thu ở 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long 17 dòng Lactobacillus spp đã

được phân lập Trong 17 phân lập được, 8 dòng có khả năng ức chế vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt (Agar-spot test) Chỉ

2 dòng CT-TB7 và CT2-TB11 có khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri khi

được kiểm tra bằng phương pháp giếng thạch (Well-difusion-agar test) Môi trường MRS được bổ sung thêm yeast extract ở nồng độ 3% w/v là môi trường thích hợp nhất cho vi

khuẩn Lactobacillus spp tuyển chọn phát triển và tạo bateriocin ức chế vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra

Từ khóa: bacteriocin, cá tra, Edwardsiella ictaluri, Lactobacillus spp

MỤC LỤC Trang

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cá da trơn 3

2.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh gan thận mủ do Edwarsdsiella ictaluri trên cá da trơn 7

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn lactic, Lactobacillus spp và tình hình nghiên cứu probiotic và bacteriocin 8

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Phương tiện nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian địa điểm 18

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị 18

3.1.2 Nguyên vật liệu 18

3.1.3 Hóa chất và môi trường 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Thu mẫu 20

3.2.2 Thí nghiệm 1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc

giống Lactobacillus 20

3.2.3 Thí nghiệm 2 Tuyển chọn các dòng Lactobacillus spp có khả năng kháng Eddwardsiella ictaluri cao 22

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus spp 27

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 29

4.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống Lactobacillus 29

4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dạ dày-ruột cá tra và cá trê 29

4.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập được 30

4.2 Kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được 37

4.2.1 Phương pháp nhỏ giọt 37

4.2.2 Phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 43

4.3 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên khả năng kháng khuẩn vi khuẩn Lactobacillus spp 43

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 47

1.Kết luận 47

2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 52

Phụ Lục 1 Phương Pháp Nghiên Cứu 52

1.1 Môi trường 52

1.1.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus spp 52

1.1.2 Môi trường nuôi Edwardsiella ictaluri 52

1.1.3 Môi trường kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của các dòng

Phụ Lục 2 Kết Quả Thí Nghiệm 55 Phụ Lục 3 Phân Tích Thống Kê 58

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo ra bởi LAB 9

Bảng 2 Thuộc tính của một vài bacteriocin 13

Bảng 3 Khả năng ức chế một số vi khuẩn của plantaricin từ Lactobacillus plantarum 14

Bảng 4: Thành phần của môi trường MRS broth 18

Bảng 5: Thành phần môi trường Trypticase (tryptic) Soy (TSB) 19

Bảng 6: Các dòng vi khuẩn phân lập được từ cá tra, cá trê ở 2 tỉnh Đồng Tháp ,Vĩnh Long 29

Bảng 7: Đặc tính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy 31

Bảng 8: Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy 33

Bảng 9: Tổng hợp các đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn phân lập 35

Bảng 10: Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng Lactobacillus spp phân lập khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt 37

Bảng 11: Khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 39

Bảng 12 Đường kính vòng vô khuẩn của dòng CT2-TB7 trên các loại môi trường MRS bổ sung 42

Bảng 13 Đường kính vòng vô khuẩn của dòng CT2-TB11 trên các loại môi trường MRS bổ sung 43

Bảng 14 Đường kính vòng vô khuẩn của 2 dòng vi khuẩn CT2-TB7 và CT2-TB11 trên các loại môi trường MRS bổ sung 44

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 Nuôi cá tra theo hình thức thâm canh ven sông Hậu 5

Hình 2 Hình thái học cá tra 5

Hình 3.Khuẩn lạc các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy 30

Hình 4 Hình thái các dòng vi khuẩn phân lập ở độ phóng đại 1000 lần 31

Hình 5 Vi khuẩn phân lập Gram dương sau khi nhuộm ở độ phóng đại 1000 lần 33

Hình 6 Thử nghiệm catalase các dòng vi khuẩn phân lập 33

Hình 7 Thử nghiệm oxidase các dòng vi khuẩn phân lập 34

Hình 8 Các dòng vi khuẩn phân lập không có bào tử khi nhuộm và quan sát ở độ phóng đại 1000 lần 34

Hình 9 Khả năng ức chế vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của các dòng CT1-TB1 phân lập khi được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ giọt 36

Hình 10 Khả năng ức chế của bacteriocin do dòng Lactobacillus spp sinh ra lên Edwardsiella ictaluri 40

Hình 11 Biểu đồ so sánh khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của 8 dòng Lactobacillus spp phân lập giữa phương pháp nhỏ giọt và phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 41

Hình 12 Biểu đồ so sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các loại môi trường MRS được bổ sung các thành phần của 2 dòng vi khuẩn CT-TB7 và CT2-TB11 46

TỪ VIẾT TẮT

ATP : Adenosin triphosphate

BHI: Brain Heart Infusion

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations ( Tổ chức lương

thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc) LAB: Lactic acid bacteria

TSA : Trypicase soy agar

WHO : World Health Organization ( Tổ chức Y tế thế giới)

Cách đặt tên các dòng vi khuẩn phân lập: Tên loài cá thu mẫu - Địa điểm thu mẫu

Trong đó:

CT là các dòng vi khuẩn phân lập từ cá trê

CTR là dòng vi khuẩn phân lập từ cá tra

LV là mẫu được thu ở huyện Lấp Vò tỉnh Đồng Tháp

TB là mẫu được thu ở huyện Tam Bình tỉnh Vĩnh Long

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Cá tra ( Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nuôi chính ở đồng bằng sông

Cửu Long ( ĐBSCL) Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê, sản lượng cá tra năm 2012 ước đạt 1226 nghìn tấn Do tốc độ phát triển nhanh cộng với mức độ thâm canh ngày càng cao đã phát sinh nhiều bệnh truyền nhiễm do một số loài vi khuẩn gây ra trên cá tra

Trong số đó, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra (Từ Thanh Dung

et al., 2005) đã gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho người nuôi Tuy nhiên, do việc lựa chọn và sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh không đúng cách và diễn ra

một cách bừa bãi nên đã làm cho độ nhạy của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đối với các

loại thuốc kháng sinh ngày càng giảm và nguy cơ kháng thuốc dẫn đến không còn thuốc điều trị là rất cao (Nguyễn Đức Hiền, 2008) Bên cạnh đó việc lạm dụng thuốc kháng sinh dẫn đến dư lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong thịt cá vượt mức cho phép gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dung và thương hiệu cá tra Việt Nam trên thị trường xuất khẩu Hiện nay việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học đặc biệt là probiotic và bacteriocin để phòng trị bệnh cho cá tra đã thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm

Probiotic là những sinh vật sống mà khi tiêu thụ một lượng nhất định sẽ mang lại tác động tích cực cho vật chủ (FAO/WHO, 2001) Lactobacilli mang lại nhiều lợi ích cho vật chủ bởi chúng có khả năng: bám vào tế bào biểu mô ở thành ruột, tồn tại và tăng mật

số trong cơ thể vật chủ, hạn chế sự vào tế bào của các tác nhân gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng với vi khuẩn gây bệnh, kích thích miễn dịch cho vật chủ, tạo acid, H2O2 và bacteriocin để ức chế sự trưởng của các tác nhân gây bệnh (Reid 1999: Vá zquez et al.,

2005) Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus

được phân lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế một số vi

khuẩn gây bệnh trên cá như: A hydrophila, E tarda 524362 Bacteriocin khác với hầu

hết các kháng sinh dùng trong y học do chúng là các phân tử proterin nên dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu hóa Bacteriocin được tạo ra bởi một loài thuộc Lactobaciilus có thể ức chế nhiều loài vi khuẩn gây bệnh (Schillinger và Lucke (1989): Lewus et al (1991); Karthikeyan và Santosh (2009)) Tuy nhiên cho đến nay có khá ít

nghiên cứu sử dụng Lactobaciilus spp hay bacteriocin từ Lactobacillus spp để ức chế lại

E ictaluri Vì thế đề tài PHÂN LẬP VI KHUẨN Lactobacillus spp TRONG CÁ TRA

VÀ CÁ TRÊ CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri” đã được

tiến hành

1.2 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu này nhằm mục tiêu phân lập tuyển chọn dòng Lactobacillus spp có khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh ở cá tra

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp từ dạ dày của ruột cá tra và cá trê ở hai tỉnh

Vĩnh Long và Đồng Tháp

Kiểm tra khả năng ức chế vi khuẩn Edwarsiella ictaluri của các dòng

Lactobacillus spp phân lập được bằng hai phương pháp: phương pháp nhỏ giọt và

phương pháp khuếch tán giếng thạch

Khảo sát ảnh hưởng của một số thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng ức

chế vi khuẩn gây bệnh Edwarsiella ictaluri của dòng Lactobacillus spp phân lập được.

Bộ Cá da trơn hay bộ Cá nheo (danh pháp khoa học: Siluriformes) là một bộ cá rất

đa dạng trong nhóm cá xương Các loài cá trong bộ này dao động khá mạnh về kích thước và các thức sinh sống Tất cả chúng đều không có vảy Bộ cá này có tầm quan trọng kinh tế đáng kể; nhiều loài được chăn nuôi ở quy mô lớn để cung cấp cá thực phẩm, một vài loài được nuôi thả để làm cá câu thể thao Nhiều loài cá nhỏ, cụ thể là các loài trong chi Corydoras, được nuôi làm cá cảnh trong các bể cá

Tại thời điểm năm 2007, người ta công nhận khoảng 36 họ cá da trơn còn tồn tại với khoảng 3.023 loài còn tồn tại Điều này làm cho bộ cá da trơn trở thành bộ động vật

có xương sống đứng hàng thứ hai về sự đa dạng; trên thực tế, khoảng 1 trên 20 loài động vật có xương sống là cá da trơn theo

Các loài cá da trơn sống trong các vùng nước nội địa hay ven biển của mọi châu lục, ngoại trừ châu Nam Cực Cá da trơn là đa dạng nhất tại khu vực nhiệt đớiNam

Mỹ, châu Phi và châu Á Trên một nửa số loài cá da trơn sinh sống tại châu Mỹ Chúng là các loài cá duy nhất của bộ Ostariophysi đã di cư vào các môi trường sống nước ngọt

ở Madagascar, Australia và New Guinea

Cá da trơn chủ yếu được tìm thấy tại các môi trường sống nước ngọt, mặc dù phần lớn sinh sống trong các môi trường nước nông và lưu thông (nước chảy) Các đại diện của ít nhất là 8 họ là các loài sinh sống ngầm dưới đất với 3 họ có khả năng sinh sống trong các hang hốc Vì thế, cá da trơn là một trong những nhóm cá thành công nhất trong việc chiếm lĩnh các hang hốc

Tại Việt Nam, có thể tìm thấy cá lăng (Hemibagrus elongatus), cá chiên (Bagarius

bagarius), cá ngạnh (Cranoglanis sinensis) ở các sông đồng bằng miền Bắc như sông

Lô, sông Hồng, sông Thao, sông Đà, sông Mã, sông Lam Miền Nam thì có cá chiên sông (Bagarius yarrelli), cá lăng nha (Mystus nemurus), cá tra dầu (Pangasianodon

gigas), cá trèn bầu (Ompok bimaculatus) được thấy tại các sông rạch như sông Đồng Nai, sông Sài Gòn và hạ lưu sông Cửu Long, vùng Tiền Giang, Hậu Giang

Cá da trơn là loài thủy sinh vật được chăn nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới

và trở thành một nguồn thủy hải sản quan trọng trong công nghiệp thực phẩm, được chế biến và tiêu thụ rộng rãi trên toàn cầu

nhất Tuy nhiên tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth (1996) sử dụng

lần đầu tiên để chỉ định cho loài cá tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng phổ

biến đến nay Do đó Pangasianodon hypophthalmus được sử dụng là tên khoa học của cá

tra trong chuyên đề nay

b) Phân bố

Hình 1 Nuôi cá tra theo hình thức thâm canh ven sông Hậu

(http://www.google.com.vn/imgres?q=nuoi+ca+tra+tham+canh+o+can+tho&um=1)

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông, có mặt ở cả 4 nước như: Việt Nam, Lào, Campuchia và Thái Lan Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lưu vực sông Mê Kông và Chao phraya Ở nước ta, cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởng thành chỉ thấy trong các ao nuôi, rất ít khi tìm thấy trong tự nhiên

c) Đặc điểm hình thái và sinh thái

Hình 2 Hình thái học cá tra ( http://www.google.com.vn/imgres? q )

Cá thân dài, không vảy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đôi râu dài

Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (độ muối từ

10 – 14%o), có thể chịu đựng được nước phèn với pH ≥ 4 (pH dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị sốc),

ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nóng tới 390

C

Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác Bên cạnh đó cá

có cơ quan hô hấp phụ và có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên chịu đựng được môi trường nước có lượng oxy hòa tan thấp Chính vì lý do này mà cá tra được nuôi với mật

độ rất cao trong các ao nuôi cá tra thâm canh

d) Đặc điểm dinh dưỡng

Cá hết noãn hoàn thì thích ăn mồi tươi sống, khi cá lớn tính ăn tạp thiên về động vật

và dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt buộc như: mùn, bã hữu cơ, cám, động vật đáy,…

e) Đặc điểm sinh trưởng

Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá tra trong tự nhiên 18kg

và cá dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25kg ở cá 10 tuổi

Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1-1,5kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng trọng nhanh hơn, có khi đạt 5-6kg/năm

f) Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục: Cá tra đực thành thục ở tuổi thứ 2, cá cái ở tuổi thứ 3 trở lên

Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp) nên nhìn hình dáng ngoài khó phân biệt cá đực hay cá cái

Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh, ở cá cái gọi là buồng trứng

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 – 6 dương lịch, cá sinh sản tụ nhiên ở những đoạn sông có điều kiện sinh thái phù hợp Cá không sinh sản ở phần sông của Việt Nam Ở Campuchia, bãi sinh sản của nằm từ khu vực ngã tư giao tiếp

2 con sông Mê Kông và Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache trở lên

Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi cho cá thành thục và sinh sản sớm hơn trong

tự nhiên (3 tháng )

Trong tự nhiên không gặp tình trạng tái phát dục Chỉ có trong điều kiện nuôi nhân tạo, cá tra có thể tái phát dục 1 – 2 lần trong năm

Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá được gọi là sức sinh sản tuyệt đối Sức sinh sản tuyệt đối của cá tra có thể từ 200.000 đến vài triệu trứng

Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa: Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm,

hình que và có kích thước biến đổi, không di động Yếm khí tùy tiện, cho phản ứng catalase dương tính, âm tính trong phản ứng oxydase, H2S, Indone E ictaluri phát triển

tốt ở nhiệt độ 280C và phát triển yếu ở 370

C trong khi E tarda phát triển tốt ở 370C (Từ Thanh Dung et al., 2005)

Khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E ictaluri: Theo nghiên cứu của

Nguyễn Đức Hiền (2008) thì do việc chọn và dùng thuốc kháng sinh không đúng cách đã

làm cho độ nhạy của vi khuẩn E ictaluri đối với các loại thuốc kháng sinh ngày càng

giảm dần và nguy cơ không còn thuốc điều trị đang đến gần

2.2.2 Tên bệnh và tác nhân gây bệnh

Bệnh gan thận mủ còn có một số tên gọi khác là: bệnh trắng gan, bệnh mủ gan, bệnh ung thư gan

Tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Từ Thanh Dung et al.,

2005)

2.2.3 Phân bố, loài cá và giai đoạn nhiễm bệnh

Vi khuẩn E ictaluri xuất hiện đầu tiên trên cá nheo ở Mỹ, cá trê trắng ở Thái Lan

Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ xuất hiện trên cá tra, thỉnh thoảng xuất hiện trên cá basa Bệnh xuất hiện trên tất cả các giai đoạn phát triển của cá tra Tỉ lệ hao hụt lớn nhất ở cá giống, nhưng gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá lứa cỡ 300 – 500g (Từ Thanh Dung et al., 2005) Tỷ lệ cá chết khi bị nhiễm bệnh gan thận mủ có thể lên đến 90% (http://www.angiang.gov.vn/wps/portal)

2.2.4 Dấu hiệu bệnh lý của bệnh gan thận mủ do Edwardsiella ictaluri

Biểu hiện của cá: cá gầy, mắt hơi lồi Cá bệnh nặng bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước

và tỉ lệ chết cao Dấu hiệu bệnh bên ngoài không rõ ràng

Bên trong: xuất hiện nhiều đốm trắng đục kích cỡ 1 -3 mm trên gan, thận và tỳ tạng (Từ Thanh Dung et al., 2005)

2.3 Giới thiệu về vi khuẩn lactic, Lactobacillus spp và tình hình nghiên cứu

probiotic và bacteriocin

2.3.1 Vi khuẩn lactic và quá trình lên men acid lactic

Vi khuẩn acid lactic (lactic acid bacteria – LAB) đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm LAB là vi khuẩn Gram dương, oxydase âm tính, catalase âm tính, có dạng hình cầu hoặc hình que, không hình thành bào tử Sản phẩm chủ yếu mà chúng tạo ra trong quá trình lên men carbonhydrate (glucose và lactose) là acid lactic

Một vài giống quan trọng như: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus,

Pediococcus, Bifidobacterium và Carnobacterium (Abee et al., 1999)

LAB được quan tâm đặc biệt do khả năng lên men cũng như những lợi ích về dinh dưỡng và sức khỏe cho người và vật nuôi Vì vậy mà nhiều loài thuộc nhóm LAB đã được sử dụng như sinh vật chủ yếu trong các sản phẩm probiotic dùng cho người, chăn nuôi và thủy sản Có được đặc tính này là do LAB tạo ra nhiều chất có khả năng ức chế các loài vi khuẩn khác (Bảng 1)

Bảng 1 Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo ra bởi LAB

Giảm tính thấm của màng Diacetyl Tương tác với những protein gắn với arginine Lactoperoxidase/H2O2 Oxi hóa những protein nền

Acid lactic Những phân tử acid lactic không phân ly sẽ

xuyên qua màng tế bào làm giảm pH nội bào Làm cản trở quá trình trao đổi chất như phosphryl oxi hóa

Bacteriocin Ảnh hưởng tới màng tế bào, sinh tổng hợp

Lên men acid lactic đồng hình: nhờ hoạt động lên men của nhóm vi khuẩn lactic

đồng hình Chúng biến đổi đường thông qua quá trình đường phân và tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic Quá trình lên men acid lactic đồng hình được cho là có lợi về mặt năng lượng (ATP) cho vi khuẩn acid lactic vì chúng tạo ra được 2 phân tử ATP và 2 phân

tử acid lactic từ 1 phân tử đường được lên men Có rất nhiều loài vi khuẩn acid lactic lên

men đồng hình: Lactobacillus lactis sspp lactis, Lactobacillus lactis sspp cremoris,

Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Streptococcus pyogenes, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,…

Quá trình lên men lactic đồng hình: 1 Glucose  2 acid lactic + 2 ATP

Lên men acid lactic dị hình: nhờ hoạt động lên men của vi khuẩn lactic dị hình

Trong trường hợp này chỉ tạo thành 1 phân tử acid lactic từ 1 phân tử glucose được lên men, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như: acid lactic, ethanol, CO2 Các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm Một số loài LAB lên men acid

lactic dị hình: Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides sspp cremoris,

Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum,…

Quá trình lên men acid lactic dị hình:

1 Glucose  1 Acid lactic + 1 CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + Một số sản phẩm phụ

Lactobacillus là giống lớn nhất trong nhóm vi khuẩn acid lactic, giống này gồm

nhiều loài có sự đa dạng lớn về các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa Tuy nhiên, ngoài các đặc điểm chung của LAB thì đặc điểm điển hình để nhận ra giống này là chúng

có hình que Giống Lactobacillus bao gồm một nhóm vi khuẩn có đặc điểm: que dài và

mảnh, đôi khi có dạng que cong, thường không chuyển động, không hình thành bào tử, gram dương, không dịch hóa gelatin, catalase và oxydase đều âm tính, không tạo indole

và H2S, quá trình lên men luôn tạo sản phẩm chứa acid lactic Lactobacillus rất phổ biến

và được dùng như là giống chủng trong công nghiệp thực phẩm, nhiều loài thuộc giống

Lactobacillus được sử dụng rộng rãi trong chế biến phô-mai (Lactobacillus delbrueckii

spp., Lactobacillus helvericus, Lactobacillus casei), bơ sữa (Lactobacillus delbrueckii), sữa lên men (Lactobacillus acidophilus) và yoghurt (Lactobacillus delbrueckii) Ngoài ra

Lactobacillus cũng được dùng trong sản xuất xúc xích (Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum) (Abee et al., 1999)

2.3.3 Những nghiên cứu về probiotic và bacteriocin từ vi khuẩn acid lactic

Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ (FAO/WHO, 2001)

Việc sử dụng probiotic như thức ăn bổ sung cho vật nuôi được bắt đầu từ 1970 Chúng được trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng và sức khỏe vật nuôi bởi chúng giúp vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh (Fuller, 1992)

Probiotic gồm các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm chính là: LAB, Bacillus và nấm

men Hiện nay, các loài thuộc nhóm LAB được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm probiotic

Những ảnh hưởng có lợi của việc sử dụng những vi khuẩn có lợi cho người, gia súc và gia cầm đã được nghiên cứu và chứng minh qua nhiều tài liệu Tuy nhiên, việc sử dụng probiotic trong thủy sản là một khái niệm và việc làm tương đối mới

Gildberg et al., (1997) đã nghiên cứu tỷ lệ tăng trưởng và sống sót của cá hồi tuyết Đại Tây Dương trong việc bổ sung thức ăn khô có chứa vi khuẩn acid lactic (được phân lập từ loài cá này) cho thấy đã làm tăng đáng kể sự kháng bệnh của cá này và vi khuẩn lactic đã trở thành nhóm sinh vật chiếm ưu thế trong ruột cá sau thí nghiệm

Nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống

Lactobacillus được phân lập từ dạ dày – ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng

ức chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở cá nước ngọt như: A hydrophila,

E tarda 524362, Yersinia ruckerii và Staphylococcus aureus 169E

Bên cạnh nghiên cứu probiotic để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi thì nghiên cứu

về bacteriocin – một chất kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra mà đặc biệt là bacteriocin từ

vi khuẩn acid lactic đã thu hút nhiều nhà khoa học, không những ứng dụng bacteriocin như chất bảo quản thực phẩm mà còn dùng thay thế kháng sinh

Bacteriocin là những protein hoặc phức hợp protein có hoạt tính kháng khuẩn mà chủ yếu là hướng tới những loài có quan hệ gần gũi Bacterion được tạo ra từ vi khuẩn acid lactic đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học bởi chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc

Có nhiều loại bacteriocin được tạo ra bởi vi khuẩn acid lactic Parada et al., (2007)

đã tổng hợp nhiều kết quả phân loại bacteriocin bởi nhiều tác giả khác nhau và cuối cùng đưa ra hệ thống phân loại bacteriocin thành ba nhóm chính:

Nhóm I: Lantibiotics: bao gồm những bacteriocin có cấu trúc là chuổi peptide có

chứa lanthionine hoặc methyllanthionine, bền nhiệt, có trọng lượng phân tử nhỏ (<

5kDa), hoạt động lên cấu trúc màng tế bào Những bacteriocin thuộc nhóm I được chia thành 2 nhóm nhỏ có cấu trúc tương tự nhau Nhóm Ia gồm những peptide tương đối dài, mang điện tích dương, linh động, chúng hoạt động thông qua việc hình thành những lỗ trên màng nguyên sinh chất của loài mục tiêu, nisin là bacteriocin điển hình của nhóm này cùng là bacteriocin đã được sử dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm Nhóm Ib gồm những peptide có dạng cầu, cấu trúc ít linh động, mang điện tích âm hoặc không mang điện tích, tác động ngăn cản những phản ứng enzyme thiết yếu của loài vi khuẩn nhạy cảm

Nhóm II: Non – Lantibiotics: gồm những bacteriocin có cấu trúc là chuổi peptide

nhưng không chứa lanthionie, bền nhiệt, trọng lượng phân tử biến đổi nhưng thường nhỏ (< 10kDa) Nhóm này lại phân thành 3 nhóm nhỏ Nhóm IIa là những peptide hoạt động

kháng lại Listeria, bacteriocin điển hình của nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P

Nhóm IIb gồm những bacteriocin có 2 chuổi peptide, những peptide này ít hoặc không hoạt động và một trong hai chuỗi peptide này không có trình tự tương đồng với chuỗi peptide còn lại, đại diện nhóm này là lactococin G và plantaricins EF e JK Nhóm IIc là những bacteriocin có cấu tạo là những peptide nhỏ, bền nhiệt, đại diện nhóm này là divergicin A và acidocin B

Nhóm III :gồm những peptide lớn, khối lượng phân tử lớn (> 30kDa), dễ phân hủy

bởi nhiệt, đại diện nhóm này là helveticins J, V, acidofilicin A,…

Bảng 2 Thuộc tính của một vài bacteriocin (Aly et al., 2006)

Nisin Lactobacillus lactic sspp Lantibiotic, phổ rộng có hoạt tính lactic ATCC 11454 kháng khuẩn, được tạo ra trong giai

đoạn cuối của quá trình chu kỳ tăng trưởng,…

Pediocin A Pediococcus pentosaceus

FBB61 và L – 7230 Pediocin AcH Pediococcus acidilactici H Phổ kháng rộng

Leucocin Leuconostoc gelidum UAL 187 Phổ kháng khuẩn rộng, được tạo

ra trong giai đoạn đầu của chu kỳ tăng trưởng

Helveticin J L helveticus 481 Phổ kháng hẹp, được tạo ra trong

giai đoạn đầu của chu kỳ tăng trưởng

Theo một nghiên cứu của Aly E Abo-Amer (2007) thì một bacteriocin có tên là

Plantaricin được tạo ra từ Lactobacillus plantarum cho thấy có phổ kháng khuẩn rất rộng

kháng lại cả vi khuẩn gram (+) và gram (-)

Bảng 3 Khả năng ức chế một số vi khuẩn của plantaricin từ

Vi khuẩn Gram (+)

Theo nghiên cứu của Galindo (2004) cho thấy các loài vi khuẩn thuộc giống

Lactobacillus được phân lập từ dạ dày - ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức

chế mạnh một số loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm cá nước ngọt Khi kiểm tra khả năng ức

chế của các loài Lactobacillus này ông nhận thấy hàm lượng đường glucose bổ sung vào

môi trường MRS có ảnh hưởng đến đường kính vòng vô khuẩn khi kiểm tra bằng phương pháp agar spot test

Nhiều nghiên cứu về bacteriocin đã được thực hiện trong và ngoài nước:

Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) đã nghiên cứu thu nhận

bacteriocin bằng phương pháp lên men tế bào Lactobacillus cố định trên chất mang

cellulose vi khuẩn và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu Kết quả cho thấy lượng bacteriocin thu nhận tương đối cao

Nguyễn Thị Hoài Hà et al., (2005) đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

bacteriocin của loài Lactobacillus plantarum L24 được phân lập từ nước dưa chua Kết

quả cho thấy bacteriocin do loài này sinh ra thuộc nhóm II và lượng bacteriocin sinh ra bị ảnh hưởng bởi các nguồn nitơ vô cơ khác nhau khi được thêm vào môi trường nuôi

Công ty Trách Nhiệm Hữu Hạn Công Nghệ Sinh Học Dược NANOGEN đã nghiên cứu và thương mại hóa chế phẩm Mictocin Chế phẩm chứa reutein – một

bacteriocin chiết xuất từ Lactobacillus reuteri, loài vi khuẩn cộng sinh đường ruột Chế

phẩm đã được khảo nghiệm bởi tiến sĩ Bùi Quang Tề thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I Qua kết quả thử kháng sinh đồ chứng tỏ chế phẩm có khả năng ức chế

vi khuẩn gây bệnh ở cá nước ngọt như: Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda,

Streptococcus spp ở nồng độ thử từ 10 - 60µl

Karthikeyan và Santosh (2009) đã phân lập và mô tả một loài bacteriocin được tạo

ra từ Lactobacillus plantarum, loài vi khuẩn được phân lập từ ruột tôm (Penaeus

monodon), bacteriocin này đã kháng lại được một vài vi khuẩn gây bệnh như: Salmonella typhimurium, Vibrio cholera, Staphylococcus aereus,…

Bacteriocin hay những chất giống bacteriocin từ vi khuẩn lactic mà đặc biệt là

giống Lactobacillus có khả năng ức chế lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh đã được nghiên

cứu và công bố bởi nhiều tác giả (Harris et al., (1989), Tahara et al., (1996), Chung (2003), Hernández et al., (2005), Mezaini et al., (2009), Gong et al., (2010) Bên cạnh đó nhiều nghiên cứu cho thấy rằng thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến sự tạo ra bacteriocin (Leroy và Vuyst (1999), Ogumbanwo et al., (2003),

Todorow và Dicks (2005), Mollendorff et al., (2009), Sarika et al., (2010), Wang et al., (2010)

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian địa điểm

- Thời gian: Từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Viện Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại phòng thí nghiệm Công nhệ sinh học Thực phẩm, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học

- Thiệt bị, dụng cụ dung để mổ tách lấy phần vật chất trong dạ dày – ruột cá: chài,

xô, kéo, dao mổ, găng tay,…

- Thiết bị, dụng cụ dung để phân lập vi khuẩn Lactobacillus sp: Đĩa Petri, que cấy,

bình tam giác, bộ pipetman (20-1000 l), tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh, nồi háp khử trùng nhiệt ướt (autoclave), lò vi sóng, bể điều nhiệt, buồng đếm hồng cầu, máy lắc mẫu, kính hiển vi Olympus,…

- Một số thiết bị, dụng cụ khác: Tủ lạnh, bình hút ẩm (đã loại bỏ các hạt hút ẩm), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu

3.1.3 Nguyên vật liệu

Mẫu cá tra, cá trê được thu tại ao nuôi cá tại các ao nuôi theo mô hình thâm canh, bán thâm canh, quản canh và cá bán ngoài chợ ở Đồng Tháp và Vĩnh Long Đây là 2 địa phương có diện tích ao nuôi và lồng bè nuôi cá tra và cá trê lớn ở Đồng bằng sông Cửu Long

Chủng vi khuẩn bệnh Edwardsiella ictaluri được nhận từ Bộ môn Sinh học và

bệnh thủy sản thuộc khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ

3.1.4 Hóa chất, môi trường

a Môi trường :

- Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp :

+ Môi trường lỏng MRS (De Man, Rogosa and Sharpe)

Bảng 4: Thành phần của môi trường MRS broth (Microbiology manual,

+ Môi trường MRS agar

Thành phần giống như môi trường MRS broth nhưng có thêm 12g agar

Bảng 5: Thành phần môi trường Trypticase (tryptic) Soy (TSB) (Nguyễn Đức

- Hóa chất thử khả năng sinh catalase: H2O2 3%

- Hóa chất thử oxydase: Dung dịch Tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrocchloride 1% (mua từ công ty Nam Khoa biotek)

3.2.2 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống

Lactobacillus

* Mục đích: Phân lập được các dòng vi khuẩn Lactobacillus spp thuần từ dạ dày,

ruột của cá tra, cá trê

* Sơ đồ thí nghiệm:

Cá Tra, Cá Trê

Mổ tách lấy phần vật chất trong dạ dày- ruột trong tủ cấy vô trùng, cho vào bình tam giác

đã khử trùng, đậy kín Đồng nhất với nước cất vô trùng đưa về dạng lỏng

Nuôi trong môi trường MRS broth ( kỵ khí ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ)

Cấy trên môi trường MRS agar (ủ kỵ khí ở nhiệt độ 300C trong 48 giờ, trong bình hút ẩm)

Kiểm tra hình thái- sinh hóa, tách ròng Lactobacillus spp

Dòng Lactobacillus spp thuần

Trữ trong ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar ở 40

C

 Qui trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp từ mẫu cá da trơn:

Cá tra, cá trê được thu từ các ao nuôi được mổ ra để lấy phần ruột Các bộ phận này được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và cồn 700 sau đó mổ ra Phần thức ăn đang được tiêu hóa có trong ruột được cho vào bình tam giác đã được khử trùng và trữ lạnh và

mang về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp.

Mẫu sau khi thu được trong một ao sẽ được đồng nhất bằng nước cất, để lên máy lắc 20 phút (150 vòng/phút), để lắng Dùng micropipet hút 1ml phần dịch trong cho vào bình tam giác chứa 100ml MRS broth rồi đem ủ ở 300C trong điều kiện kỵ khí trong thời gian 48 giờ

Pha loãng dịch nuôi cấy trên trong nước cất vô trùng Sau đó hút 50 l từ các ống nghiệm nhỏ lên môi trường MRS agar và tiến hành trãi mẫu, đậy kín, đem ủ kỵ khí ở

300C trong 48 giờ

Tiến hành pha loãng và cấy ria từ các khuẩn lạc đã mọc sau 48 giờ ủ ra các đĩa petri có chứa MRS agar để tiến hành tách ròng (khuẩn lạc rời, nhỏ, có kích thước và màu sắc giống nhau) Sau đó quan sát dưới kính hiển vi và thực hiện nhuộm Gram, nhuộm bào

tử để định danh sơ bộ dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống Lactobacillus Nếu mẫu

ròng cấy chuyển vào ống nghiệm và đem trữ ở 40C cho những nghiên cứu tiếp theo

3.2.3 Tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao

* Mục đích: tuyển chọn các dòng Lactobacillus phân lâp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao

* Phương pháp: Có hai phương pháp phổ biến để kiểm tra khả năng ức chế lại vi sinh vật khác của vi khuẩn lactic đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước thực hiện

là nhỏ giọt (agar spot test) và khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) Sau đó

dựa vào đường kính vòng vô khuẩn để tuyển chọn những dòng Lactobacillus spp có

khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ cao

* Sơ đồ thí nghiệm tổng quát:

Lactobacillus spp

Kiểm tra khả năng ức chế E ictaluri bằng

phương pháp nhỏ giọt

Nuôi và ly tâm thu bacteriocin thô

Kiểm tra và chọn dòng ức chế E.ictaluri bằng phương pháp

khuếch tán giếng thạch

Chọn ra những dòng Lactobacillus

có khả năng kháng E ictaluri cao

a Phương pháp 1: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng kháng vi

khuẩn Edwardsiella -ictaluri cao bằng phương pháp nhỏ giọt:

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại

- Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố là 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập

được

- Số đơn vị thí nghiệm: 17 (dòng vi khuẩn phân lập được) x 2 (số lần lặp lại) = 34 Phương pháp nhỏ giọt được tiến hành theo như mô tả bởi Galindo (2004) nhưng có một số biến đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

 Thực hiện thí nghiệm:

- Kiểm tra khả năng ức chế E ictaluri của 17 dòng Lactobacillus spp phân lập bằng phương pháp nhỏ giọt, sau đó chọn những dòng có khả năng kháng E ictaluri cao

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào khả năng ức chế của các thành phần

mà Lactobacillus spp sinh ra trong môi trường MRS broth (acid lactic, ethanol,

diacetyl, bacteriocin,…) lên dòng vi khuẩn chỉ thị

- Cách thức thực hiện phương pháp này như sau:

+ Mỗi dòng Lactobacillus spp Được nuôi trong 2 ống nghiệm (chứa 9 ml MRS

broth/ ống) trong 24 giờ Mỗi ống nghiệm được xem như một lần lập lại

+ Spot được bơm 50 l dịch nuôi Lactobacillus spp Được nuôi trong 24 giờ trong

MRS broth vào bề mặt mô trường MRS agar đã được rót ra đĩa Petri (mỗi đĩa Petri

chỉ kiểm tra khả năng ức chế của một dòng Lactobacillus spp Gồm 3 spot được

làm từ một ống nghiệm của mỗi dòng được nuôi ở trên) Ủ kỵ khí 24 giờ ở 300C cho spot phát triển

+ 5ml môi trường solf agar (nhiệt độ khoảng 370C) gồm : BHI có chứa 0,5% agar

và 30% của E ictaluri đã nuôi 24 giờ trong môi trường BHI, rót vào MRS agar đã

có spot đã phát triển

+ Ủ ở 280C, 48 giờ

+ Kiểm tra đường kính vòng vô khuẩn xung quanh spot

+ Ghi nhận kết quả (đường kính vòng vô khuẩn = đường kính tổng – đường kính spot) Khả năng ức chế lại dòng vi khuẩn gây bệnh được đánh giá theo qui ước của Galindo (2004)

Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế E ictaluri và của các dòng Lactobacillus bằng

phương pháp nhỏ giọt:

MRS agar được rót ra đĩa Petri, để nguội

Tạo spot bằng Lactobacillus spp

đã được nuôi trước 24 giờ trong MRS broth

Ủ kỵ khí ở 300

C, 24h

Chủng 5ml môi trường BHI có chứa 0,7% agar và 30% E.ictaluri

đã nuôi 24 giờ trong BHI

Ủ 280C, 48 giờ

Đo đường kính vòng vô khuẩn ( nếu có)

b Phương pháp 2: Khảo sát vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cao bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch:

Kiểm tra khả năng ức chế Edwardsiella ictaluri của Lactobacillus spp bằng

phương pháp khuếch tán giếng thạch theo như mô tả bởi Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2008) nhưng được điều chỉnh cho phù hợp với đặc điểm dòng vi khuẩn

sử dụng và điều kiện phòng thí nghiệm Sau đó chọn ra những dòng có khả năng kháng vi

khuẩn E ictaluri cao

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại

- Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố là 17 dòng vi khuẩn Lactobacillus phân lập được

- Số đơn vị thí nghiệm: 17 (số dòng vi khuẩn phân lập được) x 2 (số lần lặp lại) = 34

 Thực hiện thí nghiệm:

Tất cả 17 dòng Lactobacillus spp phân lập sẽ được nuôi trong môi trường MRS broth

để ly tâm thu bacteriocin thô

- Chuẩn bị bacteriocin thô từ vi khuẩn Lactobacillus spp phân lập được:

+ Mười bảy (17) dòng Lactobacillus spp phân lập, mỗi dòng được nuôi trong 2

ống nghiệm (mỗi ống nghiệm được xem như một lần lặp lại) có chứa 19 ml MRS broth/ ống trong 48 giờ, ly tâm 7000 rpm ở nhiệt độ 80C trong 10 phút để lấy phần dịch trong Điều chỉnh pH của dịch trong về pH 6,0 bằng NaOH 1M Dịch trong bây giờ được xem như là bacteriocin thô Dịch thô này sẽ được trữ trong tủ lạnh ở

+ E ictaluri nhận từ Bộ môn sinh học và Bệnh thủy sản sẽ được nuôi trong môi

trường BHI trong 48 giờ, đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu, pha loãng sao cho mật

số khoảng 108

tb/ml Sau đó hút 50 l dịch nuôi này cho vào môi trường TSA đã được rót

ra đĩa Petri, trải mẫu, để ráo

+ Lấy đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh, đục lỗ thạch có đường kính 8 mm (mỗi đĩa Petri đục 4 lỗ: 3 lỗ cho bacteriocin thô vào và 1 lỗ đối chứng cho nước cất vô trùng vào)

+ Dùng micropipette hút 50 l bacteriocin thô của Lactobacillus spp bơm vào mỗi

lỗ thạch

+ Ủ ở 280C, 48 giờ

+Lấy các đĩa Petri này ra quan sát, ghi nhận khả năng ức chế vi khuẩn E ictaluri thông

qua sự hình thành vòng vô khuẩn và đường kính của vòng vô khuẩn (đường kính của vòng vô khuẩn = đường kính tổng – đường kính lỗ thạch (8 mm))

*Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế E ictaluri và của các dòng Lactobacillus bằng

phương pháp khuếch tán giếng thạch:

Môi trường TSA Rót ra đĩa Petri, để nguội

Chủng 50 l dịch nuôi E ictaluri được nuôi 48 giờ,

pha loãng để đạt mật số khoảng 108

tb/ml trãi mẫu, để ráo

Tạo giếng có đường kính 8 mm Bơm 50 l bacteriocin thô/ giếng

Ủ ở 280C, 48 giờ

Đo dường kính vòng vô khuẩn ( nếu có)

* Tuyển chọn những dòng Lactobacillus có khả năng kháng lại vi khuẩn E

ictaluri cao: Sau khi đã xác định 2 dòng Lactobacillus (CT2-TB7 và CT2-TB11) có khả

năng kháng lại vi khuẩn E ictaluri bằng 2 phương pháp trên, xác định mức độ kháng vi khuẩn E ictaluri từ đó chọn dòng Lactobacillus CT2-TB7 có khả năng kháng vi khuẩn E

ictaluri cao nhờ vào đường kính vòng tròn kháng khuẩn lớn nhất (Galindo, 2004)

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng

ức chế Edwardsiella ictaluri của vi khuẩn Lactobacillus spp

a Mục đích: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ 4 thành phần môi trường nuôi

cấy (Yeast extract, Glucose, Peptone và Tween 80) đến khả năng ức chế Edwardsiella

ictaluri của vi khuẩn Lactobacillus spp

b Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 lần lặp

lại

- Nhân tố thí nghiệm: 1 nhân tố (nồng độ từng thành phần môi trường thêm vào)

- Số đơn vị thí nghiệm: (2 (số dòng Lactobacillus spp.chọn làm thí nghiệm) x 3 (

nồng độ từng thành phần) x 4 (4 thành phần thêm vào) + 2 (đối chứng: MRS không thêm thành phần nào của từng dòng vi khuẩn)) x 2 lần lặp lại = 52

Sơ đồ thực hiện thí nghiệm:

Lactobacillus spp

(có khả năng sinh bacteriocin)

 Nuôi trong môi trường lỏng MRS với thành phần được biến đổi

(ở điều kiện kỵ khí trong 48 giờ, ở 300

 Kiểm tra khả năng ức chế kháng khuẩn

c Thực hiện thí nghiệm:

Dòng vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng ức chế loài vi khuẩn gây bệnh trên

khi được kiểm tra bằng phương pháp well diffusion agar mạnh nhất sẽ được chọn để khảo sát ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy lên sự hình thành bacteriocin

Trong thí nghiệm này chọn loài vi khuẩn gây bệnh trên làm loài chỉ thị

- Chuẩn bị môi trường MRS broth được biến đổi một số thành phần với hàm lượng như sau: yeast extract (0; 1; 2; 3% w/v), peptone (0; 1; 2; 3% w/v), glucose (0; 1; 2; 3% w/v), tween 80 (0; 1; 2; 3% w/v)

- Dòng vi khuẩn Lactobacillus spp được tuyển chọn sẽ được nuôi trong các môi

trường MRS broth được biến đổi như trên trong 48 giờ ở 300C ở điều kiện kị khí tĩnh

- Ly tâm thu nhận bacteriocin thô Trữ các eppendorf (trong tủ lạnh ở 4 0C) chứa bacteriocin thô

Bacteriocin thô thu được sẽ được đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thân mủ bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch (well diffusion agar) từ đó chọn ra

môi trường nuôi cấy để vi khuẩn Lactobacillus spp có khả năng ức chế vi khuẩn E

ictaluri cao

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc giống

Lactobacillus

4.1.1 Phân lập vi khuẩn từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê

Mười bảy (17) dòng vi khuẩn đã được phân lập tách ròng trên môi trường MRS agar từ dạ dày và ruột cá tra và cá trê thu được từ 3 mô hình nuôi (quản canh, bán thâm canh, thâm canh) và tại các chợ và hộ gia đình khác nhau thuộc 2 tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long (Bảng 7)