Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium với rễ các cây họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng suất cây trồng và bền vững hệ sinh thái.. Thông qua sự cộng sinh giữ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM TỪ NỐT SẦN
CỦA CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata)
TS LÊ ĐÌNH ĐÔN ĐINH THỊ HÀ
Tháng 07/2011
Trang 3 TS Lê Đình Đôn đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhấtcho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Anh Võ Khánh Hưng, anh Nguyễn Phan Thành, các thầy cô và các anh chị cán
bộ của viện nghiên cứu Sinh học và Môi Trường của trường Đại học Nông Lâm đãtận tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi về mặt cơ sở vật chất cũng như về mặt kỹ thuật
Các bạn lớp DH07SH đã chia sẽ cùng tôi nhưng vui buồn cũng như hết lòng hỗtrợ, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập
Con xin ghi ơn ba mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như
đã động viên, hỗ trợ về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành tốt khóa luận này
Xin chân thành cảm ơn
Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2011
Đinh Thị Hà
Trang 4TÓM TẮT
Hiện nay, cùng với tình hình tăng dân số, diện tích đất canh tác ngày càng thu hẹp
và bị thoái hóa mà nhu cầu lương thực, thực phẩm ngày càng tăng Do đó, vấn đề cảitạo đất và tăng năng suất cây trồng đang được sự quan tâm của toàn xã hội Hàng nămtrên thế giới lượng nitơ khí quyển được cố định và chuyển hoá thành nguồn đạm dướicác dạng khác nhau, thông qua quá trình cố định đạm sinh học tự nhiên ước tính gấphai lần lượng nitơ hóa học sản xuất hàng năm Quan hệ cộng sinh giữa vi khuẩn
Rhizobium với rễ các cây họ đậu có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng
suất cây trồng và bền vững hệ sinh thái Vi khuẩn cố định đạm đang được quan tâm,
nghiên cứu nhiều trên các loại cây họ Đậu, trong đó có cây đậu xanh (Vigna radiata).
Kỹ thuật phân lập, tuyển chọn, định danh vi khuẩn cộng sinh với rễ cây họ Đậu làmnền tảng để tạo chế phẩm từ loại vi khuẩn này phụ vụ cho sản xuất nông nghiệp Do
đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của cây đậu
xanh (Vigna radiata).
Thí nghiệm gồm 4 nội dung: Phân lập và làm thuần các chủng vi sinh vật từ nốtsần cây đậu xanh; Xác định hình thái, nhuộm Gram; Thực hiện các thử nghiệm sinh
hóa để chọn lọc các chủng vi sinh vật có đặc điểm của Rhizobium sp.; Phát hiện vi khuẩn Rhizobium sp bằng phản ứng PCR với cặp primer (FGPS 1490, FGPS 132).
Kết quả: Thu thập được 24 mẫu nốt sần cây đậu xanh Sau khi xác định hình thái,nhuộm gram, thực hiện các thử nghiệm sinh hóa 7 chủng vi khuẩn có đặc điểm tương
đồng với Rhizobium sp .Sản phẩm PCR gồm các band có kích thước khoảng 380 - 550
pb Chọn 2 mẫu đi giải trình tự có kết quả tương đồng tới 99% là Klebsiella pneumoniae subsp.
Trang 5Thesis title “Initially isolated nitrogen-fixing bacteria from nodules of green bean
plants (Vigna radiata)”.
Now, togerther with population growth, the land area shrinking and increasinglydegraded, the food need to increase So, to solve this problem care of society Everyyear, on the world have quantity atmospheric nitrogen is fixed and to transformnitrogen sources under various forms through the process of biological nitrogenfixation naturally, is estimated double chemical nitrogen fertilizer produced annually
on the world The symbiosis relationship between Rhizobium bacteria with roots of
legumes, has an important role in nutrient cycles of nitrogen, a stable crop yields andunshakeable ecosystem Nitrogen-fixing bacteria are interested in attracting more
research and applied to many different crops Green bean plants (Vigna radiata) is a
plant of high economic value Technical isolation, selection, identification the bacteriasymbiosis with roots of green bean plants contribute to improvement soil, increasedcrop yields
The experiment consists of four main: Isolation and purification of microbialstrains from nodules of green bean plants; Determine morphology, Gram staining;Perform biochemical testing for testing for microorganisms collected for selected
characteristics to consistent with Rhizobium sp.; Detecting bacteria Rhizobium sp by
PCR with primer pair (FGPS 1490, FGPS 132)
The Result: 24 samples collected strain from nodules of green bean plants; Afterthe process of determining morphology, gram staining, biochemical tests, seven strains
have characteristics similar with Rhizobium sp Product of PCR band size about 380
to 550 pb Choose 2 samples to decipher sequence has similar results to 99% of
Klebsiella pneumoniae subsp.
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
SUMMARY iii
MỤC LỤC iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH viii
Chương 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Yêu cầu 2
1.3 Nội dung thực hiện 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Thực vật họ Đậu 3
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh (Vigna radiata) 3
2.2.1 Phân loại 3
2.2.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của cây đậu xanh (Vigna radiata) 4
2.3 Vai trò của nitơ đối với thực vật 4
2.4 Các nguồn nitơ cung cấp cho cây 5
2.5 Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên 5
2.6 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ 7
2.6.1 Phân loại vi khuẩn cố định nitơ 7
2.6.2 Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ 7
2.6.3 Vai trò vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên 8
2.7 Vi khuẩn Rhizobium 8
2.7.1 Lịch sử phát hiện vi khuẩn Rhizobium 8
2.7.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobium 8
2.7.3 Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium 11
2.7.5 Cơ chế cộng sinh của Rhizobium với cây họ đậu 12
2.8 Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction) 14
2.8.1 Ly trích DNA 14
Trang 72.8.1.1 Nguyên lý 14
2.8.2 Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR) 15
2.8.2.1 Khái niệm chung 15
2.8.2.2 Nguyên lý 15
2.8.2.3 Các thành phần phản ứng PCR 15
2.8.2.4 Các giai đoạn phản ứng PCR 18
2.9 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 19
2.9.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp trên thế giới 19
2.9.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Rhizobium sp ở Việt Nam 19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21
3.1 Thời gian và Địa điểm 21
3.2 Vật liệu nghiên cứu 21
3.2.1 Mẫu thí nghiệm: 21
3.2.2 Hóa chất sử dụng 22
3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 23
3.3 Phương pháp thí nghiệm 23
3.3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và làm thuần vi khuẩn từ nốt sần cây đậu xanh 23
3.3.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và xác định Gram vi khuẩn 23
3.3.3 Thí nghiệm 3: Thử nghiệm sinh hóa 24
3.3.3.1 Khả năng tạo thành Indol 24
3.3.3.2 Khả năng dịch hóa gelatin 24
3.3.3.3 Khả năng phân giải urê 25
3.3.3.4 Khả năng lên men đường 25
3.3.3.5 Phản ứng VP (Voges – Prokauer) 25
3.3.3.6 Khả năng di động 25
3.3.4.Thí nghiệm 4: Phát hiện chủng vi khuẩn Rhizobium bằng phương pháp PCR 26
3.3.4.1 Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn 26
3.3.4.2 Thực hiện phản ứng PCR 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
4.1 Phân lập và làm thuần chủng vi khuẩn từ nốt sần cây đậu xanh 29
4.2 Thí nghiệm 2: Quan sát hình thái tế bào và nhuộm Gram vi khuẩn 30
Trang 84.4 Thí nghiệm 4: Phát hiện vi khuẩn Rhizobium sp bằng phương pháp PCR 36
4.4.1 Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn phân lập từ nốt sần cây đậu xanh 36
4.4.2 Phản ứng PCR 36
5.1 Kết luận 40
5.2 Đề nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
Trang 9SDS : Sodium dodecyl sulfate
TAE : Tris Acetate EDTA
Taq : Thermus aquaticus
Trang 10DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây đậu xanh 3
Hình 2.2 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên 6
Hình 2.4 Vi khuẩn Rhizobium 9
Hình 2.6 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu 13
Hình 2.7 Nguyên tắc phản ứng PCR 18
Hình 4.1 Màu sắc, hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường YEMA 30
Hình 4.2 Vi khuẩn trên môi trường chọn lọc YEMA - Congo Red .31
Hình 4.3 Hình dạng, màu sắc khi quan sát dưới kính hiển vi 100X 31
Hình 4.5 Thử nghiệm khả năng lên men đường 33
Hình 4.6 Thử nghiệm khả năng tạo thành Indol 34
Hình 4.7 Thử nghiệm khả năng phân giải ure 34
Hình 4.8 Thử nghiệm khả năng di động .35
Hình 4.9 Điện di kiểm tra mẫu 36
Hình 4.10 Sản phẩm PCR 37
Trang 11DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các Rhizobium sp đã được định danh 9
Bảng 2.2 Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ 12
Bảng 3.1 Kí hiệu và địa chỉ lấy mẫu 21
Bảng 3.2 Thành phần cho một phản ứng PCR 27
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 27
Bảng 4.1 Kết quả màu sắc, hình dạng, nhuộm Gram vi khuẩn 32
Bảng 4.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa 32
Trang 12Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Dân số thế giới đã tăng từ 3 tỷ người vào năm 1960 lên 5,3 tỷ người vào năm
1990 và dự kiến đạt 8,5 tỷ người vào năm 2050 Đồng nghĩa với việc tăng dân số làgiảm diện tích đất canh tác, và tăng nhu cầu về lương thực, thực phẩm.( Nguyễn MinhHưng và ctv, 2007) Để đáp ứng nhu cầu lương thực, thực phẩm thiết yếu nhiều biệnpháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cây trồng, như sử dụng thuốc trừ sâu,phân bón hóa học ngày càng phổ biến Những giải pháp trên tuy đem lại hiệu quảnhanh chóng trong việc cải thiện năng suất, gia tăng phẩm chất cây trồng, nhưng cácbiện pháp này còn nhiều hạn chế như gây ô nhiễm môi trường, thoái hóa đất nôngnghiệp, tác động tiêu cực đến sức khỏe con người và vật nuôi Ngoài ra vấn đề ônhiễm môi trường là vấn đề chung cấp bách của các quốc gia trên thế giới nên việc xâydựng một nền nông nghiệp năng suất cao nhưng bền vững và thân thiện với môitrường đã trở thành xu hướng mới trên toàn cầu Nghiên cứu sự tương tác có lợi giữa
vi sinh vật với cây trồng nhằm sử dụng chúng để cải tạo đất, tăng năng suất cây trồnghứa hẹn nhiều tiềm năng Trong đó vi khuẩn cố định đạm là đối tượng điển hình
Hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 120 - 160 triệu tấn nitơ khí quyển được
cố định và chuyển hoá thành nguồn đạm dưới các dạng khác nhau thông qua quá trình
cố định đạm sinh học tự nhiên (Gibson, 1995) Lượng đạm này ước tính gấp khoảng 2lần lượng phân nitơ hoá học sản xuất ra hàng năm trên thế giới Thông qua sự cộng
sinh giữa vi khuẩn Rhizobium với rễ các cây họ đậu, quá trình cố định đạm được thực
hiện Quan hệ cộng sinh này có vai trò quan trọng trong cải tạo đất, ổn định năng suấtcây trồng và bền vững hệ sinh thái (Macdicken, 1994 Balasundaran, 1995)
Trên thế giới vi khuẩn cố định đạm đã được nghiên cứu vào khoảng đầu thế kỷ
19, và thu được nhiều kết quả được ứng dụng trong cải tạo đất, tăng năng suất câytrồng (Howieson và ctv, 2000) ở Việt Nam, tiềm năng ứng dụng của chúng vẫn chưađược khám phá hết, việc nghiên cứu, phân lập và định danh các vi khuẩn cố định đạm
trên cây họ đậu như cây đậu xanh (Vigna radiata) đang được sự quan tâm của nhiều
nhà khoa học, các doanh nghiệp, dựa trên những cơ sở đó tiến hành đề tài “ Phân lập
vi khuẩn cố định đạm từ nốt sần của cây đậu xanh (Vigna radiata)”.
Trang 131.2 Yêu cầu
Phân lập vi khuẩn Rhizobium sp từ nốt sần cây đậu xanh tại các tỉnh (Đồng
Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tp Hồ Chí Minh)
1.3 Nội dung thực hiện
- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn thu được từ nốt sần của cây đậu
- Quan sát hình thái, nhuộm Gram; Thực hiện các thử nghiệm sinh hóa để chọn
lọc các dòng có đặc tính của vi khuẩn Rhizobium sp.
- Phát hiện vi khuẩn Rhizobium sp bằng phản ứng PCR (polymerase Chain
Reaction) với cặp primer (FGPS 1490, FGPS 132)
Trang 14Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Thực vật họ Đậu
Thực vật họ Đậu, tên khoa học Leguminosae (Fabaceae)-là họ hai lá mầm củathực vật có hoa với 650 chi và 18000 loài Nhiều cây trong họ này làm lương thực chocon người và gia súc như cây đậu Hà Lan, đậu Cove, đậu tương hoặc làm phân xanhnhư cỏ ba lá, muồng Ngoài ra một số cây trong họ này được dùng trong mục đích cảitạo đất bị thoái hóa, phục hồi, cải tạo môi trường sinh thái như keo, bồ kết ba gai Một
số chi trong họ này như Mimosa, Delonix, Acacia… là các loại cây cảnh Một số loài
còn có tính chất dược học hoặc diệt trừ sâu bọ Một đặc điểm nổi bật của những loạicây thuộc họ Đậu là các loại cây ký chủ cho nhiều loại vi khuẩn cố định nitơ ở rể Các
loại vi khuẩn này được biết đến như là vi khuẩn nốt rễ (rhizobium), có khả năng lấy
khí nitơ trong không khí và chuyển hóa nitơ thành các dạng chất mà cây có thể hấp thụđược (NO3-, NH3-) Hoạt động này được gọi là cố định đạm Cây họ Đậu, trong vai tròcủa cây chủ, còn vi khuẩn nốt rễ, trong vai trò của nhà cung cấp nitrat có ích, tạo ramột quan hệ cộng sinh (Kristina và ctv, 2005)
2.2 Giới thiệu về cây đậu xanh (Vigna radiata)
Loài: Vigna radiata (Phaeolus aureus Roxb).
Hình 2.1 Cây đậu xanh.
(Shanmugasundaram S, 2006).
Trang 152.2.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của cây đậu xanh ( Vigna radiata)
Cây đậu xanh (Vigna radiata) thuộc loại cây thân thảo mọc đứng Lá mọc kép 3 lá
chét, có lông hai mặt Hoa màu vàng lục mọc ở kẽ lá Quả hình trụ thẳng, mảnh nhưng sốlượng nhiều, có chứa hạt hình tròn hơi thuôn, kích thước nhỏ, màu xanh, ruột màu vàng, cómầm ở giữa.(http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_xanh)
Cây đậu xanh có khả năng thích ứng rộng, chịu hạn khá và có thể thích nghi vớicác vùng có điều kiện khắc nghiệt như khu vực Đông và Nam Châu Á, được trồngnhiều ở các quốc gia như: Ấn Độ, Pakistan, Bangladesh, Sri Lanka, Nepal TrungQuốc, Thái Lan, Philippin, Miến Điện, Inđônexia ; Hiện nay, được phát triển tại một
số quốc gia ở vùng ôn đới, ở Châu Úc, lục địa Châu Mỹ Một đặc trưng của cây đậuxanh là loại cây ký chủ cho nhiều loài vi khuẩn trên rễ của chúng
(http://vi.wikipedia.org/wiki/%C4%90%E1%BA%ADu_xanh)
2.3 Vai trò của nitơ đối với thực vật
Đối với thực vật nói chung và cây họ đậu nói riêng, nitơ có vai trò sinh lý đặc biệtquan trọng đối với sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất Nitơ có mặt trong rấtnhiều hợp chất hữu cơ quan trọng có vai trò quyết định trong quá trình trao đổi chất và nănglượng, đến hoạt động sinh lý của cây Nitơ là nguyên tố đặc thù của protein mà protein lại
có vai trò cực kỳ quan trọng đối với cây Protein là thành phần chủ yếu tham gia cấu trúcnên hệ thống chất nguyên sinh trong tế bào, cấu tạo nên hệ thống màng sinh học, các bàoquan trong tế bào; Protein là thành phần bắt buộc của các enzyme.(http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinh dam.515026.html)
Nitơ có trong thành phần của acid nucleic (DNA và RNA) Ngoài chứcnăng duy trì và truyền thông tin di truyền, acid nucleic đóng vai trò rất quan trọngtrong quá trình sinh tổng hợp protein, sự phân chia và sự sinh trưởng của tế bào ; Nitơ
là thành phần quan trọng của chlorophyll, là một trong những yếu tố quyết địnhhoạt động quang hợp của cây, cung cấp chất hữu cơ cho sự sống của các sinh vật trêntrái đất, là thành phần của một số phytohormone như auxin và cytokinin
Thừa nitơ: Khác với các nguyên tố khác, việc thừa nitơ có ảnh hưởng rấtnghiêm trọng đến sinh trưởng, phát triển và hình thành năng suất ở cây trồng Cây sinhtrưởng quá mạnh, thân lá tăng nhanh mà mô cơ giới kém hình thành nên cây rất yếu,
dễ lốp đổ, giảm năng suất nghiêm trọng và có trường hợp không có thu hoạch
Trang 16Thiếu nitơ: Cây sinh trưởng kém, chlorophyll không được tổng hợp đầy đủ,
lá vàng, đẻ nhánh và phân cành kém, sút giảm hoạt động quang hợp và tích lũy,giảm năng suất Tùy theo mức độ thiếu đạm mà năng suất giảm nhiều hay ít.Trong trường hợp có triệu chứng thiếu đạm thì chỉ cần bổ sung phân đạm là cây sinhtrưởng và phát triển bình thường (http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinh-dam.515026.html)
2.4 Các nguồn nitơ cung cấp cho cây
Hàm lượng nitơ trong thành phần chất khô của thực vật thường từ 1 - 3% Tuyhàm lượng trong cây thấp, nhưng nitơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất đối với đờisống thực vật cũng như toàn bộ thế giới hữu cơ
Trong tự nhiên, nitơ tồn tại dưới 2 dạng: Dạng khí tự do trong khí quyển (N2)chiếm khoảng 79% không khí (theo thể tích), dạng này cây không thể sử dụng được;Dạng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ
Nitơ liên kết chủ yếu ở 3 dạng hợp chất: Hợp chất nitơ vô cơ trong các muốiammonium (NH4+), muối nitrate (NO3-); Nitơ hữu cơ của các protein ở dạng xác bãđộng vật, thực vật chưa phân giải hoàn toàn, ở dưới dạng mùn protein Các sản phẩmphân giải của protein như các acid amine, các peptid và các amine
Trong số các dạng nitơ trên, cây chỉ sử dụng nitơ vô cơ là chủ yếu Trong đấtnitơ vô cơ chiếm 1 - 2% lượng nitơ tổng số có trong đất Trên những loại đất phì nhiêulượng nitơ trong đất có thể đạt 200 kg/ha
(http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinh dam.515026.html)
2.5 Quá trình cố định nitơ trong tự nhiên
Khí nitơ chiếm khoảng 80% trong bầu khí quyển Tuy nhiên hầu hết các sinhvật sống đều không thể sử dụng dạng nitơ này Khí nitơ có thể được các vi sinh vật cốđịnh đạm biến đổi thành dạng amminoa (NH3-), là dạng nitơ mà hầu hết thực vật trong
tự nhiên sử dụng để tạo ra amoni acid, protein, nucleic acid và những thành phần khácchứa nitơ cần thiết cho sự sống Cũng như carbon, nitơ trong tự nhiên có chu trìnhchuyển hóa giữa nitơ và không khí có sự trao đổi thường xuyên : nitơ phân tử chuyểnthành dạng nitơ kết hợp do các quá trình cố định nitơ sinh học, do tác động của điện và
cố định quang học (http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen_fixation)
Chu trình nitơ trong tự nhiên có hai giai đoạn là cố định nitơ và khoáng hóa nitơ :
Trang 17- Giai đoạn cố định nitơ do các vi sinh vật cố định nitơ như Rhizobium sống cộng sinh với rễ cây họ Đậu hay Azotobacter sống tự do…sẽ biến đổi nitơ trong
không khí thành amonia, từ amonia sẽ tổng hợp nên các hợp chất chứa nitơ khác cungcấp cho cây trồng và đồng thời làm giàu thêm nitơ cho đất Phản ứng cố định nitơđược xúc tác bởi enzyme nitrogenase theo phương trình sau:
Nitrogenase là một phức hệ enzyme được cấu tạo bởi hai thành phần, đó làprotein có phân tử nhỏ Một thành phần gọi là protein sắt (Fe protein), còn gọi lànitrogenase khử hay thành phần II Thành phần kia gọi là protein sắt-molybden (Mo-
Fe protein) còn gọi là thành phần I (Samuel S Gnamanickam.2006)
- Giai đoạn khoáng hóa nitơ có sự tham gia của các chủng vi khuẩn nitrat hóa
như Nitrosomonat và Nitrobacter để chuyển hóa nitrat (NO3-), là dạng thích hợp nhất
để cho cây trồng hấp thu
(http://www.ctu.edu.vn/colleges/aquaculture/daotaotuxa/reference/giaotrinh/sinhthai/chuong2.htm)
Hình 2.2 Chu trình cố định nitơ trong tự nhiên.
(http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinh-dam.515026.html)
Trang 182.6 Tổng quan về vi khuẩn cố định nitơ
2.6.1 Phân loại vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ được chia làm 3 nhóm: vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh, vikhuẩn cố định nitơ sống tự do và vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật ký chủ Tuynhiên, sự phân biệt giữa 3 nhóm này, đặc biệt là giữa nhóm vi khuẩn cố định nitơ sống tự do
và nhóm vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thực vật thì vẫn chưa được mô tả một cách rõràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm (Samuel S Gnamanickam, 2006)
2.6.2 Đặc điểm vi khuẩn cố định nitơ
Vi khuẩn cố định nitơ sống cộng sinh là những vi sinh vật sinh vật sống cộngsinh với thực vật ký chủ theo kiểu hai bên cùng có lợi Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽtiến hành trao đổi chất dinh dưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ởnơi vi khuẩn định cư, điển hình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu.Hiện tượng cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật được xem là sự tương tác gần giữa vikhuẩn và thực vật, trong đó vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết những vikhuẩn cố định nitơ là vi khuẩn Gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ
Đậu; hay là những thành viên của xạ khuẩn chi Frankia- là những vi khuẩn Gram
dương có khả năng hình thành nốt sần trên cây thân gỗ, cây hai lá mầm và cây bụi
Ban đầu những vi khuẩn cộng sinh ở cây họ Đậu được phân loại thành chi Rhizobium,
do đó những vi khuẩn này thường được nói đến như là những vi khuẩn nốt rễ
(rhizobia) Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở rễ cây họ Đậu được phân loại thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium, Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium (Samuel S Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định nitơ sống tự do (không cộng sinh) là những vi khuẩn tươngtác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng
cộng sinh chuyên biệt Trong số này quan trọng nhất là các loài thuộc chi Azobacter, Pseudomonas và Clostridium (Samuel S Gnamanickam, 2006).
Vi khuẩn cố định nitơ tương tác là những vi khuẩn tham gia vào quá trình traođổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc rễ của thực vật
Để phân biệt được vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủthì chủ yếu dựa vào mức độ tương tác Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình
cố định nitơ bởi những vi khuẩn sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp của cây
Trang 19định nitơ đề có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sựcộng tác bắt buộc Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữaquá trình cố định nitơ cộng sinh và tự do Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồmnhững vi khuẩn sống tự do trong vùng lân cận của rễ cây thực vật đến những vi khuẩnsống nội sinh trong mô tế bào thực vật Để quá trình cố định nitơ tương tác có thể diễn
ra cần những yêu cầu sau đây; 1) thực vật ký chủ; 2) vi khuẩn cố định N; 3) chất nềnthực vật; 4) môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động; 5) quá trìnhchuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng Một số vi khuẩn tham gia cố
định nitơ tương tác điển hình như: Azosprium, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbaspirillum, và Klebsiella (Samuel S Gnamanickam, 2006)
2.6.3 Vai trò vi khuẩn cố định nitơ trong tự nhiên
Vai trò của tất cả những vi khuẩn cố định nitơ đó là khả năng cố định nitơ cungcấp đạm cho cây trồng Tuy nhiên bên cạnh đó các vi khuẩn cố định nitơ còn được biếtđến với nhiều vai trò khác có ích cho cây trồng như: Kích thích sinh trưởng ở thực vậtbằng cách tạo ra các enzyme như ACC deaminase, hay tạo ra các phytohormone nhưauxin, cytokinin và gibberlin Giảm tác động có hại của các mầm bệnh bằng cách cạnhtranh về dinh dưỡng, cạnh tranh về nơi cư trú hay tạo ra các chất kháng sinh, cácenzyme thủy phân chống lại bệnh xâm nhập của kẻ thù hay cảm ứng hệ thống phòng
vệ của cây ký chủ (Dracourt và ctv, 2001; Loon, 2007)
2.7 Vi khuẩn Rhizobium
2.7.1 Lịch sử phát hiện vi khuẩn Rhizobium
Năm 1886, Hellriegel và Uynfac đã khám phá ra bản chất của quá trình cố địnhnitơ phân tử Họ đã chứng minh được khả năng của cây họ đậu lấy được nitơ khíquyển là nhờ vi khuẩn nốt sần (VKNS) sống ở vùng rễ cây họ đậu Họ đặt tên cho loài
vi sinh vật này là Bacillus radicicola Năm 1889, Pramovskii đã đổi tên vi sinh vật này là Bacterium radicicola Cuối năm 1889 Frank đề nghị đổi tên là Rhizobium.
2.7.2 Phân loại vi khuẩn Rhizobium
Phân loại khoa học
Giới: Bacteria
Nghành: proteobacteria
Lớp: Alphaproteobacteria
Bộ: RhizobialesHọ: Rhizobiaceae
Chi: Rhizobium (http://en.wikipedia.org/wiki/rhizobium).
Trang 20Hình 2.4 Vi khuẩn Rhizobium.(a) Rhizobium trên môi trường thạch,
(b) Rhizobium dưới kính hiển vi vật kính100’.(http://en.wikipedia.org/wiki/rhizobium).
Bảng 2.1 Các Rhizobium sp đã được định danh
1 R leguminosarum
R l.biovar trifolii
R l.biovar viciae Frank, 1889
2 R lupini (Schroeter, 1886) Eckhardt và ctv, 1931
3 R rhizogenes (Riker và ctv, 1930) Young và ctv, 2001
4 R rubi (Hildebrand, 1940) Young và ctv, 2001
5 R phaseoli Dangeard,1926 Emend.Ramírez-Bahena và ctv, 2008
6 R radiobacter Beijerinck và van Delden, 1902 Young và ctv, 2001
7 R vitis Ophel và Kerr, 1990 Young và ctv, 2001
14 R undicola (De Lajudie và ctv, 1998) Young và ctv, 2001
15 R mongolense Van Berkum và ctv, 1998
16 R yanglingense Tan và ctv, 2001
17 R sullae Squartini và ctv, 2002
18 R indigoferae Wei và ctv, 2002
19 R loessense Wei và ctv, 2003
Trang 2120 R larrymoorei (Bouzar và Jones, 2001) Young, 2004
Vi khuẩn Rhizobium tồn tại trong đất, có thể xâm nhập vào các lông hút của rễ
cây bộ đậu và kích tác tạo thành nốt sần nên còn gọi là vi khuẩn nốt sần
Căn cứ vào hệ thống phân loại mới, các loài vi khuẩn nốt sần được đề cập trongcuốn "Phân loại vi khuẩn theo Bergey",dựa vào khả năng sinh trưởng phát triển trênmôi trường thạch, vi khuẩn nốt rễ được chia làm 2 nhóm:
Nhóm mọc nhanh (vi khuẩn nốt sần cỏ ba lá, đậu Hà Lan, mục túc, ) thuộc chi
Rhizobium Đây là nhóm vi sinh vật có hoạt động cố định N mạnh nhất Vi khuẩn nốt
rễ tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch sau 3 - 5 ngày nuôi cấy
Nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tương, lạc ) thuộc chi
Bradyrhizobium Vi khuẩn mọc chậm cần thời gian tạo khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy
lớn hơn 5 ngày dam.515026.html)
Trang 22(http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/vi-khuan-not-san-cong-sinh-co-dinh-2.7.3 Đặc điểm vi khuẩn Rhizobium
Rhizobium Là loại trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí Kích thước
tế bào dao động 0,5 - 1,2 × 2,0 - 3,5m, khuẩn lạc thuộc nhóm S, nhày lồi, màu trắngtrong hoặc trắng đục, kích thước khuẩn lạc dao động 2,3 - 4,5 mm sau một tuần nuôi
trên môi trường thạch bằng Vi khuẩn Rhizobium có tiêm mao, có khả năng di động
được, chúng thích hợp ở pH từ 6,5 - 7,5, nhiệt độ 25 - 28oC, độ ẩm 50 - 70% Khi già
có một số loài tạo được nang xác, khuẩn lạc sẽ chuyển sang màu nâu nhạt Vi khuẩnnốt sần có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau (đường đơn, đường kép,axit hữu cơ, rượu bậc thấp, dextrin, glycogen, ) Khoảng 30% lượng đường do vikhuẩn nốt sần đồng hóa được dùng để tạo chất nhầy của chúng (parker, 2001) Vikhuẩn nốt sần có thể đống hóa tốt nhiều loại axit amin, một số dòng có thể đồng hóađược pepton Khả năng sử dụng các protein phân tử lớn nói chung là rất ít Vi khuẩnnốt sần có thể sử dụng dễ dàng các muối amon, nitrat và các gốc kiềm purin, pirimidin.Chúng còn có thể sử dụng được ure hoặc biure
Nhu cầu vitamin thay đổi đối với tùy từng nòi vi khuẩn nốt sần Nói chung nhiềuloại vi khuẩn nốt sần có khả năng tự tổng hợp khá nhiều loại vitamin (B1, B2, B12,…)
Phát triển của Rhizobium còn phụ thuộc vào hàm lượng nitơ vô cơ trong đất Quá nhiều nitơ ở dạng này cũng kìm hãm Rhizobium phát triển vì lúc đó một phần nitơ đã sử dụng
vào giai đoạn đầu phát triển của cây Canxi, phospho và kali ảnh hưởng tới phát triển của
vi khuẩn nốt sần Ví dụ, Ca tạo điều kiện thuận lợi cho việc xâm nhập của vi khuẩn Các
vi lượng cũng tác động đáng kể tới vi khuẩn này, nhất là bo và molipden.
Đa số mỗi loài vi khuẩn nốt sần chỉ xâm nhiễm được trên một nhóm cây nhấtđịnh trong bộ Đậu Ví dụ các nghiên cứu ở Việt Nam cho biết vi khuẩn nốt sần Điền
thanh hoa vàng (S cannnabana) có thể tạo được nốt sần trên Điền thanh hạt tròn (S paludosa) không có khả năng tạo nốt sần trên rất nhiều loại đậu khác (đậu tương, đậu
đen, đậu xanh, đậu lạc…) Một số trường hợp vi khuẩn nốt sần xâm nhập vào nhữngloại cây họ Đậu không đặc hiệu, khi đó chúng tạo rất ít nốt sần và cố định nitơ yếu
Một số giống vi khuẩn nốt sần thường gặp trên rễ các cây bộ đậu như: R leguminosorum (đậu Hà Lan); R triofolii (cỏ ba lá); R lupin (đậu lupin); R phasoli (đậu cô ve); R meliloti (cỏ lucena); R japonicum (đậu tương); R archium (đậu phộng); R cajanus (đậu triều); R vigna (đậu đũa); R sesbania (điền thanh).
Trang 232.7.5 Cơ chế cộng sinh của Rhizobium với cây họ đậu
Quá trình tạo nốt sần phức tạp và được kiểm soát bởi gene nod của vi khuẩn nốt rễ
(rhizobia) Hầu hết các loại cây họ đậu có thể tạo nốt sần khi có sự xâm nhiễm của
Rhizobium Gene nod quy định sự xâm nhiễm của Rhizobium vào cây chủ chuyên biệt Gene nod có khả năng nhận tín hiệu của flavonoid được tiết ra từ rễ cây họ đậu Gene nod đặc trưng cho tính đa dạng và cấu trúc protein của Rhizobium như enzymes Khi gene nod
nhận tín hiệu lipoolygosaccharide từ rễ cây họ đậu được gọi Nod factors Trong bộ gene của
Rhizobium, gene nod nằm trên plasmids gọi là sym plasmid, ngoài ra trên plasmid này còn chứa gene kiểm soát khả năng cố định nitơ gọi là gene nif hoặc gene fix Ví dụ như Rhizobium legummisarum biovar viciae tạo nốt sần trên cây đậu Hà Lan (peas) sym plasmid 220 kb có chứa gene nif và gene nod khoảng 35 kb (Parker, 2001)
Gene nif là gene mã hóa cho phức hợp enzyme nitrogenase và những enzyme khác liên quan đến quá trình cố định nitơ, gene nif có trình tự bảo tồn giống nhau ở những vi sinh vật cố định nitơ Mặc dù vậy, nhưng sự điều hòa biểu hiện của gene nif
là khác nhau giữa các vi sinh vật cố định nitơ Có hơn 20 loại gene nif khác nhau có chức năng vai trò khác nhau, trong đó có 3 gene quan trọng nhất là gene nifH, nifD, và nifK giữ vai trò mã hóa những thành phần chính của enzyme nitrogenase.
(http://media-2.web.britannica.com/eb-media/38/6538-004-3E138D9.gif)
Bảng 2.2 Một số gene nif quan trọng và vai trò của nó trong sự cố định nitơ
nifH Nhường điện tử cho ditrogenase trong quá trình chờ nitrogenase hoạt động
NifD FeMo bị che lấp bởi nifD, là tiểu đơn vịcủa nitrogenase
NifK Nhóm P xuất hiện ở bề mặt của nifK, là tiểu đơn vịcủa nitrogenase
(http://media-2.web.britannica.com/eb-media/38/6538-004-3E138D9.gif)
Cơ chế tạo nốt sần của quá trình cộng sinh Rhizobium với cây họ đậu:
Ban đầu, vùng rễ tiết ra men polygalactoronaza dẫn dụ vi khuẩn Rhizobium sống tự do trong đất di chuyển đến vùng rễ (Nguyễn Minh Hiếu, 2003) Nhờ gene nod
vi khuẩn nhận ra cây ký chủ chuyên biệt, nếu đúng là thực vật ký chủ chuyên biệt, vikhuẩn gắn chặt vào rễ Lúc này, rễ tiết ra flavonoid để truyền cảm ứng tín hiệu chonhững gene nod của vi khuẩn hoạt động để hình thành nốt sần trên cây (Turgeon vàBauer,1985) Khi bám vào rễ, vi khuẩn sẽ phân tiết yếu tố nod (Nod factors) , yếu tố
Trang 24này làm lông rễ cong lại, vi khuẩn bắt đầu xâm nhập vào rễ thông qua đường xâmnhiễm (infection thread) ở đầu rễ Đường xâm nhiễm này do tế bào rễ tự tạo ra để đápứng lại sự xâm nhiễm của vi khuẩn Trong đường xâm nhiễm, vi khuẩn sinh trưởngliên tục để tạo ra yếu tố Nod, yếu tố này sẽ kích thích tế bào lông rễ ngày càng pháttriển to ra và cuối cùng hình thành nên nốt sần Trong các nốt sần có hàng nghìn vi
khuẩn Rhizobium sống tự do, hầu hết chúng ở dạng bất định (misshapen) và được gọi
là thể vi khuẩn Một phần màng tế bào thực vật ký chủ sẽ bao bọc lại những thể vikhuẩn Cấu trúc này được gọi là thể cộng sinh (symbiosome) và trong thể cộng sinh,quá trình cố định nitơ sẽ diễn ra Bên trong nốt sần, vi khuẩn kiểm soát nồng độ oxybởi leghaemoglobin, là một loại protein có mang sắt, màu đỏ, có chức năng tương tựhaemoglobin trong máu, đó là gắn với oxy Điều này sẽ giúp nồng độ oxy ở mức vừa
đủ để không làm bất hoạt enzyme nitrogenase.(Shin Okazaki và ctv, 2004)
Hình 2.6 Cơ chế tạo nốt sần trên cây họ đậu. (A) Sơ đồ biến đổi các chất hóa học và quá trình nhiễm của vi khuẩn nốt sần (B) Rễ tóc của Lotus
Japonicus (C) Gene gfp của Mesorihizobium loti xâm nhiễm vào rễ tóc ở hình (B) (D) Nốt sần trưởng thành được tạo do M Loti xâm nhiễm vào L.Japonicus Kích thước hình (B,C) 10 m, hình (D) 1 m (Shin Okazaki và ctv, 2004)
Trang 252.8 Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction)
2.8.1 Ly trích DNA
2.8.1.1 Nguyên lý
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh cáctác nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này
Phương pháp tách chiết DNA gồm 3 bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote) Thông thườngngười ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) vàproteinase (proteinase K) Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giảiphóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là cácprotein Mẫu được lắc thật mạnh trong các dung dịch phenol và chloroform, dung dịchphenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan các acidnucleic Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acidnucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại
Bước 3: Tủa acid nucleic Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dướidạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác cóthể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa:
- Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ioncao (nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung dịch ethanol/1 dung dịchmẫu), nhiệt độ thấp tạo điều kiện thuận lợi cho việc kết tủa Hầu như toàn bộ acidnucleic đều tủa trong các điều kiện nêu trên
- Tủa trong isopropanol, điểm khác biệt so với phương pháp trên là không cần sự hiệndiện của muối, thể tích isopropanol/thể tích dung dịch mẫu là 1/1 Các DNA có trọng lượngphân tử thấp không bị kết tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa isopropanol
Trong cả 2 phương pháp trên, acid nucleic thu nhận lại bằng li tâm Sau đó, cặntủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ muối hoặc các dấu vết của ethanol còndính lại trên mẫu (Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008)
Trang 262.8.2 Phản ứng Polymerase Chain Reaction (PCR)
2.8.2.1 Khái niệm chung
Kỹ thuật PCR (Polymease Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo cácđoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác cao được thực hiện trong máy luân nhiệt
Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh năm 1985 và được tiếp thu hoànthiện thông qua việc phát hiện và sản xuất được enzyme DNA polymerase chịu nhiệt
từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số vi khuẩn khác Máy PCR ngày càng
hoàn thiện cho phép thay đổi nhanh chóng, chính xác nhiệt độ từng giai đoạn nhân bảnDNA Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền quan trọng của côngnghệ di truyền (Trịnh Đình Đạt, 2006)
2.8.2.2 Nguyên lý
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bảncủa sao chép DNA trong cơ thể như: Đoạn DNA cần nhân bản mở xoắn thành 2mạch đơn, cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu và điều kiệnmôi trường thích hợp và enzyme DNA polymerase Tuy nhiên kỹ thuật PCR cókhác là dùng nhiệt độ cao (94oC) để tháo xoắn thay cho helicase kết hợp enzymeDNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giaiđoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Nhờ kỹthuật PCR mà với lượng nhỏ DNA ban đầu ta có thể thu đủ lượng DNA cần thiết đểtiến hành các thí nghiệm DNA (Trịnh Đình Đạt, 2006)
2.8.2.3 Các thành phần phản ứng PCR
DNA khuôn (DNA template)
Phản ứng khuếch đại tối ưu trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật chẩnđoán bằng PCR vẫn cho kết quả tốt với DNA thu trực tiếp từ dịch chiết tế bào LượngDNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100 ng) với việc sửdụng polymerase cho hiệu quả cao Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạnchế được các khuếch đại “ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong muốn Một
ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả mẫu DNA bảoquản không tốt, đã bị phân hủy một phần như các vết máu lâu ngày, tinh dịch khô, hóathạch, tóc, móng tay của người đã chết, .(Hồ Quỳnh Thùy Dương, 2008) LượngDNA mẫu sử dụng có thể rất thấp từ 1 đến hàng chục nghàn (Trịnh Đình Đạt, 2006)
Trang 27Mồi (primer) và nhiệt độ lai
Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và
có hiệu quả cao Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phảituân thủ một số nguyên tắc
Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
“xuôi” và mồi “ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổsung giữa các thành phần khác nhau của một mồi
Tm của mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt quá xa Thành phầnnucleotide của các mồi cân bằng tránh cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần Các mồi chọnphải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lạitrên gen (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2008)
DNA polymerase
Là enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp mạch DNA mới Ngày nay, người ta
thường dùng nhiều loại DNA polymerase: Taq DNA polymerase, P fu DNApolymerase, T4DNA polymerase, T th DNA polymerase… nhưng phổ biến là Taq DNA polymerase Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermophilus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ biến tính DNA (92 - 94oC)
Taq DNA polymerase có hoạt tính ở dãi nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra
Các deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP)
Gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu tham gia tạo mạch DNAmới Nồng độ dNTP trong khoảng 20 - 200 µM cho kết quả ổn định, trung thực vàchuyên tính Nồng độ tối ưu của dNTP thường 100 - 200 µM Tuy nhiên, ở nồng độ
dNTP thấp (10 - 100 µM) thì Taq DNA polymerase hoạt động chính xác hơn.