NGHIÊN cứu THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE kỹ THUẬT từ xạ KHUẨN và ỨNG DỤNG sản XUẤT THỬ NGHIỆM bột RONG THỰC PHẨM

Các enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác tạo thành glucose và một

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

- -

NGUYỄN PHƯỚC BẢO HOÀNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE KỸ THUẬT TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch

Mã số: 60 54 10

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS TRẦN THỊ LUYẾN

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này

Trước hết tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trần Thị Luyến đã

định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa

luận văn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành

cuốn luận văn này

Đồng thời, tôi cũng gửi xin cảm ơn quý Thầy, Cô trong Hội đồng bảo vệ

đề cương thạc sĩ đã có những ý kiến đóng góp, lời khuyên quý báu để công trình

nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng

Xin gửi lời cảm ơn quý Thầy Cô Viện công nghệ Sinh học và Môi trường,

Phòng thí nghiệm Viện CNSH và Bộ môn Hóa - Vi sinh, Khoa Chế Biến, Trường

Đại học Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt

thời gian tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của bản thân đến gia đình vì

tình yêu thương, đã luôn ở bên cạnh động viên và ủng hộ trong suốt quá trình học

cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã

dành cho tôi tình cảm quý báu này!

Xin trân trọng cảm ơn!

Khánh Hòa, tháng 01 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Phước Bảo Hoàng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi dưới

sự hướng dẫn của GS.TS Trần Thị Luyến Các số liệu và kết quả nghiên cứu

được nêu trong luận văn là trung thực, có trích dẫn nguồn gốc rõ ràng và chưa

từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Khánh Hòa, tháng 03 năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Phước Bảo Hoàng

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 4

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 4

1.1.2 Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 5

1.1.3 Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn 7

1.1.4 Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora 8

1.2 Tổng quan enzyme cellulase 10

1.2.1 Cơ chất của enzyme cellulase 10

1.2.2 Phức hệ enzyme cellulase phân cắt cellulose 15

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase 24

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase 29

1.3.1 Lược sử nghiên cứu cellulase trên thế giới và trong nước 29

1.3.2 Các lĩnh vực ứng dụng cellulase 32

1.4 Rong Mứt 36

1.4.1 Giới thiệu chung 36

1.4.2 Hệ thống và đặc điểm phân loại rong Mứt 36

1.4.3 Tình hình chế biến và sử dụng thực phẩm được từ rong biển tại Việt Nam 39

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43

2.1 Đối tượng và hóa chất 43

2.1.1 Đối tượng 43

2.1.2 Hóa chất và thiết bị chuyên dụng 44

2.2 Phương pháp nghiên cứu 48

2.2.1 Phương pháp hóa sinh 48

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 49

2.2.3 Phương pháp đánh giá phân tích 50

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 51

2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính 51

2.3.2 Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase 51

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh enzyme 54

2.4 Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy 57

2.4.1 Lựa chọn tác nhân kết tủa 57

2.4.2 Lựa chọn nồng độ kết tủa 58

2.4.3 Xác định tính chất lý hóa của C-CPE 58

2.5 Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis 59

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 64

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao 65

3.1.1 Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp 65

3.1.2 Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 67

3.2 Xác định các điều kiện môi trường tối ưu sinh tổng hợp cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 72

3.2.1 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian 72

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 74

3.2.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nguồn carbon 76

3.2.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitrogen 79

3.2.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 82

3.2.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu 83

3.2.7 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme celluase có hoạt tính cao nhất theo quy hoạch Box – Behnken .85

3.3 Nghiên cứu tách chiết và xác định một số đặc tính của cellulase của Micromonospora

VTCC-A-1787 91

3.3.1 Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân kết tủa C-DC 91

3.3.2 Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ tác nhân kết tủa 93

3.3.3 Nghiên cứu tính chất lý hóa của C-CPE cellulase 94

3.4 Đề xuất quy trình thu chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ chủng xạ khuẩn chi Micromonospora VTCC-A-1787 95

3.5 Nghiên cứu sản xuất bột rong thực phẩm 96

3.5.1 Kết quả nghiên cứu xác định các thành phần chủ yếu trong rong Mứt Porphyra Vietnamensis 97

3.5.2 Kết quả nghiên cứu sử dụng C-CPE của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 trong quá trình thủy phân 98

3.5.3 Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng bột rong 98

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 101

Kết luận 101

Kiến nghị 101

TÀI LIỆU THAM KHẢO 102

PHỤ LỤC 106

Phụ lục 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH 106

Phụ lục 2 BẢNG KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM 111

Phụ lục 3 MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG 114

Phụ lục 4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 116

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose của các loại thực vật 13

Bảng 1.2 Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau 25

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng trong 100g rong Mứt 39

Bảng 2.1 Nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora-VTCC 43

Bảng 2.2 Thành phần hóa học môi trường nuôi cấy 45

Bảng 2.3 Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 47

Bảng 3.1 Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 65

Bảng 3.2 Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày 67

Bảng 3.3 Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora VTCC-A-1787 68

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 77

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 80

Bảng 3.6 Các nhân tố và khoảng biến thiên của quy hoạch thực nghiệm 86

Bảng 3.7 Các kết quả thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm 86

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của tác nhân tủa khác nhau đên C-CPE cellulase Micromonospora VTCC-A-1787 92

Bảng 3.9 Thành phần hóa học trong rong Porphyra vietnamensis khô 97

Bảng 3.10 Kết quả của quá trình thủy phân rong Mứt bằng C-CPE 98

Bảng 3.11 Trạng thái cảm quan của bột rong thủy phân 99

Bảng 3.12 Thành phần dinh dưỡng cơ bản của bột rong 99

Bảng 3.13 Kết quả kiểm nghiệm vi sinh vật bột rong thủy phân 100

DANH MỤC HÌNH

Hình 1-1 Cấu trúc của xạ khuẩn 5

Hình 1-2 Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật 11

Hình 1-3 Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử cellulose (b) 11

Hình 1-4 Liên kết β-1,4 glucoside trong mạch cellulose 12

Hình 1-5 Liên kết hydro giữa các sợi cellulose 12

Hình 1-6 Cơ chế hoạt động của Exo-glucanase 16

Hình 1-7 Cơ chế hoạt động của Endoglucanase 16

Hình 1-8 Cơ chế hoạt động của β-glucosidase 17

Hình 1-9 Mô hình phân hủy cellulose tinh thể 17

Hình 1-10 Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose 19

Hình 1-11 Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase 20

Hình 1-12 Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) 21

Hình 1-13 Các loại rong Mứt phổ biến tại Việt Nam 37

Hình 2-1 Các chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC 43

Hình 2-2 Hình dáng rong Mứt Porphyra vietnamensis 44

Hình 2-3 Rong Mứt Porphyra vietnamensis tươi 44

Hình 2-4 Các nguyên liệu bổ sung vào môi trường nuôi cấy 45

Hình 2-5 Quá trình định tính cellulase 48

Hình 2-6 Đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu 49

Hình 2.7 Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis 61

Hình 2.8 Mẫu rong Mứt Porphyra vietnamensis khô sau khi xử lý 61

Hình 2.9 Mẫu rong ngâm xử lý CH3COOH 1% 62

Hình 2.10 Bột rong Mứt nguyên liệu 63

Hình 3-1 Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày 66

Hình 3-2 Khuẩn lạc Micromonospora VTCC-A-1787 67

Hình 3-3 Khả năng lên men đường của Micromonospora VTCC-A-1787 68

Hình 3-4 Đường cong sinh trưởng của Micromonospora VTCC-A-1787 69

Hình 3-5 Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 71

Hình 3-6 Vòng phân giải cơ chất CMC theo thời gian 72

Hình 3-7 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng

Micromonospora VTCC-A-1787 73

Hình 3-8 Ảnh hưởng nồng độ cơ chất CMC đến kích thước vòng phân giải 74

Hình 3-9 Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 75

Hình 3-10 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến vòng phân giải CMC 76

Hình 3-11 Ảnh hưởng của nồng độ bã mía đến hoạt tính enzyme cellulase của

chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 78

Hình 3-12 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến vòng phân giải CMC 80

Hình 3-13 Ảnh hưởng của nồng độ bột cá đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 81

Hình 3-14 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến vòng phân giải cơ chất 82

Hình 3-15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 83

Hình 3-16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến vòng phân giải

cơ chất CMC 84

Hình 3-17 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả năng tổng hợp

enzyme chủng MicromonosporaVTCC-A- 1787 84

Hình 3-18a Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở nồng độ pH 6,5 với nhiệt độ

và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D 87

Hình 3-18b Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzymepH 6,5 với nhiệt độ và thời

gian nuôi cấy dạng mặt phẳng 88

Hình 3-19a Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH

và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D .88

Hình 3-19b Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH và

nhiệt độ ở dạng mặt phẳng 89

Hình 3-20a Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzymeở nhiệt đô 32,50C với pH và thời

gian ở dạng 3D 89

Hình 3-20b Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở nhiệt đô 32,50C với pH và thời

gian ở dạng mặt phẳng 90

Hình 3-21 C-DC cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787 91

Hình 3-22 Vòng phân giải cơ chất CMC của C-DC cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 theo quy trình tối ưu 91

Hình 3-23 Kết quả đường kính thủy phân trước và sau khi kết tủa 92

Hình 3-24 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt độ enzyme 93

Hình 3-25 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme 94

Hình 3-26 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme 95

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Dưới góc độ y học, rong biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu

chất dinh dưỡng, có tác dụng đến sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người

Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng

và phổ biến Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn

nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích

mà rong đem lại Hơn nữa, các sản phẩm từ rong biển ở nước ta chưa nhiều, chưa

thực sự được chú ý và phổ biến, rất ít người dân biết đến loại thực phẩm đặc biệt

này, đây đang là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ [21]

Ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản và hàm lượng acid amin quan

trọng vốn có, rong biển còn chứa lượng cel lớn mà cơ thể con người không có

khả năng tiêu hóa Cel là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế

bào thực vật, là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân hủy cel

bằng các tác nhân lý hóa (acid, bazơ mạnh) gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng

đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp và không được khuyến khích

trong chế biến thực phẩm ngày nay Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay

thế bằng các phương pháp an toàn hơn

Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi nhận thấy có thể ứng dụng các chế

phẩm vi sinh vật có hoạt tính cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất

cel, đây là loại enzyme hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm

Cellulase là một phức hợp enzyme bao gồm 3 loại enzyme thủy phân cel Các

enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4

glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác

tạo thành glucose và một số đường chức năng như Oligossacharide Các nghiên

cứu về Oligossacharide trong thực phẩm và dinh dưỡng đang là vấn đề quan tâm

của các nhà khoa học trên thế giới Đây là nhóm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng

và mức năng lượng thấp, nhưng lại chứa các hoạt chất cải thiện chất lượng sản

phẩm và tăng cường sức khỏe con người [42, 39]

Cellulase được sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau như thực vật,

động vật và chủ yếu vẫn là từ VSV như vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens,

Cllulosemanas), nấm (Trichoderma viride, Aspergillus niger) và xạ khuẩn

(Actinomycetes) Trong những năm gần đây, nhóm XK đang được các nhà sinh

vật thế giới quan tâm nghiên cứu dùng để sản xuất kháng sinh và enzyme gồm 2

chi là Streptomyces và Micromonospora Việc hướng đến sử dụng chế phẩm từ

VSV trong sản xuất thực phẩm ngày nay ngày càng rộng rãi, đây là một hướng đi

mới tất yếu và hiệu quả trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống bằng

phương pháp hóa học đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [17]

Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng được

sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm

enzyme trên thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm Enzyme và những chế

phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp,

công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước

ngoài với giá thành cao mặc dù nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng

làm nguyên liệu để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, dễ kiếm, rẻ tiền

như: mạt cưa, mùn gỗ, mạt dừa, rơm Bên cạnh đó, ở Việt Nam nhóm XK chi

Micromonospora được nghiên cứu từ những năm 90 nhưng kết quả còn rất hạn

chế Do đó, với mong muốn được tiếp tục tìm hiểu về đặc tính phân loại và khả

năng sinh tổng hợp enzyme của nhóm XK chi Micromonospora, góp phần

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzyme hoạt tính cao có nguồn gốc tự nhiên,

tiếp tục nghiên cứu để sản xuất được cellulase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu

thị trường và các loại thực phẩm có các thành phần chứa hoạt tính sinh học nhằm

gia tăng giá trị rong biển Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm

enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột

rong thực phẩm” là cần thiết

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài

Thăm dò các điều kiện thích hợp để khai thác và thu nhận dịch chiết và

chế phẩm enzyme kỹ thuật từ XK chi Micromonospora Sau đó sử dụng C-CPE

này thủy phân rong Porphyra Việt Nam để sản xuất bột rong thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora thích hợp và

nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

enzyme cellulase có hoạt tính cao

- Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm

enzyme kỹ thuật ở quy mô phòng thí nghiệm

- Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong

mứt sản xuất bột rong thực phẩm và đánh giá chất lượng của bột rong này

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần thêm những hiểu biết về đặc

tính enzyme cellulase sản xuất từ XK được phân lập tại Việt Nam và ứng dụng

của enzyme này trong chế biến thực phẩm

- Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ

thuật, bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực

phẩm, ngành Công nghệ sinh học

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Bước đầu nghiên cứu sử dụng enzyme chiết rút từ XK Micromonospora

để thủy phân rong biển và thu chế phẩm là bột rong Kết quả thu được là cơ sở để

đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của enzyme cellulase VSV Từ đó cải

thiện, nâng cao chất lượng và góp phần tìm ra hướng giải quyết mới mang lại

hiệu quả kinh tế cho enzyme sản xuất từ VSV Việt Nam và cho rong biển Việt

Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinobacteria) hay còn gọi là nấm tia, theo từ cổ Hy Lạp

“Acti” có nghĩa là tia, thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi

trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả

trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được

Theo Agre và một số tác giả khác (1969) thì sự phân bố của xạ khuẩn phụ

thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Ngay từ

những năm đầu của thế kỷ XX, Mike đã phân lập được các chủng XK ưa nhiệt

thuần khiết trong quá trình phân hủy rác, bã, rơm rạ, cỏ khô Rabinowitch (1895)

và Tsiklinsky (1903) đã phân lập được xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân Năm 1912,

Noack phân lập được chúng từ cỏ khô Năm 1912, Gilbert cũng đã phân lập được

XK ưa nhiệt từ nhiều cơ chất khác nhau như không khí, cát, sa mạc, than bùn,

đặc biệt là trong ruột người và nước cống thải Tendler (1959) và Burkholder

(1960) đã phân lập được hơn 100 chủng XK ưa nhiệt thuộc 2 giống

Thermomonosprora và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau của các nước Mỹ,

Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Pêru, Chilê Kosmather (1953, 1962) đã phân lập được

nhiều chủng XK ưa nhiệt từ các vùng Liên Xô cũ như miền Bắc, miền Tây, các

vùng núi cao như Capcazơ, Palmia…

Waksman (1959) khi phân lập và tuyển chọn XK ưa nhiệt đã cho thấy

chúng hầu như có mặt trong tất cả các loại đất và ở các mùa trong năm Ngay ở

vùng ôn đới nhiều loại đất cũng thường có 10.000÷15.000 mầm XK trong 1 gam

đất khô Vào mùa đông số lượng XK ưa nhiệt chỉ chiếm khoảng 10÷15% so với

tổng vsv ưa nhiệt, nhưng đến mùa hè thì số lượng chúng tăng lên đến 70÷90%

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000÷2.400.000 mầm XK,

chiếm 9÷45% tổng số VSV [45]

Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ pH môi trường

XK được chia làm 2 loại là ưa ấm, phát triển và sinh trưởng ở nhiệt độ từ

kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8÷7,5 Ở các vùng đất khô chúng có thể chiếm 25%

tổng số hệ vsv đất Trong XK, chủng Streptomyces và Micromonospora chiếm tỷ

lệ lớn, đây là chủng có khả năng phân hủy cellulose mạnh và là nhóm vsv amôn

hóa, có khả năng tiết kháng sinh vào môi trường đất

1.1.2 Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Về kích thước thì XK tương đối nhỏ bé và tương đương với vi khuẩn XK

có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể là một tế

bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh

chất, chất nhân và các thể ẩn nhập [6, 22]

Hình 1-1 Cấu trúc của xạ khuẩn Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới dày 10-20nm, có tác dụng duy

trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp và không có

chứa cel hay chitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi và

vận chuyển chất qua màng tế bào Dưới thành tế bào là màng sinh chất dày

khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein,

có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành

bào tử của XK Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn chưa có nhân phân

hóa rõ rệt (không có cấu trúc điển hình), nhân thuộc loại đơn giản, chỉ là những

nhiễm sắc thể không có màng nhân

 Về đặc điểm hình thái

- Khuẩn lạc: Có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn

(chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Kích thước và khối lượng hệ sợi

thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Hình dạng

khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay

dạng màng dẻo, có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành

phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm Khuẩn lạc XK có màu sắc khác nhau: da cam,

vàng, nâu tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [6]

- Khuẩn ty: Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2

loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là khuẩn ty cơ chất với chức năng dinh

dưỡng là chủ yếu, tùy thuộc vào từng loài mà mức độ đâm sâu vào môi trường

thạch khác nhau Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh với

chức năng chủ yếu là sinh sản Đường kính khuẩn ty XK thay đổi trong khoảng

0,2÷0,1µm đến 2÷3µm [23]

Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố,

enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào XK

hay được tiết ra trong môi trường

 Về cách thức sinh sản

- Sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi: Mỗi đoạn sợi xạ khuẩn khi đứt ra

đều có khả năng nảy chồi tạo ra hệ sợi XK

- Bằng sự nãy chồi phân nhánh: Trên bề mặt XK xuất hiện những mấu

lồi, những mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi lớn lên thành nhánh mới

- Phân cắt trực tiếp tế bào

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh

gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử ở các loài XK khác nhau thì có kích

thước và hình dạng khác nhau Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK, đặc

điểm hình dạng cuốn sinh bào tử là một trong những tiêu chuẩn quan trọng nhất

phân loại XK Cuốn sinh bào tử của XK có loài có cấu trúc theo dạng thẳng hoặc

hình lượn sóng (RF), có loài dạng lò xo (S) hay xoắn ốc Sắp xếp của các cuốn

sinh bào tử cũng khác nhau, có thể sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc

vòng hoặc từng chùm Bào tử được hình thành từ cuốn sinh bào có thể theo 2

kiểu kết đoạn hoặc cắt khúc Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải

kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng

quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm [6]

1.1.3 Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn

XK là nhóm vi sinh vật dị dưỡng phân bố rộng rãi Một trong những đặc

tính quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành chất kháng sinh và tham gia

tích cực vào các quá trình chuyển hoá, phân giải nhiều hợp chất hữu cơ trong đất,

nước như cel, tinh bột Dùng để sản xuất nhiều enzyme như protease, amylase,

cellulase, một số acid amin và acid hữu cơ Khả năng đồng hóa các chất ở các

loài hay chủng XK khác nhau là khác nhau

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có

tới 80% là do XK sinh ra, 60÷70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinh

chất kháng sinh [23] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại XK hiếm

như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium,

Streptosporangium Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều

chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin,

vancomixin, rosamixi

Bên cạnh khả năng tổng hợp nhiều chất kháng sinh quan trọng, các nhà

sinh học còn chú ý đến một đặc tính khác của XK là năng lực phân giải một số

polysaccharide bền vững, điển hình là cel Đây là nguồn hữu cơ tự nhiên vô tận

do cây xanh quang hợp và một phần tồn tại trong các phế phụ phẩm nông nghiệp

như bã mía, lõi ngô, vỏ lạc, xơ bông, cám gạo, mùn cưa Năm 1930, Jensen đã

phân lập được nhiều loại trong giống Micromonospora có khả năng phân giải

cellulose Năm 1946, Hungate đã phân lập từ ruột mối một loại thuộc

Micromonospora có khả năng phân giải cel đặt tên là Micmonospora propiocini

Cho đến nay, khả năng phân giải cel của XK đã được nhiều nhà nghiên cứu chú ý

và đã đem lại nhiều ứng dụng trong thực tiễn

1.1.4 Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora

Theo một số tài liệu [31,37,41,45] vị trí phân loại của Micromonospora

được xếp như sau:

Mỗi loại VSV có sự phân bố trong tự nhiên là khác nhau, ngay cả khi

chúng cùng một chủng loại Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy

Micromonospora có rất ít trong đất, chỉ chiếm 1,2% Micromonospora trong khi

phân lập Actinomycetes Szabo’Zsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của

Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ

50÷60% Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của

Micromonospora Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000

Micromonospora Nước hồ có rất ít Actinomycetes nhưng có đến 76% là

Micromonospora, trong khi đó Streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy,

1941) Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nước biển và

đất phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong

các phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển

1.1.4.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora

- Micromonospora có hệ sợi sinh trưởng mạnh, khuẩn ty cơ chất phân

nhánh, thường không có khuẩn ty khí sinh, có vách ngăn, bắt màu Gram dương

(+), không nhuộm kháng acid Đường kính khuẩn ty trung bình từ 0,2 đến 0,6µm

- Bào tử không có khả năng di động, bào tử riêng lẻ không cuống hoặc có

cuống nằm phân tán hoặc thành từng đám trên hệ sợi cơ chất phân nhánh Thành

bào tử dày tạo sự khúc xạ ánh sáng mạnh Bào tử hình tròn, oval, hoặc các dạng

khác nhau, bề mặt bào tử nhẵn, có gai hoặc xù xì

- Khuẩn lạc của Micromonospora có dạng hình cầu nhỏ nhô lên trên bề

mặt môi trường Trong những ngày phát triển đầu tiên khuẩn lạc của các loài rất

giống nhau có màu da cam nhạt đến da cam Khi nuôi cấy già có thể tạo sắc tố

đặc trưng tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Khi hình

thành bào tử khuẩn lạc có màu nâu hoặc màu đen, chúng có thể khô hoặc trở

thành ướt và nhầy

Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là

không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính

chất thành tế bào kiểu II của nó

1.1.4.3 Đặc tính sinh lý, sinh hoá

- Màu và hình dạng của khuẩn lạc không được coi là những đặc tính cơ

bản, vì màu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang da cam, hồng, đỏ,

nâu và đen

- Có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 20÷40oC, nhưng không phát triển

trên 50oC

- Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ khí Hóa dị dưỡng hữu cơ,

chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác nhau

Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH dưới 6,0

- Bào tử của Micromonospora ngược lại với bào tử Streptomyces, chịu

được nhiệt độ và dung môi hữu cơ Chúng có thể tồn tại trong nước 60oC trong

90 phút, nhưng chết ở 90oC trong 15 phút Bào tử chịu được pH từ 6,0÷8,0,

thường bị mẫn cảm ở pH acid mạnh Bào tử có thể sống sót trong các dung môi

hữu cơ nồng độ không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton

1.1.4.4 Ứng dụng trên quần thể Micromonospora

Các Micromonospora có các đặc tính sinh lý, sinh hoá như phân hủy cel,

kitin, lignin, xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein, đóng vai trò vô cơ hoá

các nguyên liệu hữu cơ và trong sự mùn hoá Ngoài ra Micromonospora có khả

năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt hoá học như:

amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid [44]

+ Một số kháng sinh nhóm Amynoglycosid: Gentamycin do

M.Echinospora và M.Purpurea (Weinstein & cs, 1963; Luedemann & Brodsky,

1964); Micromonosporin do M.sp ATCC 10026 (Wagman & cs, 1974);

Sisomycin do M.Injoensis (Weinstein & cs, 1970); Neomycin B do M.sp 69-638

(Wagman & cs, 1973); Verdamycin do M.Gramisea (Weinstein & cs, 1975);

Fortimycin A & B do M Olivasterospora (Naro & cs, 1977; Kawamoto & cs, 1983)

+ Một số kháng sinh nhóm Macrolid: Megalomycin do M.Megalomicea

(Weinstein & cs, 1969); Rosamycin do M.Rosarria (Wagman & cs, 1972);

XK-41 do M.Rnositola (Kawamoto & cs, 1974); Juvenimycin do M.Chalcea &

Izumensis (Hatano & cs, 1976); M-4365 do M.Capillata (Furumai & cs, 1977);

Erythromycin B từ M sp 1225 (Marquez 1976)

+ Một số kháng sinh nhóm Ansamycin: Halomicins do M.Halophytica

(Weinstein & cs, 1968; Luedemann & cs, 1970); Rifamicin từ M.Ellipsaspora 71372

+ Một số kháng sinh nhóm Polipeptid: Chalcidin do M.Chalcea H85

(Gauze & cs, 1970)

Ngoài ra theo một số nghiên cứu khác cho thấy Micromonospora có thể

gây bệnh cho người, động vật, tuy nhiên khả năng gây bệnh cũng có hạn chế và

chưa rõ ràng mặc dù một số tác giả đã phân lập được Micromonopora từ các tổ

chức bị bệnh Ví dụ: Erikson (1935) đã tìm thấy Micromonospora Gallica từ

máu; Morquer và Comby (1943) đã ghi Micromonospora Caballi gây bệnh cho

da giống Actinomyces; Morch (1975) đã tìm thấy một chủng Micromonospora

Chalcea từ tổ chức gây bệnh trên da của chim bồ câu

1.2 Tổng quan enzyme cellulase

1.2.1 Cơ chất của enzyme cellulase

Cel là cơ chất của enzyme cellulase Cel rất phổ biến trong tự nhiên, đặc

biệt trong giới thực vật

Về phương diện vật lý, cel là một loại polysaccharide có cấu trúc phức

tạp, là thành phần chính quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật, làm

cho các mô thực vật có tính bền cơ học, tính đàn hồi và tạo thành bộ xương cho

tất cả các loài cây, không có trong tế bào động vật Ở tế bào thực vật và ở tế bào

một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi

Hình 1-2 Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật

Về phương diện hóa học, cel là thành phần homopolimer chính của sợi tự

nhiên, được cấu tạo từ các đơn vị β-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4

glucoside (Hình 1.2) Các gốc glucose trong cel thường lệch nhau một góc 1800

và có dạng như một chiếc ghế bành Mỗi phân tử cel thường chứa 1.400÷15.000

Hình 1-4 Liên kết β-1,4 glucoside trong mạch cellulose

Bằng phương pháp phân tích tia Rơnghen, người ta đã chứng minh các

phân tử cel có dạng sợi Các sợi này liên kết lại với nhau thành những bó nhỏ gọi

là các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những phần đặc

(phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình), phần lớn cel trong

thiên nhiên có cấu trúc kết tinh

Phân tử cel kéo dài thành chuỗi, nhiều chuỗi nằm song song với nhau và

các sợi cel gắn kết với nhau bằng lực hút Vander waals thông qua các liên kết

anhydro-D-glucose chứa 03 nhóm hydroxyl–OH hình thành các liên kết hydro

nội phân tử và ngoại phân tử (hình 1.3) Do đó, tất cả các sợi cel tự nhiên đều

mang bản chất ưa nước cao [32]

Hình 1-5 Liên kết hydro giữa các sợi cellulose

* Tính chất và vai trò

Cel trong tự nhiên dưới dạng sợi và không hoàn toàn nguyên chất Cel là

chất rắn, màu trắng, không mùi vị, trong tế bào thực vật thường liên kết chặt chẽ

với các thành phần khác như hemicellulose, pectin, lignin, các chất nhựa, các

muối vô cơ Không như các sợi truyền thống có một phạm vi tính chất xác định

như sợi thủy tinh, sợi aramid, sợi carbon, các sợi cellulose tự nhiên có tính chất

thay đổi không xác định thấy rõ

Bảng 1.1 Hàm lượng cellulose của các loại thực vật

(% trọng lượng khô tuyệt đối)

Kích thước, mm Loại Cellulose

(%)

Dài (trung bình)

Rộng (trung bình)

Cel là hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong nước nhưng có thể

hấp thụ nước và trương nở lên Chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nước có

nhiệt độ cao và áp suất lớn hay trong dung dịch có chứa tác nhân là acid hoặc kiềm

mạnh Việc phân hủy cel bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh

hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp

Cel bị thủy phân nhờ các enzyme thủy phân cel được gọi chung là

cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cel bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện

hiếu khí lẫn yếm khí, sự phân giải thường rất chậm và thường không triệt để Tuy

nhiên trong tự nhiên không có VSV nào có đầy đủ các hệ enzyme, vì thế để phân

hủy phức cel thì đòi hỏi có sự kết hợp nhiều VSV khác nhau Các loài VSV thay

phiên nhau phân hủy cel đến sản phẩm cuối cùng là glucose

Cel không tan trong các dung môi hữu cơ như ete, rượu Trong điều kiện

thường nó cũng khá bền đối với các dung dịch kiềm loãng, acid loãng, và các

chất oxi hóa yếu

Chúng không có ý nghĩa dinh dưỡng đối với con người và hầu hết động

vật vì không có khả năng tiêu hóa cel Tuy nhiên nhiều chủng VSV bao gồm

nấm, XK và vi khuẩn có khả năng phân hủy cel thành các sản phẩm dễ phân hủy

nhờ có khả năng tiết ra enzyme cellulase Trong dinh dưỡng, cel có ý nghĩa quan

trọng thể hiện qua các chức năng sau:

- Cải thiện chức năng ruột già và phòng ngừa ung thư ruột kết: Cel giữ vai

trò nhất định trong điều hành hệ vi khuẩn có ích ở ruột và tạo điều kiện tốt nhất

cho chức phận tổng hợp của chúng Các thức ăn có chứa hàm lượng lipid cao sẽ

làm cho vi khuẩn kỵ khí trong ruột sinh sôi nảy nở nhiều khiến cho các steroid

trung tính hoặc có tính acid, đặc biệt là acid choleic (các chất chuyển hóa acid

choleic trong phân tăng lên là chất gây ung thư) Chất xơ trong thức ăn sẽ ức chế

hoạt động của các vi khuẩn kỵ khí, thúc đẩy vi khuẩn hiếu khí sinh trưởng, làm

cho lượng hình thành acid choleic trong đại tràng giảm xuống Cellulose có tác

dụng kích thích nhu động ruột, vì thế dùng để điều hòa bài tiết

- Phòng ngừa xơ vữa động mạch: Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy cel

tạo điều kiện cản trở sự hấp thụ cholesterol (nhờ tính nhớt) và ức chế sự tổng hợp

cholesterol trong máu (nhờ sự lên men), có vai trò nhất định trong phòng ngừa xơ

vữa động mạch

- Phòng ngừa hình thành sỏi mật, giảm được hàm lượng mỡ và cholesterol

trong máu (nhờ khả năng kết hợp với acid mật), ngăn ngừa sự thừa dinh dưỡng

và béo phì

1.2.2 Phức hệ enzyme cellulase phân cắt cellulose

1.2.2.1 Cấu trúc của hệ enzyme cellulase

Cellulase là hệ enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành

sản phẩm hòa tan Phức hệ enzyme cellulase khá phức tạp bao gồm nhiều loại

enzyme khác nhau, các enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân

hoàn toàn cơ chất cellulose thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose Một mặt

chúng như enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt

chẽ) Một mặt chúng lại chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối

và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế dị hóa

Tùy theo quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ

cellulase được xếp thành các nhóm khác nhau Các nghiên cứu ban đầu chia

enzyme cellulase làm hai nhóm: nhóm enzyme C1 và Cx Trong đó, các enzyme

C1 có khả năng thủy phân sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng,

các enzyme Cx được chia thành hai loại: Exo-β-1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác

cho phản ứng cắt đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose và

Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân

liên kết bên trong phân tử cellulose Hiện nay theo các kết quả nghiên cứu, dựa

vào đặc điểm cơ chất và cơ chế phân cắt, hệ cellulase bao gồm 3 enzyme chủ yếu

sau [5, 33, 35]:

- Exo-glucanase hay C1 (EC 3.2.1.91)

- Endo-β-1,4-glucanase hay Cx (EC 3.2.1.4)

- β-glucosidase hay β-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

 Exo-glucanase gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (cello dextrinase,

EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan-cellobiohydrolase (cellobio hydrolase, EC 3.2.1.74)

tác dụng mạnh lên cel vô định hình hoặc cel đã bị phân giải một phần Tác dụng lên

cel kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng

rõ rệt Exo-glucanase thủy phân các liên kết đầu khử và đầu không khử của chuỗi

cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose

(cellobiohydrolase)

Hình 1-6 Cơ chế hoạt động của Exo-glucanase

 Endo-β-1,4-glucanase (hay endoglucanase, EC 3.2.1.4) thuộc nhóm

thủy phân liên kết ß-1,4-glucoside, tác động bên trong phân tử cel,

oligosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tương tự khác và giải phóng các

sản phẩm đơn giản hơn của quá trình thủy phân này là cellulosedextrin,

cellobiose và glucose, oligosaccharide (Chellapandi et al,2008) Do thủy phân

theo kiểu ngẫu nhiên nên endo-β-1,4-glucanase làm giảm nhanh chiều dài chuỗi

cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide có chiều dài khác nhau và tăng chậm

các nhóm khử, tác dụng mạnh lên cellodextrin Enzyme này hoạt động mạnh ở

vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cel [33, 35, 36]

Hình 1-7 Cơ chế hoạt động của Endoglucanase

 ß-glucosidase (β-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) không có khả

năng phân hủy cel nguyên thủy mà tham gia thủy phân cellobiose và các

cellodextrin (các β-D-glucose ở đầu tận cùng) để phóng thích các D-glucose,

chúng có hoạt tính cao trên cellobiase, còn cellodextrin thì hoạt tính thấp và giảm

khi chiều dài của chuỗi tăng lên Chức năng của ß-glucosidase có lẽ là điều chỉnh

sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase

Hình 1-8 Cơ chế hoạt động của β-glucosidase Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và

nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy

phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Hình 1-9 Mô hình phân hủy cellulose tinh thể 1.2.2.2 Phân loại enzyme cellulase theo hội đồng danh pháp quốc tế

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc

tế (The International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1992),

enzyme cellulase thuộc:

- Nhóm 1: Thủy phân liên kết O- và S-glycoside

- Tổ 2 (Glycosidase): Thủy phân các liên kết glycoside

- Lớp 3 (Hydrolase): Các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân

1.2.2.3 Cơ chế xúc tác của enzyme cellulase

Theo các tài liệu nghiên cứu thì cơ chế xúc tác của hệ enzyme celluase có

nhiều kiểu tác động khác nhau Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzyme

đến nghiên cứu tác động hiệp đồng của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều tác giả

đều đưa ra kết luận chung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau thuỷ

phân cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, hiện nay

trật tự phản ứng của các enzyme vẫn chưa có sự thống nhất và có nhiều tác giả đã

trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau

Năm 1950, Resse lần đầu tiên đưa ra cơ chế thủy phân cellulose hòa tan

nhờ phức hệ enzyme C1 và Cx [30] Năm 1964, các kết quả nghiên cứu khác của

Resse và Mandels cho thấy C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có

tác dụng làm trương, tạo thành các chuỗi cel mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn

công bởi Cx tạo thành cellobioise, chất này bị β-glucosidase phân cắt tạo thành

glucose theo sơ đồ sau:

Cellulose tự nhiên Cellulose phản ứng Đường hòa tan Glucose

Theo V.R.Snin–Ivasan (1973) cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase

lên cel được trình bày theo hình 1-10 sau:

Hình 1-10 Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose

theo V.R.Snin - Ivasan (1973) Theo hầu hết các kết quả nghiên cứu hiện nay thì để enzyme cellulase xúc

tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng thành glucose hòa tan

thì cần có sự hiệp đồng của các dạng enzyme trong phức hệ cellulase Mỗi dạng

enzyme trong phức hệ celulase sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucoside

Hình 1-11 Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase

Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của hệ enzyme cellulase xảy ra theo

3 giai đoạn chủ yếu sau:

- Trong giai đoạn thứ nhất: Endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các

liên kết 1,4-β-glucancủa sợi cellulose tinh thể để tạo thành cel biến đổi cấu trúc

(đầu mạch tự do) nhưng vẫn chưa hòa tan

- Trong giai đoạn thứ hai: Cel bị biến đổi cấu trúc sẽ tiếp tục bị thủy

phân dưới tác động của hệ enzyme Enzyme này gồm nhiều loại khác nhau

nhưng thường được chia thành 2 nhóm:

 Exo-glucanase xúc tác việc tách ra một cách tuần tự cho các gốc

glucose ở đầu khử và không khử của chuỗi cel và cắt từng đoạn cellobiose

 Endo-1,4-glucanase tiếp tục xúc tác việc phân giải liên kết

β-glucoside ở bất kỳ chỗ nào bên trong phân tử cel, tạo ra các đầu mạch tự do Kết

quả tạo ra các oligosacharide mạch ngắn, cellobiose và glucose Các cellobiase sẽ

thủy phân tiếp tạo thành glucose

- Trong giai đoạn cuối cùng: Dưới tác dụng của enzyme ß-glucosidase

(EC 3.2.1.21), cellobiose bị thủy phân thành glucose Đây là enzyme rất đặc hiệu

thủy phân cellobiose thành glucose mà không tấn công cel hay cellodextrin bậc

cao

Cơ chế trình bày trên cũng phù hợp với nghiên cứu Lee et al, 2002 (Hình

1-12) Ban đầu endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ bộ các liên kết 1,4-β-glucan

của sợi cel để tạo thành các phân tử nhỏ hơn (sợi cellobiose) Sau đó các sợ này

sẽ chịu tác động của exoglucanase ở đầu khử và đầu không khử để giải phóng ra

glucose [36] Kết quả nghiên cứu theo cơ chế này được trình bày theo hình sau:

Hình 1-12 Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B)

của cellulase

Như vậy việc thủy phân cel hay nói đúng hơn là thủy phân các

polysaccharide của thực vật không chỉ một hoặc hai enzyme là đủ mà cần tới một

hệ enzyme

1.2.2.4 Nguồn thu cellulase

Các enzyme có nhiều điểm khác nhau về đặc tính, cơ chế tác dụng và điều

kiện hoạt động Vì vậy mà tuỳ thuộc vào loại sản phẩm, các giai đoạn khác nhau

của quá trình sản xuất mà người ta chọn nguồn thu nhận thích hợp Enzyme

cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau:

- Động vật: Thuộc nhóm thân mềm, lợn, gà

- Thực vật: Mầm của các hạt ngũ cốc như đại mạch, yến mạch, lúa mì

- Vi sinh vật: Các loại xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi [13, 29,34]

Trong VSV, số lượng các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong

điều kiện tự nhiên (yếm khí và hiếu khí) rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi,

XK, vi khuẩn và trong một số trường hợp các nhà khoa học còn thấy cả nấm men

cũng tham gia quá trình phân giải này Chúng thường bị ảnh hưởng bởi tác động

nhiều mặt của nhiều yếu tố nên có loài phát triển rất mạnh, có loài phát triển yếu

Chính vì thế, việc phân hủy cel trong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ,

xảy ra rất chậm

Enzyme có hoạt tính xúc tác rất cao, gấp 108÷1011 lần so với các chất xúc

tác thông thường Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì VSV được xem là

nguồn cung cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật, khả năng to lớn và có tính

chất độc đáo vượt xa so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật Vì thế,

chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme [22]

- Trước hết, hệ VSV trong tự nhiên vô cùng phong phú, là nguồn nguyên

liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn Nguồn thức ăn để nuôi VSV lại

dễ kiếm và rẻ tiền Đa số VSV cho enzyme thường có khả năng phát triển trên

môi trường đơn giản rẻ tiền như phế phụ liệu, phế phẩm của các ngành sản xuất

- Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16÷100 giờ) VSV sinh

trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước

bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn, có thể tổng hợp cùng lúc

nhiều loại enzyme khác nhau nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ

dàng, hiệu suất thu hồi cao

- Hơn nữa, enzyme từ VSV có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật

khác Do vậy chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hoá một lượng

lớn cơ chất Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối VSV làm

nguồn enzyme

- VSV rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh

dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác Do đó có thể

thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho hàm lượng enzyme

đáng kể với hoạt tính xúc tác cao, rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công

nghiệp Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzyme theo ý muốn, dễ

dàng thu nhận được enzyme có độ thuần khiết cao Với VSV, người ta có thể

điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên các đối tượng khác để tăng

lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học, đặc biệt trong lĩnh

vực sinh học nói chung và công nghệ sinh học nói riêng, cùng với nhu cầu

enzyme trong các ngành công nghiệp ngày càng cao, phương pháp sinh tổng hợp

enzyme ngày càng được áp dụng rộng rãi và có hiệu quả trong nhiều nước trên thế

giới Có thể nói rằng Cellulase từ VSV là một trong những enzyme có khả năng

ứng dụng rộng rãi trong tương lai

1.2.2.5 Tính chất của enzyme cellulase

Enzyme cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau nên có tính

chất khác nhau

* Tính đặc hiệu

- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ tác dụng lên

một cơ chất nhất định Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong

phân tử cellulose và các ß-D-glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên

các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase

thủy phân các gốc ß-D-glucose tạo nên phân tử D-glucose [20]

* Đặc tính vật lý và hóa học

- Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hòa tan và

thành phần acid amin giống nhau Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác

nhau Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng

40÷600C, pH nằm trong khoảng 4,0÷7,0 [4, 15, 40] Kluepfel và Ishaque (1980) đã

tuyển chọn được một chủng trong giống Streptomyces khi lên men trên môi

trường giấy lọc hoặc vi tinh thể tạo enzyme β-1,4-glucanase Enzyme này có khả

năng thủy phân Na-CMC tốt nhất ở điều kiện pH 7,0 và nhiệt độ 500C Cellulase

của một chủng giống thuộc Thermomonosprora cũng biểu hiện thuộc tính khá

mạnh trong môi trường chứa Na-CMC và vi tinh thể Enzyme này hoạt động tốt

ở pH 5,9 và nhiệt độ 650C, đồng thời cũng bị ức chế bởi celobiose và glucose

Tuy vậy chủng đột biến của nó thì hoàn toàn không bị khống chế

- Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10÷15 phút ở 800C

* Các chất ức chế

- Enzyme Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó

như glucose, cellobiose Thủy ngân (Hg) ức chế hoàn toàn cellulase, trong khi

các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ [20]

1.2.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng

hợp enzyme cellulase

VSV cũng giống như các sinh vật khác chịu ảnh hưởng bởi tác động của

môi trường, do cấu tạo đơn giản nên chúng rất mẫn cảm đối với những thay đổi

dù nhỏ nhất của môi trường xung quanh Trong quá trình sinh trưởng và phát

triển, tế bào VSV tiến hành trao đổi không ngừng với môi trường xung quanh Tế

bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm

trao đổi qua toàn bộ bề mặt cho nên cường độ trao đổi chất rất lớn Các chất dinh

dưỡng vào tế bào qua màng và được chuyển hóa tạo thành những chất riêng biệt

cần thiết cho quá trình xây dựng tế bào Nhờ quá trình đồng hóa các tế bào mới

có thể sinh trưởng phát triển và không ngừng tăng sinh khối, đồng thời sản sinh

ra các sản phẩm trao đổi chất

Riêng với XK là loài sinh vật sống dị dưỡng phân giải nguồn cơ chất trong

môi trường nơi chúng sống dựa vào hệ enzyme ngoại bào do chúng tiết ra để sinh

trưởng và phát triển Tốc độ và số lượng enzyme tiết ra phụ thuộc rất nhiều vào

các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, nguồn carbon và nguồn nitrogen Do

vậy, tùy theo mục đích nghiên cứu, tùy chủng loại vi sinh vật mà chọn môi

trường dinh dưỡng thích hợp, hoặc tạo cho môi trường có thành phần dinh dưỡng

để chúng phát triển cực đại và thu được nhiều sản phẩm nhất

1.2.3.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

a Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sống của tế bào, sự sinh sản

và sự trao đổi chất của VSV VSV có thể phát triển ở tất cả các vùng nhiệt độ

khác nhau, mỗi loài VSV thích nghi với một vùng nhiệt độ khác nhau Phần lớn

VSV chịu tác động của nhiệt độ trong khoảng từ -10 đến +900C Trong phạm vi

này, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, nhu cầu dinh dưỡng, cả đến

thành phần enzyme và thành phần hóa học của tế bào (Bảng 1.2: Kiều Hữu Ánh

& Ngô Tự Thành, 1985) Theo Nguyễn Đức Lượng & Nguyễn Thị Thùy Dương

(2003), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của VSV, các

nhà khoa học chia chúng ra thành các nhóm khác nhau Tuy nhiên, sự phân chia

các nhóm VSV quan hệ với nhiệt độ chỉ có tính chất tương đối, các nhóm này

không tách biệt nhau rõ ràng mà gắn liền với nhau qua các dạng trung gian

Bảng 1.2 Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau

+10 đến +20 +30 đến +40 +50 đến +65

+20 đến +30 +40 đến +50 +75 đến +90

Nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình trên đối tượng Streptomyces

Thermovulagaris B 6 cho thấy nhiệt độ tối thích cho nuôi cấy là 55oC Ở nhiệt độ

này, Cellulase cho hoạt tính cao nhất với đường kính vòng thủy phân 3,2cm [3]

b Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu

pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đối với sinh trưởng và khả năng

sinh tổng hợp enzyme của VSV Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động lớn nhất

trong tất cả các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác

động mạnh mẽ Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp cho việc

sinh tổng hợp enzyme pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, trung tính hay

kiềm Việc xác định pH môi trường ban đầu thích hợp và duy trì pH ổn định

trong suốt quá trình sinh trưởng của tế bào rất quan trọng

c Độ thông khí

XK là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là

ở giai đoạn nhân giống Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung

vào môi trường lên men benzilthioxyanat hay nuôi cấy ở chế độ lắc làm tăng khả

năng oxy hòa tan

d Tuổi giống và lượng giống

Việc tổng hợp enzyme không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn

phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tùy vào mục đích mà

bổ sung tuổi giống và lượng giống cho phù hợp Lượng giống được cấy truyền vào

ban đầu khoảng từ 2÷10% với tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho

hiệu suất enzyme cao nhất thường sau 24 giờ tuổi, với XK là loài sinh trưởng và phát

triển chậm thời gian có thể lâu hơn [8]

Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp

các loại enzyme của các VSV còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như:

thời gian nuôi cấy, tốc độ khuấy đảo và sục khí, các thành phần của môi trường

nuôi cấy, phương pháp nuôi cấy

1.2.3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

a Ảnh hưởng nguồn carbon

Carbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzyme, acid

nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy những hợp chất chứa carbon

có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của VSV Tùy đặc điểm sinh lý của từng loài

VSV mà nguồn carbon được sử dụng để sinh enzyme cellulase là khác nhau, có

loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loại thích hợp với

nhiều nguồn carbon Hầu như không có hợp chất carbon nào mà không bị nhóm

VSV này hoặc nhóm VSV khác phân giải [22]

Do cellulase là enzyme cảm ứng, đòi hỏi cơ chất là cel nên chúng có ảnh

hưởng rõ rệt đến quá trình sinh tổng hợp cellulase Nguồn cung cấp carbon có thể

là các loại carbonhydrat đơn giản như đường đơn, đường đôi, hoặc phức tạp hơn

như tinh bột, cel Nguồn carbon phức tạp này thường tồn tại ở hầu hết các sản

phẩm thô, ít tinh khiết như các phế phẩm trấu cám, bã mía, lõi ngô, mạt cưa, giấy

lọc, bã củ cải đường Nhiều chất hữu cơ này vì không tan được trong nước hoặc

vì có khối lượng phân tử quá lớn cho nên trước khi được hấp thụ, VSV phải tiết

ra enzyme cellulase để thủy phân, chuyển hóa chúng thành các hợp chất dễ hấp

thụ (đường, amino acid, acid béo) Một số công trình nghiên cứu đã cho thấy

cellulase là một enzyme cảm ứng thì với một số nguồn carbon như glucose,

sacarose, axetat, succinat lại chính là tác nhân ức chế quá trình tổng hợp enzyme

này

Theo Stutzenberger và cộng sự (1971) cho biết trong các VSV phân giải

cel được phân lập từ phân rác ủ thì chiếm ưu thế là loài XK ưa nhiệt

Thermonospora curvata phát triển nhanh chóng ở nhiệt độ 50÷60oC và tích lũy

khá nhiều enzyme phân giải cel trên môi trường nuôi cấy chứa cel vi tinh thể

và cao nấm men Nếu bổ sung vào môi trường có bông nghiền nhỏ có khả năng

làm tăng việc tích lũy enzyme C1 và Cx

Theo Toyama (1975) thì với cơ chất là cám gạo, thành phần kích thích

sinh tổng hợp cellulase không phải là phần bột mịn giàu chất dinh dưỡng mà là

phần thô giàu chất xơ

Theo nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình và Nguyễn Thành Đạt (1991)

cũng đã phân lập được hàng trăm chủng XK ưa nhiệt và đã chọn được chủng

Streptomyce Thermovulgaris B 6 có khả năng sinh cellulase trên các nguồn carbon

như cel vi tinh thể Na-CMC, bông và giấy lọc [3] Các nghiên cứu trên các nguồn

cơ chất riêng lẻ là cám gạo, vỏ lạc, lõi ngô và rơm đều tạo cellulase với hoạt tính

khác nhau Nhưng khi phối trộn giữa các nguồn carbon theo tỷ lệ thích hợp thì

hoạt tính cellulase thu được cao hơn thể hiện ở độ giảm trọng lượng cel qua quá

trình nuôi cấy

Qua nghiên cứu, các tác giả đều nhận thấy các nguồn carbon bổ sung vào

môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng

hợp enzyme cellulase Theo thời gian, nguồn carbon sử dụng trong nuôi cấy

nghiên cứu sự tổng hợp enzyme cellulase cũng thay đổi Thời gian đầu, các tác

giả chủ yếu sử dụng các nguồn carbon tinh khiết và bổ sung riêng lẻ từng nguồn

carbon vào môi trường nuôi cấy Nhưng gần đây các nghiên cứu hướng đến kết

hợp bổ sung nhiều nguồn carbon tinh khiết vào cùng môi trường nuôi cấy và

hướng tới sử dụng các phế phụ liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm

nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzyme cellulase

b Ảnh hưởng nguồn Nitrogen

VSV cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ để tạo thành các nhóm

amin (-NH2) và các nhóm imin (=NH) trong quá trình sống, xây dựng tế bào, vì

tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều chứa nitơ (protein, acid nucleotic,

enzyme…) Trong tất cả môi trường nuôi cấy cần thiết phải có các loại hợp chất

nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hóa được Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết để

đảm bảo được hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế trong sản xuất

vi sinh vật [22] Tốc độ tiết enzyme của các loài VSV không những phụ thuộc

vào nguồn N mà còn phụ thuộc vào tỷ số C/N trong môi trường Tỷ số này rất có

ý nghĩa, nó tạo cho VSV có khả năng trao đổi chất thích hợp, khả năng tích tụ

cao các sản phẩm sinh tổng hợp và tạo thành các enzyme để tiến hành các phản

ứng sinh hóa theo hướng có lợi [22] Tùy loại VSV mà sử dụng nguồn nitrogen

khác nhau Có nhiều hợp chất Nitơ ứng dụng vào sản xuất nhưng có những loại

cho hiệu suất lên men cao nhất Nguồn Nitơ dễ hấp thụ đối với VSV là NO3

và

NH4

+

Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với XK: NH4OH,

(NH4)2HPO4, (NH4)3PO4, (NH4)2CO3, NH4NO3 hay khí NH3; các hợp chất amon:

Citrat amonium, Acetat amonium, Tactrat amonium, Oxalat ammonium và ở các

dạng hợp chất hữu cơ cao phân tử như cao thịt, bột đậu tương, bột cá, pepton Đa

số các loài có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ, tuy nhiên

mức độ đồng hóa từng loại nitrogen để sinh enzyme lại phụ thuộc vào từng loài

Tất cả các loại vsv đều có thể đồng hóa được muối amon Việc sử dụng nguồn

hữu cơ, urê, muối amon đều gắn liền với việc tách NH3 ra rồi hấp thụ vào tế bào

Như vậy NH3 là trung tâm của các con đường dinh dưỡng Nitrogen của vsv

Trong công nghiệp người ta thường dùng NH3 dưới dạng nước, khí hoặc urê Khi

dùng urê cần quan tâm tới nồng độ ban đầu vì khả năng chịu đựng urê của mỗi

giống mỗi khác

Nghiên cứu của Vũ Thị Thanh Bình trên đối tượng Streptomyces

Thermovulagaris B 6 khi nuôi cấy trên tỷ lệ cám gạo:vỏ lạc theo tỷ lệ 1:1 ở các trị

số khác nhau, sau 4 ngày nuôi cấy ở pH 7,0 chủng này sản sinh Cellulase có hoạt

tính mạnh nhất, thấp hơn là ở các pH 8, 9, 6 và thấp nhất là ở pH 5,0 Kết quả

này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hensen (1957) trên loài

Streptomyces Thermovulagaris [3]

c Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng khoáng

Phosphorus (P) đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi chất và năng

lượng trong tế bào VSV, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của

tế bào vi sinh vật, có mặt trong cấu tạo của nhiều thành phần quan trọng của tế

bào (acid nucleic, phosphoprotein, ADP, ATP) Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng

P, muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphate amon và phosphat kali

có tác dụng cung cấp P và tạo ra tính đệm của môi trường

Vitamin và các nguyên tố vi lượng khác như: S, Mg, Na, Fe, Ca, Zn, Cl, K

mà VSV lấy từ môi trường dinh dưỡng là những chất cần thiết cho hoạt động

sống của VSV Chúng thường được sử dụng với lượng nhỏ nhưng tác dụng rất

lớn và đa dạng, không thể thiếu được đối với hoạt động sống bình thường của

VSV Khi sử dụng môi trường thiên nhiên để nuối cấy VSV thường không cần

thiết bổ sung các nguyên tố vi lượng này, vì trong nguyên liệu pha chế môi

trường này (khoai tây, nước thịt, pepton) thường có đủ Đối với môi trường tổng

hợp (dùng nguyên liệu hóa chất) thì bắt buộc phải bổ sung các nguyên tốt vi

lượng cần thiết

1.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase

1.3.1 Lược sử nghiên cứu cellulase trên thế giới và trong nước

Cellulase đã được bắt đầu nghiên cứu trên thế giới từ những năm 1950 với

nhiều khía cạnh rất đa dạng Cuối thế kỷ XIX đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu

về khả năng sinh tổng hợp cảm ứng cellulase trên nhiều đối tượng VSV khác

nhau

Một số nghiên cứu về cellulase từ nấm của một sồ tác giả như :

Trichodermareseii (Ogawa & cs, 1991), Aspergillus sp (Lusta & cs, 1999),