Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌCĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN TỪ ĐẤT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN

TỪ ĐẤT VÙNG RỄ Ở ĐẤT NÂU ĐỎ

TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU

MSSV:3092522 LỚP:CNSH K35

Cần Thơ, Tháng 07/2012

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên) (ký tên)

PGs.Ts CAO NGỌC ĐIỆP Nguyễn Thị Cẩm Tú

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 3

1.1 Đặt vấn đề 3

1.2 Nội dung nghiên cứu 4

1.3 Mục tiêu đề tài 4

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 4

2.1 Sơ lược về chu trình nitơ, cơ chế cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm 5

2.1.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên 5

2.1.2 Quá trình cố định đạm 6

2.1.3 Vi khuẩn cố định đạm 6

2.2 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân 7

2.2.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên 7

2.2.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn 8

2.2.3 Vi khuẩn hòa tan lân 10

2.3 Sơ lược về IAA và cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn 10

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp 11 2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới 11

2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước 12

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Phương tiện thí nghiệm 13

3.2.1 Vật liệu thí nghiệm 13

3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị 13

3.2.3 Hóa chất 13

3.3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Phân lập vi khuẩn 15

3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyểnđộng của vi khuẩn 16

3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc 16

3.3.4 Xác định hàm lượng NH4 do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp Indophenol Blue 17

3.3.5 Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn 18

3.3.6 Đánh giá khả năng tổng hợp Indole-3-acid acetic của vi khuẩn, 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ DỰ KIẾN 23

TÀI LIỆU THAM KHẢO 24

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

Thật vậy, năng suất của hầu hết cây trồng gia tăng tuyến tính với lượng phân bón

mà chúng hấp thu Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về lương thực, mức tiêu thụcủa thế giới về các nguyên tố khoáng chính như đạm, lân và kali tăng dần từ 112 triệutấn năm 1980 đến 143 triệu tấn 1990 (Lauriente, 1995) Tuy nhiên, cây trồng chỉ sửdụng dưới mức phân nửa của lượng phân đã bón (Loomis và Conner, 1992) Lượngkhoáng chất còn lại có thể thấm lậu vào nước ngầm, bị cố định trong đất, hoặc gópphần vào sự ô nhiễm không khí

Qua những nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân vi sinh vật để thay thế phânhóa học là một trong những giải pháp hữu hiệu mà chúng ta có thể áp dụng Phân visinh là sản phẩm chứa nhiều vi sinh vật có ích, có khả năng cố định đạm hay chuyểnhóa các hợp chất lân khó tan thành dạng cây trồng dễ hấp thu, tham gia trực tiếp haygián tiếp vào quá trình dinh dưỡng của cây trồng

Do được bổ sung vi sinh có ích nên sản phẩm an toàn, lượng nitrat trong sảnphẩm giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khảnăng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp và cây

dễ hấp thu dinh dưỡng hơn Đặc biệt ở các chủng vi sinh vật trong đất có khả năngtổng hợp nitơ tự do tạo nguồn đạm sinh học, hòa tan lân khó tan cung cấp cho câytrồng Điều này có ý nghĩa rất quan trọng vì ngoài việc làm giảm chi phí trồng trọt,góp phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường vàxây dựng mô hình phát triển bền vững trong nông nghiệp

Vì thế, việc nghiên cứu để tìm ra những dòng vi khuẩn vừa có hoạt tính cố địnhđạm tốt đồng thời có khả năng hòa tan lân và kali cao để phục vụ cho nhu cầu sản xuấtphân bón vi sinh là rất cần thiết

Việc nghiên cứu, phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tanlân nhằm làm giảm lượng phân hóa học sử dụng trong nông nghiệp nhưng vẫn giữđược năng suất cao, cải thiện độ phì nhiêu của đất và an toàn cho môi trường là rất cầnthiết.

Vì vậy, đề tài “Phân lập vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ của cây bắp ở đất nâu đỏ Vũng Tàu” thực hiện nhằm phân lập những dòng vi khuẩn

có khả năng cố định đạm và hòa tan lân

1.2 Nội dung nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm, hòa tan lân từđất vùng rễ của cây bắp ở đất nâu đỏ Vũng Tàu

Xác đinh hình thái của các dòng vi khuẩn tuyển chọn

Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, khả năng cố định đạm vàhòa tan lân của các dòng vi khuẩn được tuyển chọn

1.3 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân tốt

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm

2.1.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên

Nitơ là một chất cần thiết cho sự sống, là thành phần của protein và acid nucleictrong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật Khí nitơ chiếm nhiều nhất trongkhông khí (79%) và là yếu tố dinh dưỡng giới hạn trong môi trường nước và trong cácloại đất nông nghiệp Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật lại không sử dụng được nếuchúng không được chuyển thành ammonia

Hình 1 Chu trình nitơ

(Nguồn: http://tulieu.violet.vn/document/show/entry_id/122642, ngày 07/07/2012)

Chu trình nitơ được tóm tắt bao gồm các quá trình cơ bản sau:

2.1.2 Quá trình cố định đạm

Quá trình cố định nitơ xảy ra bởi các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học.Trong đó người ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả vàtính an toàn của nó đối với môi trường

Quá trình cố định đạm sinh học là quá trình đồng hóa nitơ của không khí dưới tácdụng của một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nitrogenase hay nóicách khác quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3 dưới xúc táccủa enzyme nitrogenase khi có mặt ATP, trong đó nitrogenase được cấu tạo bởi haiphần: Fe-protein có khối lượng khoảng 6,0x104 Dal và Mo-Fe-protein có khối lượngphân tử khoảng 2,2x105 Dal theo sơ đồ phản ứng sau:

NH3 sẽ kếp hợp với acid hữu cơ tạo thành protein

(Lê Văn Nhương et al., 2009)

2.1.3 Vi khuẩn cố định đạm

Trong đất vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây Rễ cây tác động đến sựphát triển của vi sinh vật và ngược lại thực vật bị tác động bởi hoạt động của vi sinhvật vùng rễ Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinhvật đất, kích thích sự gia tăng của một số vi sinh vật ở vùng rễ và ngăn cản sự sống củanhững vi sinh vật khác Một đặc tính quan trọng là dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, điều nàyquyết định đến sự phát triển dồi dào của vi sinh vật cố định đạm ở vùng rễ, mà vi sinhvật này liên quan đến sự tăng trưởng, ngăn chặn bệnh cây và được xem là vi khuẩnkích thích tăng trưởng thực vật (plant growth-promoting rhizobacteria-PGPR)(Kloepper, 1994)

Một số vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong đất như:

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, chuyển động và có dạng hình que ngắn, là vi

khuẩn cố định đạm thúc đẩy sự phát triển, tăng năng suất cây trồng, tổng hợp IAA,

hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Bilal et al., 1990) Azospirillum

N2 + 6H+ + 6e 2NH3

Nitrogenase

hiện diện ở trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây trồng (Glick, 1995) Chúngcũng được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên thế giới, ởvùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Reinhold-Hurek et al., 1986).

Burkholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng

1m, di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero-Mellado et al., 2004) Đây là vikhuẩn sống cộng sinh với cây trồng, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trongvùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Chen et al., 2006) Chúngsinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí Tuy nhiên chúng pháttriển tốt trong môi trường ít khí oxy

Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, có khả năng

di chuyển tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử, là vi khuẩn sống tự do (Chan,1994)

Clostridium là vi khuẩn hình que, sinh bào tử, sống tự do trong đất và nước, có

thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện yếm khí (Lê Văn Nhương et al., 2009)

2.2 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân

2.2.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên

Phosphate (Pi) được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ăn thựcvật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào trongđất Hầu hết Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những liênkết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả lạiđất thì những Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô cơhoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành mộtthành phần hữu cơ của đất Sự phóng thích của những Pi vô cơ từ những Pi hữu cơđược gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được vi sinh vật bẽ gãy những liên kếthữu cơ Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩmcủa đất (Busman et al., 2009)

Hình 2 Chu trình lân trong tự nhiên

(Nguồn:http://pdsblogs.org/2011pdsapes5/2010/11/03/phosphorous-cycle/, ngày 20/07/2012; (TV) Thực vật; (Pi) Phosphate)

Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình lân diễn ra trong tự nhiên Chu trìnhoxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron mộtcách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự nhiên.Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử (redox) của lân nhưng những cơchế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được tìm hiểumột cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996)

2.2.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn

Một vài loài vi khuẩn có khả năng khoáng hóa và hòa tan lân hữu cơ và vô cơtương ứng (Hilda và Fraga, 2000) Cơ chế chủ yếu của sự hòa tan P vô cơ là hoạt độngtổng hợp acid hữu cơ của vi sinh vật và giảm pH đất (Kpomblekou và Tabatabai,1994) Theo nghiên cứu của Halder et al., (1990) cho thấy những acid hữu cơ phân lập

từ Rhizobium leguminosarum hòa tan một lượng P tương đương với lượng được hòa tan bởi chính vi khuẩn Bên cạnh đó, việc xử lý phần nước lọc ra từ Rhizobium với

Tảo, TV phù du

Nuôi sống sinh vật dị dưỡng

Sự hô hấp tế bào thải ra Phoshate (Pi)

Pi dư thừa từ phân bón

pepsin hoặc loại bỏ protein bởi việc tủa acetone thì không ảnh hưởng đến khả nănggiải phóng P Tuy nhiên, trung hòa với NaOH sẽ phá hủy hoạt tính hòa tan.

Acid hữu cơ được phân lập từ Rhizobium leguminosarum cũng như Rhizobium

meliloti, Bacillus firmus, và một số loài vi khuẩn khác là acid -ketogluconic Nhưng

với vi khuẩn Pseudomonas sp, Erwinia herbicola và Burkhoderia cepacia thì acid

gluconic là acid hữu cơ chính được tạo để hòa tan lân Một số acid khác như acidglycolic, oxalic, malonic và succinic cũng được nhận diện trong số vi khuẩn hòa tanlân (Illmer và Shinner, 1992)

Chất chelate và acid vô cơ được xem như cơ chế khác trong việc hòa tan lân.Tuy nhiên hiệu quả và sự đóng góp của chúng để giải phóng lân ít hơn acid hữu cơ

Sự phân hủy hợp chất lân hữu cơ phụ thuộc chủ yếu vào tính chất hóa lý và hóasinh của những phân tử này, chẳng hạn acid nucleic, phospholipids và đườngphosphate thì dễ dàng bị cắt, nhưng acid phytic, polyphosphate và phosphonate thìđược phân hủy chậm hơn nhiều (Ohtake et al., 1996) Sự khoáng hóa của những hợpchất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi làphosphohydrolase, phosphohydrolase gồm nhóm acid hoặc kiềm.) Những phản ứngkhử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoester hoặcphosphoanhydride Acid phosphohydrolase, không giống phosphatase kiềm, hoạt độngxúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính Hơn thế nữa, chúng còn được phânnhóm thành acid phosphatase đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặchiệu cơ chất của chúng Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau baogồm 3’- nucleotidase và 5’- nucleotidase, hexose phosphatase và phytase Một nhómđặt hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ(Ohtake et al., 1996)

Một vài phosphohydrolase được tiết ra bên ngoài màng sinh chất, chúng đượcgiải phóng dưới dạng hòa tan hoặc được giữ lại như protein liên kết màng Sự định vịnày cho phép chúng hoạt động như enzyme loại bỏ phosphoester hữu cơ, thành phầncủa trọng lượng phân tử lớn (như RNA và DNA) và không thể xuyên qua màng tế bàochất vật chất này đầu tiên có thể được chuyển thành thành phần trọng lượng phân tửthấp, và quá trình này có thể xuất hiện một cách liên tục như là sự biến đổi của RNA

và DNA thành nucleoside monophosphate thông qua Rnase và Dnase, tiếp theo là giải

phóng P và sản phẩm hữu cơ thông qua phosphohydrolase, cung cấp cho tế bào nhữngchất dinh dưỡng cần thiết (Goldstein, 1994).

2.2.3 Vi khuẩn hòa tan lân

Trong đất, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện với số lượng khác nhau Chúng gồm cảdòng hiếu khí và dòng kị khí, thường thấy dòng hiếu khí nằm trong đất (Sperberg,1958) Mật độ của vi khuẩn hòa tan lân trong vùng rễ cao hơn so với đất ngoài vùng

rễ (Katzelson et al., 1962), và hiện diện ở vùng đất mát mẻ và ẩm thấp nhiều hơn ởvùng đất khô hạn Một số vi khuẩn hòa tan lân được phát hiện như:

Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng hình thành

bào tử, di chuyển dễ dàng, là vi khuẩn yếm khí, và hình thành acid lactic

Bacillus pumilus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng hình

thành bào tử do đó môi trường sống của Bacillus pumilus rất đa dạng Tuy nhiên, trong

tự nhiên chúng phân bố chủ yếu trong đất và mô thực vật chết (Smibert và Kreig,1994)

Paenibacillus là vi khuẩn Gram dương, yếm khí, có khả năng hình thành bào tử,

phân phối rộng rãi trong đất, nước, không khí, các vùng rễ cây… (Daane et al., 2002)

Nhiều dòng trong chi Paenibacillus có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tăng

trưởng của thực vật Tăng cường sự phát triển của thực vật theo hai cơ chế: cơ chế trựctiếp bao gồm hòa tan lân, cố định đạm, phân hủy các chất gây ô nhiễm môi trường vàsản xuất các hoormone; cơ chế gián tiếp bao gồm kiểm soát phytopatogens bằng cáchcạnh tranh các nguồn tài nguyên như sắt, axit amin và đường, cũng như sản xuất thuốckhánh sinh (Bloemberg và Lugtenberg, 2001)

Acinetobacter là vi khuẩn Gram âm, sống hoại sinh, không sản xuất sắc tố, được

tìm thấy nhiều nơi trong đất, nước, sinh vật ngay cả trên da người (Barbe et al., 2004)

Brevibacillus gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, hiếu khí, chuyển động

chậm, bào tử hình elip Brevibacillus có khả năng sản xuất acid từ glycerol,

L-Arabinose, rhammose, ribose, và D-Fructose, chủ yếu là các acid béo (Keiichi Goto etal., 2004)

2.3 Sơ lược về IAA và cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn

Indole-3- acetic acid (IAA) hay còn gọi là auxin, chất điều hòa chủ yếu của sựsinh trưởng thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóasinh mô, phát triển trái và hạt, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng (Cao

Ngọc Điệp, 2011) Trong tự nhiên IAA có hai dạng: IAA liên kết (CH2COO-R) và IAA

tự do (R-CH2COOH) Chỉ có IAA tự do điều khiển hoạt động sinh lý của thực vật, màđặc trưng về sự sinh trưởng của cây qua sự tăng trưởng của tế bào

Xem xét cơ chế tổng hợp IAA của vi khuẩn Pseudomonas cho thấy L-Tryptophan

đóng vai trò quan trọng, nó được xem như tiền chất trong lộ trình tổng hợp IAA của cảthực vật lẫn vi sinh vật Suzuki et al., (2003) khảo sát khả năng tổng hợp IAA của

chủng Pseudomonas fluorescens HP72 bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy

nhiều tiền chất khác nhau và đưa ra 3 lộ trình tổng hợp IAA của vi sinh vật như sau:

Lộ trình Indole-3-acetamide (A-B) với sự tham gia của enzyme Tryptophanmonooxygenase và enzyme Indole acetamide hydrolase

Lộ trình Indole 3-pyruvid acid (E-F-D) với sự tham gia của enzyme Tryptophantransferase, enzyme 3 pyruvate decacboxylase và Indole 3 acetaldehyde oxydase

Lộ trình Trytophan side chain oxydase ( C-D) với sự tham gia của enzyme sidechain oxydase và enzyme Indole 3-acetaldehyde oxydase

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp 2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới

Thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật cố định đạm, hòa tan lântrên cây trồng Trong đó nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân sinh học cóchủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân có thể thay thế một lượng phân hóa họcđáng kể

Sản phẩm phân bón vi sinh cố định nitrogen tự do từ vi khuẩn Azotobacter và

Clostridium đã được sản xuất tại Mỹ, Autralia và sử dụng nhiều nơi trên thế giới với

tên gọi E.2001 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm E.2001 có tác dụng tốttrong việc nâng cao năng suất rau, trong đó mức độ tăng có thể từ 33,33% đến 56%tùy từng loại rau E.2001 có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh do nấm và vi khuẩngây nên như bệnh héo xanh, thối đen rễ, lở cổ rễ (Lê Văn Nhương et al., 2009)

Theo Gaur (1992) nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã chứng minh ở Liên Xô,năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp tăng 30% khi sử dụng vi sinh vậthòa tan lân; hiệu quả này ở Ấn Độ tương ứng là 10-20% tương đương với bón P2O5

một lượng 50 kg/ha Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada và Ấn Độ cho thấy: visinh vật phân giải lân có thể thay thế 50-75% lượng lân cần bón bằng quặng phosphate