Công nghệ chế biến carotenoid

Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành

M ỤC LỤC

Mục lục 1

Danh mục bảng 2

Danh mục hình 3

Lời mở đầu 4

I Giới thiệu về Carotenoid 5

1.1 Phân bố 5

1.2 Phân loại 6

II Nguyên liệu 6

2.1 Thành phần nguyên liệu 6

2.2 Mô tả nguyên liệu 6

III Giống vi sinh vật 9

3.1 Giới thiệu giống vi sinh vật 9

3.2 Hình thái 10

3.3 Sinh lý 11

3.4 Sinh sản 11

3.5 Tiêu chí chọn giống 12

IV Quy trình công nghệ 12

4.1 Sơ đồ khối 12

4.2 Thuyết minh quy trình 12

4.2.1 Chuẩn bị môi trường 12

4.2.2 Tiệt trùng 14

4.2.3 Hoạt hóa giống, nhân giống 15

4.2.4 Lên men 15

4.2.5 Ly tâm tách sinh khối 18

4.2.6 Đồng hóa 20

4.2.7 Trích ly 21

4.2.8 Lọc 22

4.2.9 Cô đặc chân không 23

4.2.10 Sấy phun 23

V Chỉ tiêu 25

5.1 Vật lý 25

5.1.1 Dạng tồn tại 25

5.1.2 Tính hấp thu ánh sáng 25

5.1.3 Nhiệt độ nóng chảy 26

5.1.4 Tính tan 26

5.1.5 Màu sắc 26

5.2 Hóa lý 26

5.3 Sinh học 26

5.3.1 Vai trò 27

5.3.2 Tính miễn dịch 27

5.3.3 Tác dụng chống sự lão hóa 27

VI Thành tựu 27

VII Tài liệu tham khảo 29

- 2 -

Danh m ục bảng

Bảng 1: Sự phân bố và đặc điểm của carotenoid ở các sinh vật 5

Bảng 2: Thành phần hóa học chính trong mật rỉ đường mía (tính theo % chất khô) 6

Bảng 3: Thành phần tro trong mật rỉ (tính theo % khối lượng của tro) 6

Bảng 4: Thành phần vitamin trong mật rỉ (tính theo μg/g rỉ đường) 6

Bảng 5: Thành phần chất chiết men 7

Bảng 6: Thành phần chất chiết malt 7

Bảng 7: Thành phần của KH2PO4 thương phẩm 8

Bảng 8: Thành phần hóa học của K2HPO4 8

Bảng 9: Thành phần của (NH4)2SO4 9

Bảng 10: Một vài loài sinh tổng hợp chất màu carotenoid 10

Bảng 11: Thành phần các chất màu carotenoid được tổng hợp bởi các chủng Rhodotorula 18

Bảng 12: Khả năng hấp thụ ánh sáng của một số carotenoid 25

Bảng 13: Khả năng tạo chất màu carotenoid bởi Rhodotorula rubra GED8 và chủng đột biến Rhodotorula rubra 56 – 13 trong môi trường glucose và lactose 28

Danh m ục hình

Hình 1: Tảo 5

Hình 2: Cà chua 5

Hình 3: Rhodotorula sp 9

Hình 4: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC - 20 14

Hình 5: Thiết bị lên men có bộ đảo trộn dạng sủi bọt 16

Hình 6: Con đường sinh tổng hợp carotenoid 17

Hình 7: Máy ly tâm siêu tốc loại ống 19

Hình 8: Thiết bị đồng hóa 20

Hình 9: Thiết bị trích ly liên tục dạng trục vis 21

Hình 10: Sơ đồ thiết bị lọc chân không dạng thùng quay tác động liên tục 22

Hình 11: Thiết bị cô đặc một nồi 23

Hình 12: Sơ đồ hệ thống sấy phun 24

Hình 13: Thiết bị sấy phun 25

Hình 14: Chuyển hóa β-carotene thành vitamin A 27

- 4 -

Lời mở đầu

Xã hội ngày càng phát triển kéo theo sự phát triển của các ngành khoa học kĩ thuật Công nghệ sinh học đã và đang trở thành một trong nhữnh ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, năng lượng khai thác khoáng và môi trường…

Đối với Việt Nam, một đất nước nông nghiệp thì việc ứng dụng, xử lý và tái chế các nguồn phế phụ phẩm từ động vật và thực vật trong các ngành sản xuất nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm để làm biến đổi những nguồn nguyên liệu rẻ tiền này tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường mang lại hiệu quả kinh tế cho xã hội đang ngày càng được ưu tiên

Hằng ngày cơ thể chúng ta hấp thu rất nhiều loại chất dinh dưỡng khác nhau Bên cạnh

những dưỡng chất quan trọng như nước, protein, lipit, carbonhydrate, cơ thể chúng ta cũng cần được cung cấp một lượng khống, vitamin cho cơ thể phát triển cân đối Trong đĩ chúng ta đặc

biệt quan tâm tới thành phần vitamin trong thực phẩm được sử dụng Và một trong những nhĩm vitamin khơng thể thiếu trong các bữa ăn hằng ngày cĩ thể kể đến là vitamin A Vitamin A có vai trò rất quan trọng đối với sự sống của con người nói chung và giới động vật nói riêng Nguồn nguyên liệu thực vật và vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid (nguồn gốc tạo tiền chất cho quá trình tổng hợp vitamin A) Và một trong rất ít

giống nấm men có khả năng tổng hợp được sắc tố carotenoid là Rhodotorula sp

Đã có nhiều công trình ngiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên các nguồn cơ chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián

đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men bán rắn…chỉ từ giống Rhodoturula sp hay nuôi

cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…Những nghiên

cứu này hiện nay cũng đang được ứng dụng khá nhiều trong cơng nghiệp và khơng ngừng phát triển trong tương lai…

I GI ỚI THIỆU VỀ CAROTENOID

Carotenoids là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo có trong lục lạp, trong quả và rau màu có màu da cam, màu vàng và màu đỏ Cĩ khoảng hơn 600 loại Carotenoid tồn tại trong tự nhiên Chúng rất phổ biến và được tạo ra rất nhiều trong tự nhiên Người ta ước tính rằng hàng năm có trên 100 triệu tấn caroteoid được sản sinh ra trong tự nhiên Phần lớn lượng này

ở dạng fucoxanthin (trong tảo), và trong 3 carotenoid chính của lá cây là lutein, violaxanthin và neoxanthin Còn lại tuy chiếm lượng nhỏ hơn nhưng hiện diện khắp nơi là β-carotene và zeaxanthin Những sắc tố khác là lycopene (cà chua), capsanthin (tiêu đỏ), bixin (điều)

Hình 1: Tảo Hình 2: Cà chua 1.1 Phân bố:

Bảng 1: Sự phân bố và đặc điểm của carotenoid ở các sinh vật

Thực vật

 Carotenoid thường tồn tại ở phần diệp lục của mô xanh, màu của chúng bị che lấp bởi màu của chorophyll

 Hàm luợng carotenoid hầu như giống nhau ở các loài lá cây:

β-carotene (25-30%), lutein (khoảng 45%), violaxanthin (15%), neoxanthin (15%) trên tổng số khối lượng carotenoid Ngoài ra còn có một lượng nhỏ α-carotene, α và β-cryptoxanthin, zeaxanthin, atheraxanthin, lutein – 5, 6 – epoxdide

Carotenoid cũng phân bố trong các mô thường (không có phản ứng quang hợp) tạo ra màu vàng, cam, đỏ cho hoa quả như cà chua, cà

Động vật

 Carotenoid tạo màu vàng, đỏ cho lông cánh các loài chim;

tạo màu lông và da vàng cho gà con, tạo màu đỏ cho lòng đỏ trứng

 Trong một số động vật biển như tôm hùm, cua… tồn tại một dạng phức hợp giữa carotenoid và protein gọi là carotenoprotein lúc còn sống có màu xanh lá, tím hoặc xanh dương; nhưng khi nấu chín

protein bị biến tính màu đỏ của carotenoid mới hiện ra

Vi sinh vật

 Carotenoid là chất màu nội bào của một số các loài vi sinh

vật như: vi khuẩn (Brevibacterium tạo canthaxanthin, Flavobacterium tạo zeaxanthin), nấm men (Rhodotorula sp.), nấm mốc (Neurospora Crassa, Mucorals choanophoracea), tảo

(Dunadiella)

- 6 -

1.2 Phân loại

Carotenoids được cấu tạo từ 8 đơn vị isoprene liên tiếp nhau ở trung tâm của phân tử tạo nên cấu trúc đối xứng, có thể chia làm hai nhóm chính:

- Carotenes : gồm các hydrocarbon carotenoid (C40H56)

- Xanhthophylls: gồm các dẫn xuất có nhóm chứa chứa oxy như keto, epoxy,

methoxy, acid của carotenoid (C40H56O2)

II NGUYÊN LIỆU

2.1 Thành phần nguyên liệu

Nguồn cacbon sử dụng là mật rỉ đường, cĩ hàm lượng chất khơ 75 -83 % khối lượng, pH = 4.5-6

Bảng2: Thành phần hĩa học chính trong mật rỉ đường mía (tính theo % chất khơ)

Olbrich (1963), p.540, Chen and Chou (1993), p 408

Ngoài ra, ra trong mật rỉ còn có chứa một số vitamin

Bảng 4: Thành phần vitamin trong mật rỉ (tính theo μg/g rỉ đường)

Folic acid 0.038

Mật rỉ trước khi dùng pha chế mơi trường phải được xử lý để phá hệ keo và màu sẫm của

mật rỉ Hệ keo của mật rỉ do protein và pectin hình thành Hệ keo thường tạo độ nhớt cao và làm

cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men Nếu hệ keo khơng được phá đi sẽ gây hiện tượng thối hĩa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, sinh khối nấm men thu nhận sẽ bám đầy vào các chất keo này dẫn đến khĩ làm sạch sản phẩm Keo càng nhiều, khả năng hịa tan của oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém Màu sẫm bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men cĩ màu vàng thẫm, khơng phải màu tự nhiên của nấm Ngồi ra rỉ đường cũng là mơi trường dinh dưỡng khá lý tưởng cho vi sinh vật xâm nhập và phát triển

Để xử lý hệ keo và màu sẫm của mật rỉ, người ta sử dụng 3.5kg acid sunfuric đậm đặc cho một tấn mật rỉ Khi cho H2SO4 vào mật rỉ, cĩ ba cách thực hiện quá trình xử lý này

Cách thứ nhất: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều ở nhiệt độ thường trong 24h, sau đĩ ly tâm thu dịch đường

Cách thứ hai: Khi cho 3.5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun tồn bộ lên 850

C và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đĩ ly tâm thu dịch đường

Cách thứ ba: cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt giá trị 4, người ta đun nĩng đến 120 –

1250C trong một phút để các chất vơ cơ kết tủa, đĩ ly tâm thu dịch đường

Dịch đường sau khi xử lý được pha chế thành mơi trường cĩ nồng độ phù hợp cho quá trình lên men thu sinh khối

 Chất chiết nấm men

Bảng5: Thành phần chất chiết men

Kim loại nặng (như Pb), % KL chất khơ 0.001

Kim loại nặng (Pb) , % KL chất khơ 0.005

III GIỐNG VI SINH VẬT

Hình 3: Rhodotorula sp

3.1 Giới thiệu giống vi sinh vật

- Theo phân loại Harison(1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc:

• Giới: Nấm(fungi)

• Ngành: Basidiomycota

• Lớp: Urediniomycetes

- Rhodotorula thuộc cơ thể đơn bào, không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ti hay sợi khuẩn ti giả

- Rhodotorula là nhóm sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20-400C

- Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây như táo, dưa hấu, dâu tây…

- Kích thước khuẩn lạc tùy môi trường, có thể đạt từ 1-10mm

- Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, thường nảy chồi ở đỉnh, không hình thành bào tử túi

- Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men cĩ thể thay đổi như sau:

• Ơû nấm men trẻ (qua 12 - 16h nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỉ lệ cao

• Ơû nấm men trưởng thành (qua 24 – 48h nuôi cấy): kích thước điển hình, không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỉ lệ cao

Ơû nấm men già( đã nuôi cấy từ 72h trở lên): màng dày nhẵn, tế bào chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết chiếm tỉ lệ lớn

Bảng 10: Một vài lồi sinh tổng hợp chất màu carote noid

Rh Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia, đất

Rh Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy

cầu,elip

Rh Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại

Rh Lactosa Vàng, hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí

Rh Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển

Rh

Mucilaginosa(rubra) Kem, hồng hoặc đỏ Dài Nước, không khí…

Rh Muscorum Kem hoặc nâu nhạt Gậy

Rh Pallida Kem hoặc hồng Tròn cầu Nước biển, dưa leo

ngâm

Rh Pilimanae Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Nước, đất

3.3 Sinh lý

- Không lên men các loại đường như: D-Glucose, D-Galactose, Maltose, Saccharose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào

- Tạo ra enzyme urease

- Đồng hóa DBB (Diazonium Blue B)

- Có chứa sắc tố Carotenoid

- Không tạo ra acid acetic

- Không đồng hóa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula sp khác với các giống nấm men Cryptococcus, Candida

- Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid

Tóm tắt

- Cơ chất giống tinh bột: -

3.4.1 Sinh sản bằng hình thức nảy chồi

• Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa

• Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con

• Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập

⇒ Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất ở nấm men

3.4.2 Sinh sản bằng hình thức phân đôi

• Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và tạo thành 2 tế bào con độc lập

• Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm 4 giai đoạn:

Giai đoạn thích nghi

Giai đoạn phát triển

Giai đoạn ổn định

Giai đoạn diệt vong

3.5 Tiêu chí chọn giống

• Khơng cĩ khả năng sinh tổng hợp độc tố

• Khả năng sinh tổng hợp hợp chất màu carotenoid cao

• Cĩ khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng cao

• Điều kiện nuơi cấy rẻ tiền, đơn giản

IV QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ

4.1 Sơ đồ khối

S ấy phun

S ản phẩm

4.2 Thuyết minh quy trình

4.2.1 Chuẩn bị môi trường

pH của môi trường: 5.5

Mơi trường được khuấy đều trong thùng phối trộn với tốc độ 120 – 200 rpm

4.2.2 Tiệt trùng

Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men

Môi trường sau khi được trộn đưa vào thiết bị tiệt trùng liên tục YHC - 20 để tiêu diệt hệ vi sinh vật có sẵn trong môi trường Hệ vi sinh vật này có thể có hoạt động cạnh tranh với nấm men chính qui trình sản xuẩt

Biến đổi nguyên liệu :

Sinh học : hệ vi sinh vật có trong môi trường bị tiêu diệt

Thiết bị : thiết bị tiệt trùng liên tục YHC - 20

Hình 4: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC - 20

- 14 -

Trong công nghiệp, để tiệt trùng các môi trường lỏng, người ta thường sử dụng các thiết bị

tiệt trùng dạng YHC-5, YHC-20, YHC-50 với năng suất tương ứng 5, 20, 50 m3/h

Cấu tạo thiết bị: thùng chứa, bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, làm nguội, các bơm, hệ thống kiểm tra tự động và điều chỉnh các thông số của quá trình

Thùng chứa: là thiết bị hình trụ có nắp Trên nắp có bộ dẫn động cho cơ cấu khuấy trộn và

các khớp nối cần thiết

Bộ đun nóng gồm: vỏ trụ đứng, nắp và hai vòi phun và có các khớp nối để nạp môi trường

dinh dưỡng, hơi nước được lắp trên vỏ thiết bị Giữa các phần trên và dưới thiết bị có côn để nạp

lớp mỏng, đều của môi trường đã được đun nóng vào bộ giữ nhiệt

Bộ giữ nhiệt: là một ống xoắn gồm nhiều ống tiện lợi cho bảo quản dài hạn trong trường hợp

cần thiết cho sản xuất

Thiết bị làm mát: được sử dụng để làm lạnh môi trường dinh dưỡng tiệt trùng đến 400C và thường được sử dụng bộ trao đổi nhiệt kiểu “ống lồng ống”

Nguyên tắc làm việc của thiết bị là đun nóng nhanh môi trường đến nhiệt độ tiệt trùng 120

÷140

0

C khi cho tiếp xúc trực tiếp với hơi nước, được giữ trong bộ giữ nhiệt khoảng 15 phút và sau đó làm lạnh nhanh đến 28-320C Trước khi bắt đầu tiệt trùng môi trường dinh dưỡng tất cả các bộ phận của thiết bị (bộ đun nóng, bộ giữ nhiệt, bộ trao đổi nhiệt, bộ lấy mẫu và hệ thống

đường ống) phải được tiệt trùng bằng hơi trong 4 giờ Sau khi triệt trùng thiết bị tiến hành mở

các dụng cụ kiểm tra tự động và dụng cụ điều chỉnh các thông số của quá trình, đặt chế độ tiệt

trùng môi trường Nối thiết bị tiệt trùng YHC – 20 với nồi lên men đã nạp sơ bộ không khí tiệt trùng với áp suất 76 ÷ 96 kPa

Để tránh sự xuất hiện không khí trong đường ống nối nồi phản ứng với YHC thường có van ngược chiều để điều chỉnh áp suất

Quá trình tiệt trùng môi trường dinh dưỡng được thực hiện một cách tự động theo chế độ đã cho nhờ các dụng cụ điều chỉnh (dụng cụ kiểm tra mức môi trường trong thùng chứa, kiểm tra

tốc độ nạp môi trường vào bộ giữ nhiệt, kiểm tra áp suất môi trường do bơm đẩy và áp suất môi trường khi ra khỏi bộ giữ nhiệt, kiểm tra áp suất hơi cho van điều chỉnh của thiết bị) Nhiệt độ

môi trường trong bộ đun nóng và áp suất của môi trường khi ra khỏi bộ giữ nhiệt là những thông

Môi trường nhân giống nấm men là môi trường MRS

Môi trường MRS có thành phần sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao

nấm men - 5, glucose -20 Tween 80, K2HPO4 - 2, Natriacetate - 5, Diamonicitrate - 2.00, MgSO4.7H2O - 0.20, MnSO4.H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8 Khử trùng 1210

C trong

15 phút