khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh trên giống lúa ml213 trồng trong dung dịch khoáng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM

VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG

DUNG DỊCH KHOÁNG

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

GS.TS Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư - 3102695

Lớp: Cử nhân Sinh học K36

Cần Thơ, 12/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

(ký tên) (ký tên)

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên)

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

Gs Ts Cao Ngọc Điệp, người thầy kính mến đã hết lòng dạy bảo, định hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Ths Văn Thị Phương Như là người luôn góp ý và sửa chữa những sai sót giúp tôi hoàn thiện bản thân

Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - Cán bộ phòng thí nghiệm và toàn thể các anh chị và các bạn phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô công tác tại khoa Khoa học tự nhiên đã hết lòng dạy dỗ và xây dựng nền tảng kiến thức vững chắc trong suốt gần 4 năm tôi học tập tại trường Đại học Cần Thơ

Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập Quách Quang Huy, Phạm Khánh Nguyên Huân và tập thể lớp cử nhân Sinh học Khóa 36 - những người bạn đường trên hành trình đi tìm tri thức - đã gắn bó, động viên và giúp đỡ tôi suốt 4 năm đại học cũng như trong quá trình tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp

Con xin chân thành cảm ơn gia đình đã nuôi dưỡng, bên cạnh động viên

và giúp đỡ trong những lúc con gặp khó khăn

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện để khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của 10 dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ đất vùng rễ của giống lúa ML213 trồng tại Phú Yên Hạt lúa giống được khử trùng bề mặt, xử lý nảy mầm trên môi trường agar bán lỏng (0,8% agar) trong 48 giờ Hạt nảy mầm (rễ mầm khoảng 1 cm) thì chủng lần lượt mười dòng vi khuẩn ML1, ML2,

lúa giống ở nghiệm thức đối chứng dương và đối chứng âm không chủng vi khuẩn) trong 3 giờ rồi trồng trong dung dịch khoáng Yoshida Thí nghiệm gồm

12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần trong

3 chai, mỗi chai chứa 200 ml dung dịch khoáng lỏng và 5 hạt lúa nảy mầm) Lấy chỉ tiêu chiều cao thân lúa, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 và ngày 28), trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây (ngày 28) ở từng nghiệm thức để xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của mười dòng vi khuẩn nội sinh Kết quả mười dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng

cố định đạm, hòa tan lân hữu hiệu so với nghiệm thức đối chứng âm Hai dòng

vi khuẩn ML1, ML8 có khả năng cố định đạm nổi bật nhất thể hiện qua chỉ tiêu chiều cao thân lúa và chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô toàn cây cao hơn có ý nghĩa so với đối chứng dương, ba dòng ML1, ML2 và ML5 là ba dòng có khả năng hòa tan lân thúc đẩy sự phát triển chiều cao thân lúa, tăng dài rễ, trọng lượng khô của rễ và toàn cây khô cao hơn cả đối chứng dương

Từ khóa: cố định đạm, giống lúa ML213, hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vii

TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Tổng quan về cây lúa 2

2.1.1 Vị trí phân loại 2

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3

2.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý 3

2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 6

2.1.5 Sơ lược về giống lúa ML213 7

2.2 Tầm quan trọng của nguyên tố N, P 8

2.2.1 Đạm (N) 8

2.2.2 Lân (P) 9

2.2.3 Thực trạng sử dụng phân hóa học ở nước ta hiện nay 10

2.3 Vi khuẩn nội sinh 11

2.3.1 Nguồn gốc 11

2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật 11

2.3.3 Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật 12

2.3.4 Khái quát về sự hòa tan lân khó tan bởi vi sinh vật 14

2.3.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa 16

2.3.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hiện nay 20

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

3.1.2 Địa điểm 23

3.2 Phương tiện nghiên cứu 23

3.2.1 Vật liệu 23

3.2.2 Thiết bị 24

3.2.3 Dụng cụ 26

3.2.4 Hóa chất 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 29

3.3.1 Chuẩn bị mẫu 29

3.3.2 Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan của 10 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213 30

3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi 31

3.3.4 Phương pháp thống kê, xử lý và phân tích số liệu 32

Chương 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 33

4.1 Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều cao cây lúa ML213 trồng trong dung dịch khoáng 33

4.2 Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên chiều dài rễ cây lúa ML213 trồng trong dung dịch khoáng 36

4.3 Ảnh hưởng của 10 dòng vi khuẩn lên trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây 39

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nền nông nghiệp Việt Nam từ

năm 2000-2010 10

Bảng 2 Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn 23

Bảng 3 Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof và ctv, 1997) 27

Bảng 4 Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976) 28

Bảng 5 Các nghiệm thức đạm 30

Bảng 6 Các nghiệm thức lân 31

Bảng 7 Chiều cao cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 33

Bảng 8 Chiều dài rễ của cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày và 28 ngày (cm) 36

Bảng 9 Trọng lượng khô của rễ, trọng lượng khô toàn cây của cây lúa trồng trong dung dịch khoáng giai đoạn 28 ngày (g) 39

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Oryza sativa L 2

Hình 2 Hình thái và cấu tạo một hoa lúa 4

Hình 3 Cấu tạo của một hạt lúa 6

Hình 4 Cấu trúc bậc 4 của enzyme nitrogenase 13

Hình 5 Quá trình tạo NH3 từ N2 thông qua H2N=NH2 14

Hình 6 Vi khuẩn Enterobacter 18

Hình 7.Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 19

Hình 8 Tủ cấy vi sinh vật vi sinh vật 24

Hình 9 Nồi khử trùng nhiệt ướt 24

Hình 10 Cân điện tử 25

Hình 11 Máy lắc mẫu 25

Hình 12 pH kế 25

Hình 13 Micropipette 26

Hình 14 Hạt lúa giống có và không chủng vi khuẩn 29

Hình 15 Hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn lên chiều cao thân lúa giai đoạn 14 ngày 35

TỪ VIẾT TẮT

IRRI: International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa gạo quốc tế) FAO: Food and Agriculture Organization (Tổ chức lương thực và nông

nghiệp)

pH: Power of hydrogen/ Potential of hydrogen (Chỉ số đo độ hoạt động của

các ion hydro (H+) trong dung dịch)

IAA: Indole Acetic acid

ĐC: Đối chứng

NT: Nghiệm thức

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng trên thế

giới với hơn một nửa dân số thế giới sử dụng lúa gạo làm nguồn lương thực chính, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam Tuy nhiên, diện tích canh tác lúa ngày càng bị thu hẹp Năm 2008, sản lượng lúa gạo thế giới đạt 685 triệu tấn so với 822 triệu tấn ngô và 695 triệu tấn sắn (khoai mì) nhưng vẫn còn hơn 1 tỷ người trên thế giới trên thế giới bị đói (FAO, 2010) Theo tính toán của Peng (năm 1999), đến năm 2030 sản lượng lúa của thế giới phải đạt 800 triệu tấn mới có thể đáp ứng được nhu cầu lương thực của con người

Để đạt năng suất cao, bên cạnh việc cải tiến và tạo ra các giống lúa có phẩm chất tốt, khả năng chống chịu cao, phân bón được xem là nhân tố quan trọng để quyết định năng suất cũng như chất lượng nông sản Tuy nhiên, việc lạm dụng phân bón hóa học cũng gây ra nhiều tác động xấu đến môi trường, đặc biệt có thể gây ngộ độc cho người và động vật khác Vì vậy, ứng dụng phân bón vi sinh vào sản xuất nông nghiệp là giải pháp tối ưu nhằm giảm chi phí đầu tư, tăng năng suất, khắc phục được những hạn chế của phân bón hóa học, đồng thời góp phần phát triển nông nghiệp sinh thái theo hướng bền vững

Hiện nay, việc nghiên cứu khả năng cố định đạm và hòa tan lân của vi

khuẩn nội sinh vẫn còn hạn chế Vì vậy, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ

ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG” được thực hiện 1.2 Mục tiêu của đề tài

Khảo sát khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh lên giống lúa ML213 trồng trong dung dịch Yoshida (IRRI, 1976)

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây lúa

Chi (genus): Oryza

Loài (species): Oryza sativa L

Hình 1 Oryza sativa L

(Nguyễn Ngọc Đệ 1998 Giáo trình cây lúa NXB Đại Học Cần Thơ)

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài lúa canh tác Hiện nay, loài lúa

được canh tác và sản xuất đại trà để cung cấp lương thực trên thế giới là Oryza

sativa L và Oryza glaberrima Steud Loài lúa Oryza sativa L phân bố chủ yếu

ở châu Á và có năng suất cao Loài lúa Oryza glaberrima Steud được canh tác ít

hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn

Cây lúa được canh tác từ vĩ tuyến 400 phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 530của bắc bán cầu, và được trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nước biển cho đến độ

cao hơn 2000 m trên mặt biển

2.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý

 Rễ lúa: thuộc hệ thống rễ chùm, rễ non màu trắng sữa, rễ trưởng thành có màu vàng nâu hoặc nâu đậm, rễ khi già có màu đen gồm hai loại:

 Rễ mầm (radicle) mọc ra lúc hạt nẩy mầm, thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm, dài khoảng 10-15 cm không ăn sâu, ít phân nhánh Rễ mầm sẽ chết sau 10-15 ngày và các rễ thứ cấp được mọc ra

 Rễ phụ (rễ bất định) mọc ra từ các mắt trên thân lúa, mỗi mắt có từ 5-25

rễ phụ, rễ phụ mọc dài, nhiều nhánh và nhiều lông hút Tại mỗi mắt có 2 vòng rễ: vòng rễ trên to khỏe, vòng rễ dưới nhỏ và kém quan trọng hơn

 Thân lúa (stem) gồm những mắt và lóng nối tiếp nhau Tại mỗi mắt có mang một lá, một mầm chồi và hai tầng rễ phụ Một đơn vị tăng trưởng của cây lúa gồm 1 lóng, 1 mắt, 2 vòng rễ, 1 lá và 1 chồi, có thể sống độc lập được

 Lá lúa có gân song song, mọc đối Lá trên cùng (lá cuối cùng trước khi trổ bông) gọi là lá cờ hay lá đòng Lá lúa gồm phiến lá (leaf blade), cổ lá (colar) và

bẹ lá (leaf sheath)

 Bẹ lá có nhiều khoảng trống nối liền các khí khổng ở phiến lá thông với thân và rễ, dẫn khí từ trên lá xuống rễ giúp rễ có thể hô hấp được trong điều

kiện ngập nước Bẹ lá có hình thìa, hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn

 Phiến lá là phần lá phơi ra ngoài ánh sáng, bộ phận quang hợp chủ yếu của cây lúa nhờ vào các tế bào nhu mô có chứa nhiều hạt diệp lục Phiến lá thẳng, hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp Phiến lá gồm 1 gân chính ở giữa và nhiều gân song song chạy từ cổ lá đến chót lá, chứa nhiều bó mạch lớn nhỏ và các bọng khí lớn phát triển ở gân chính, đồng thời ở hai mặt lá đều có khí khẩu

 Cổ lá (colar) là phần nối tiếp giữa phiến lá và bẹ lá Tại cổ lá có 2 bộ phận đặc biệt gọi là tai lá và thìa lá Tai lá (auricle) là phần kéo dài của mép phiến lá có hình lông chim uốn cong hình chữ C ở hai bên cổ lá Thìa lá (ligule) là phần kéo dài của bẹ lá, ôm lấy thân, ở cuối chẻ đôi

 Hoa lúa (spikelet) là hạt lúa khi chưa thụ phấn, thụ tinh Hoa lúa thuộc loại dĩnh hoa, gồm trấu lớn (dưới), trấu nhỏ (trên) tương ứng với dĩnh dưới và dĩnh trên, thuộc hoa lưỡng tính, tự thụ

Hình 2 Hình thái và cấu tạo một hoa lúa

(Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005

The biology and ecology of rice (Oryza sativa) in Australia.)

Ghi chú: a: bao phấn; f: chỉ nhị đực; st: nuốm nhụy cái; sty: vòi nhụy; o: bầu noãn; lo:

vảy cá (mày hoa; r: đế hoa; p: trấu trên (nhỏ); l: trấu dưới (lớn); g: tiểu dĩnh; g’: cuống hoa

 Bộ nhụy cái gồm một bầu noãn và vòi nhụy chẻ đôi với hai nuốm ở tận cùng để hứng phấn

 Bộ nhụy đực gồm 6 chỉ (tua nhị) mang 6 bao phấn, bên trong chứa nhiều hạt phấn

 Bông lúa: tùy vào từng giống lúa mà có thời gian trổ bông khác nhau, sau khi ra đủ số lá cây lúa trổ bông Bông lúa là loại phát hoa chùm gồm một trục chính mang nhiều nhánh gié bậc nhất, bậc hai và đôi có nhánh gié bậc ba

 Hạt lúa (trái lúa) gồm có: phần vỏ lúa và hạt gạo

 Vỏ lúa: Vỏ lúa gồm 2 vỏ trấu ghép lại (trấu lớn và trấu nhỏ) Ở gốc 2 vỏ trấu chổ gắn vào đế hoa có mang hai tiểu dĩnh Phần vỏ chiếm khoảng 20% trọng lượng hạt lúa

 Hạt gạo: là phần nằm trong vỏ lúa Hạt gạo gồm 2 phần:

 Phần phôi hay mầm (embryo): nằm ở góc dưới hạt gạo, chổ đính vào đế hoa, ở về phía trấu lớn

 Phôi nhũ: chiếm phần lớn hạt gạo chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh bột (phần gạo chúng ta ăn hàng ngày) Bên ngoài hạt gạo được bao bọc bởi một lớp vỏ lụa mỏng chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B (Nguyễn Ngọc Đệ 1998 Giáo trình cây lúa NXB Đại Học Cần Thơ)

Hình 3 Cấu tạo của một hạt lúa 2.1.4 Đặc điểm sinh trưởng

Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa là:

 Giai đọan tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng): Giai đoạn tăng trưởng bắt đầu từ khi hạt nẩy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa đòng Giai đoạn này, cây phát triển về thân lá, chiều cao tăng dần và ra nhiều chồi mới (nở bụi) Trong điều kiện đầy đủ dinh dưỡng, ánh sáng và thời tiết thuận lợi, cây lúa có thể bắt đầu nở bụi khi có lá thứ 5-6

 Giai đoạn giai đoạn sinh sản (sinh dục): Giai đoạn sinh sản bắt đầu từ lúc phân hóa đòng đến khi lúa trổ bông Giai đoạn này kéo dài khoảng 27-35 ngày, trung bình 30 ngày và giống lúa dài ngày hay ngắn ngày thường không khác nhau nhiều Đòng lúa hình thành và phát triển qua nhiều giai đoạn, cuối cùng thoát ra khỏi bẹ của lá cờ: lúa trổ bông

Dầy Ngang

 Giai đoạn chín: Giai đoạn chín bắt đầu từ lúc lúa trổ bông đến lúc thu hoạch Giai đoạn này trung bình khoảng 30 ngày đối với hầu hết các giống lúa ở vùng nhiệt đới Giai đoạn này cây lúa trải qua các thời kỳ sau:

 Thời kỳ chín sữa (ngậm sữa): các chất dự trữ trong thân lá và sản phẩm quang hợp được chuyển vào trong hạt Hơn 80% chất khô tích lũy trong hạt

là do quang hợp ở giai đoạn sau khi trổ Kích thước và trọng lượng hạt gạo tăng dần làm đầy vỏ trấu Hạt gạo chứa một dịch lỏng màu trắng đục như sữa, nên gọi là thời kỳ lúa ngậm sữa

 Thời kỳ chín sáp: hạt mất nước, từ từ cô đặc lại, lúc bấy giờ vỏ trấu vẫn còn xanh

 Thời kỳ chín vàng: hạt tiếp tục mất nước, gạo cứng dần, trấu chuyển sang màu vàng đặc thù của giống lúa, bắt đầu từ những hạt cuối cùng ở chót bông lan dần xuống các hạt ở phần cổ bông nên gọi là “lúa đỏ đuôi”, lá già rụi dần

 Thời kỳ chín hoàn toàn: hạt gạo khô cứng lại, ẩm độ hạt khoảng 20% hoặc thấp hơn, tùy ẩm độ môi trường, lá xanh chuyển sang màu trấu đặc trưng của giống

(Nguyễn Ngọc Đệ 1998 Giáo trình cây lúa NXB Đại Học Cần Thơ)

Theo Yoshida (1981) cho rằng thời gian sinh trưởng của một giống chuyên biệt cao theo vùng và theo mùa, trung bình có thời gian sinh trưởng khoảng 75-

250 ngày Yếu tố ảnh hưởng phổ biến đến thời gian sinh trưởng là phương pháp canh tác và lượng phân đạm bón vào

2.1.5 Sơ lược về giống lúa ML213

 Thời gian sinh trưởng từ 95 đến 100 ngày

 Chiều cao cây từ 80 đến 85 cm, chiều dài bông 21-23cm

 Số bông trên 1m2 có tới 400 đến 420 bông, hạt chắc trên bông là 85-90, thân gọn, cứng cây trung bình, năng suất rất cao có thể đạt trên 80 tạ/ ha/vụ, khả năng thích nghi rộng

HOA-KHAO-NGHIEM-MOT-SO-GIONG-LUA-MOI-235.htm ngày 9/8/2013)

(http://khuyennongpy.org.vn/news/Khuyen-nong-trong-trot/HUYEN-TAY-2.2 Tầm quan trọng của nguyên tố N, P

2.2.1 Đạm (N)

Đạm là một trong những nhân tố dinh dưỡng cần thiết cho sự tổng hợp tế bào của các enzyme, protein, chlorophyll, DNA và RNA Đạm có vai trò là chất tạo hình cây lúa, làm cho lá xanh tốt, gia tăng chiều cao cây, số chồi và kích

thước lá thân (Hayat, 2010) Do đó, dựa vào màu sắc và kích thước lá, chiều cao

và khả năng nở bụi của cây lúa, người ta có thể chuẩn đoán tình trạng dinh dưỡng

đạm trong cây

Cây lúa có thể hấp thu và sử dụng cả hai dạng đạm nitrat (NO3

-) và ammonium (NH4

(Nguyễn Ngọc Đệ 1998 Giáo trình cây lúa NXB Đại Học Cần Thơ)

 Thiếu đạm, trừ các lá non màu xanh, các lá già chuyển sang màu vàng nhạt, cây lúa lùn hẳn lại, nở bụi ít, chồi nhỏ, lá ngắn, hẹp, trở nên vàng và rụi sớm, cây lúa còi cọc không phát triển Giai đoạn sinh sản, nếu thiếu đạm cây lúa

sẽ cho bông ngắn, ít hạt, hạt nhỏ và có nhiều hạt thoái hóa

 Thừa đạm, cây lúa phát triển thân lá quá mức, mô non, mềm, dễ ngã, tán

lá rậm rạp, lượng đạm tự do trong cây cao, nên cây dễ nhiễm bệnh làm giảm

năng suất rất lớn đồng thời giảm thời gian bảo quản sau thu hoạch Đạm dư thừa

có khả năng tích lũy trong cây ở dạng NO3, NO2 gây độc mãn tính cho người sử dụng

(http://vst.vista.gov.vn/home/database/an_pham_dien_tu/nong_thon_doi_m oi/2004/2004_00013/MItem.2004-07-16.0249/MArticle.2004-07-

16.0917/marticle_view)

2.2.2 Lân (P)

Lân đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa vật chất và năng lượng, từ đó quy định chiều hướng, cường độ các quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật và cuối cùng là năng suất cây (Nguyễn Hữu Hiệp, 2012) Lân

là thành phần của phosphotit, acid nucleic, protein, phospholipid, coenzyme NAP, NATP và ATP, thành phần chủ yếu của amino acid Ngoài ra, lân có vai trò quan trọng trong việc phân chia tế bào, tạo thành chất béo và protein thúc đẩy việc tạo thành rễ, đặc biệt là rễ bên và lông hút Bên cạnh đó, lân có vai trò trong việc hình thành mô phân sinh, hạt và sự phát triển của quả, kích thích sự ra hoa, cải thiện chất lượng sản phẩm,đặc biệt là rau và cỏ làm thức ăn gia súc Trong cây, lân có thể vận chuyển từ các lá già về cơ quan non, cơ quan đang phát triển

để sử dụng vào việc tổng hợp chất hữu cơ mới Vì thế, hiện tượng thiếu lân thường biểu hiện ở lá già trước

 Triệu chứng thiếu lân: Đối với những cây họ lúa, khi thiếu lân cây đẻ nhánh ít, lùn lại, hạt lép nhiều Lá lúa thiếu lân thường có màu xanh đậm nhưng hiệu quả quang hợp kém, mọc thẳng hơn lá bình thường Thiếu lân trầm trọng thì

lá già trở nên màu vàng cam hoặc hơi tím đỏ do sự tích lũy sắc tố anthoxian trong

lá Sự thiếu lân thường xảy ra trên đất chua, đất nhiễm phèn, đất than bùn và đất kiềm Chất lân dễ hoà tan trong đất ngập nước hơn đất khô Trên đất bị thiếu lân,

mà bón đạm nhiều, sẽ càng làm cho năng suất lúa bị giảm

Cây non thường rất mẫn cảm với việc thiếu lân Lân bị thiếu trong thời kỳ này sẽ làm cho năng suất cây trồng giảm mạnh cho dù ở những giai đoạn sau có

bổ sung bao nhiêu lân đi nữa cũng khó mà phục hồi

(http://vst.vista.gov.vn/home/database/an_pham_dien_tu/nong_thon_doi_moi/20 04/2004_00013/Item.2004-07-16.0249/Article.2004-07-16.0917/marticle_view)

2.2.3 Thực trạng sử dụng phân hóa học ở nước ta hiện nay

Việt Nam được coi là nước sử dụng nhiều phân hóa học trong số các nước Đông Nam Á Tính từ năm 1985 tới nay, diện tích gieo trồng lúa ở nước ta chỉ tăng 57,7%, nhưng lượng phân bón sử dụng tăng tới 517%

và công nghệ tỉnh Bến Tre) Theo ông Lê Thanh Tùng, Phó phòng phụ trách vùng Nam Bộ (Cục Trồng trọt), mỗi năm, chỉ riêng phân ure Việt Nam thất thoát khoảng 1 triệu tấn so với tổng nhu cầu sử dụng là 2 triệu tấn, tương đương mất 10.000 tỉ đồng

nhiều chi khác nhau bao gồm Azospirillum, Burkholderia, Azotobacter, nghiệm thức Pseudomonas, Bacillus, nhờ vào sự đa dạng vi sinh vật cao nên vùng rễ là

nguồn quan trọng của vi khuẩn nội sinh (Hillel and Elsevier, 2005)

2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật

b) Sự tiếp cận (Attachment)

Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là lectins Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh

c) Sự xâm nhập hay xuyên thấu (Intrusion)

Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật thông qua nhiều con đường như từ lỗ tự nhiên (thủy khổng - hydathodes, lỗ khí khổng -stomata hoặc

bì khổng – lenticels), lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots), vi lỗ (micropores) hay vết thương do tác động vật lý (wounds)

Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá

d) Sự định cư (Settlement)

Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị

ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các

khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002)

2.3.3 Khái quát về sự cố định nitơ sinh học bởi vi sinh vật

a) Enzyme nitrogenase

Enzyme nitrogenase thuộc nhóm EC1 là Oxidoreductases, xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử, nhận điện tử (e-) và nhả H2 (hoặc nhận điện tử và nhả O2)

Hình 4 Cấu trúc bậc 4 của enzyme nitrogenase

Nitrogenase là một đa enzyme (phức hệ enzyme) xúc tác cho phản ứng cố định N2, khử N2 thành NH3 được cấu tạo bởi 2 protein Enzyme notrogenase

được điều khiển tổng hợp bởi một hệ thống gen nif có trong bộ genome của tế

bào vi khuẩn Cả 2 protein cấu tạo nên nitrogenase đều là phân tử nhỏ và đều có hoạt tính xúc tác:

 Protein sắt (protein Fe – dinitrogenase reductase) là protein nhỏ hơn có trọng lượng phân tử khoảng 60 kda, gồm 2 tiểu đơn vị giống nhau, chứa tâm oxy hóa - khử Fe4S4, có 2 vị trí gắn ATP

 Protein sắt – molibden (protein Mo – Fe – dinitrogenase) là protein lớn hơn, có trọng lượng phân tử khoảng 240 kda, có cấu tạo từ 2 tiểu đơn vị khác nhau chứa nhân Fe, Mo và tâm oxy hóa - khử

b) Cơ chế cố định đạm sinh học bởi vi sinh vật

Cố định đạm sinh học là một quá trình được thực hiện bởi vi khuẩn, trong

đó nitơ phân tử được biến đổi thành dạng nguyên tử, sau đó thành dạng đạm vô

cơ ammonia Cuối cùng, vi khuẩn sẽ chuyển hóa một phần thành dạng hữu cơ acid amin cho bản thân vi khuẩn (Cao Ngọc Điệp, 2011)

N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP 2NH3 + H2 +16ADP + 16Pi

Cơ chế hóa sinh của quá trình cố định đạm N2: enzyme nitrogenase có cấu tạo bởi 2 protein: 1 protein Fe và 1 protein Mo-Fe Phản ứng cố định xảy ra theo trình tự protein Fe sẽ khử và cung cấp điện tử trước để cung cấp điện tử trong ferredoxin Kế đến, protein Mo-Fe khử và cung cấp điện tử đến N2 để tạo thành NH=NH Trong 2 chu kỳ tiếp theo cũng đòi hỏi cung cấp điện tử để tạo ra

H2N=NH2 từ NH=NH và cuối cùng tạo NH3 từ H2N=NH2

(Nguyễn Hữu Hiệp 2009 Bài giảng vi sinh học môi trường Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học Đại học Cần Thơ)

Hình 5 Quá trình tạo NH 3 từ N 2 thông qua H 2 N=NH 2

2.3.4 Khái quát về sự hòa tan lân khó tan bởi vi sinh vật

Trong đất, lân tồn tại dưới hai dạng là lân vô cơ (tricalcium phosphate,

dicalcium phosphate, hydroxyapatite) và lân hữu cơ Mặc dù trong đất thường

chứa một lượng lớn lân tổng (hiện diện ở mức 400-1200 mg/kg đất), nhưng cây chỉ hấp thu lân ở dạng hòa tan như HPO4

 Hòa tan lân vô cơ: Theo Yahya và Azawi (1989) nhận thấy những vi khuẩn hòa tan được lân là nhờ các enzyme và các acid hữu cơ (acid gluconic, acid oxalic, acid citric, acid monolic và acid 2-ketogluconic) có khả năng hòa tan

các hợp chất khó tan Tuy nhiên, các vi khuẩn này sử dụng các acid hữu cơ tiết ra

từ rễ cây vì thế có thể gián tiếp ức chế sự hòa tan lân và các nguyên tố bất định

khác như Fe và Mn (Mukerji et al., 2006)

Đa số các vi sinh vật phân giải phosphore đều sinh ra CO2 trong quá trình sống, CO2 sẽ phản ứng với H2O có trong môi trường tạo thành H2CO3, H2CO3 sẽ phản ứng với phosphate khó tan tạo thành phosphore dễ tan theo phương trình:

Ca3(PO4)2 + 4H2CO3 + H2O => Ca(H2PO4)2 + H2O+ 2Ca(HCO3)2

sẽ phản ứng với H+ tạo thành HNO3 Sau đó HNO3 sẽ phản ứng với muối phosphate khó tan tạo thành dạng dễ tan

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 => Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2

Các vi khuẩn sulphate hóa cũng có khả năng phân giải sulphate khó tan do

sự tạo thành H2SO4 trong quá trình sống

Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 => Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4

Đa số các vi sinh vật phân giải phosphore vô cơ trong quá trình sống đều làm giảm pH của môi trường Gần đây một số nhà khoa học đã tìm ra một số chủng vi khuẩn phân giải lân mà trong quá trình nuôi cấy không làm giảm pH

của môi trường Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải mạnh là Bacillus

megatherium, Bacillus butyricus, Bacillus mycoides, Pseudomonas radiobacter,

nghiệm thức Pseudomonas gracilis…trong nhóm nấm thì có Aspergillus niger có

khả năng phân giải mạnh nhất Ngoài ra một số xạ khuẩn cũng có khả năng phân giải lân vô cơ

(Lê Quốc Tuấn 2009 Giáo trình Vi sinh vật môi trường NXB Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh.)

 Hòa tan lân hữu cơ: cơ chế của sự hòa tan là nhờ vào các phosphatases (hay phosphohydrolases) do vi khuẩn tiết ra Các phosphohydrolases là nhóm

acid hoặc bazơ Bởi vì hầu hết các loại đất có pH từ acid đến trung tính nên các phosphohydrolases acid có vai trò quan trọng Không giống với phosphohydrolases bazơ, các phosphohydrolases acid thể hiện hoạt tính xúc tác đặc trưng ở giá trị pH acid đến trung tính Các enzyme này thủy giải các liên kết phosphoester hoặc phosphoalhydride (Rodríguez, 1999 và Stefan, 2012)

2.3.5 Các nhóm vi khuẩn nội sinh cây lúa

a) Vi khuẩn Pantoea agglomerans

Pantoea agglomerans là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae Pantoea agglomerans là vi khuẩn nội sinh quan trọng trong cây lúa mì và cũng được phân

lập từ thân của khoai tây, hạt lúa, lá của các cây thuộc họ cam quýt Nhiều nghiên

cứu đã chứng minh tiềm năng của Pantoea sp có khả năng tạo nên sự kích

kháng và chống các vi sinh vật gây bệnh cho cây Thêm vào đó, vi khuẩn

Pantoea sp có thể kích thích sự sinh trưởng bằng cách cố định đạm, hòa tan lân

và tạo ra các kích thích tố tăng trưởng

(http://aem.asm.org/content/78/21/7511.full, ngày 01.12.2013)

Pantoea agglomerans YS19 thể hiện hoạt động cố định đạm trong môi

trường thiếu đạm, tạo ra bốn loại phytohormones (indol-3-acetic acid, abscicis acid, gibberellic acid và cytokinin) trong môi trường Luria-Bertani, và có thể tăng khối lượng/sinh khối của cây mạ (Hironobumano và Hisaomorisaki)

b) Vi khuẩn Bacillus megaterium

Vi khuẩn Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, hình que, hiếu khí

nhưng có thể phát triển trong điều kiện yếm khí khi cần thiết, có thể hình thành bào tử

Theo nghiên cứu của Fernando et al (2005), Bacillus megaterium được phát hiện là vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê Aravind et al (2009) cũng phát hiện vi khuẩn Bacillus nội sinh trong cây tiêu, đặc biệt dòng IISRBP 17 được xác

định là Bacillus megaterium có hoạt tính mạnh chống lại Phytothora capsici, một

loại nấm gây ra bệnh thối rễ

Bacillus megaterium có thể hình thành acid lactic trong quá trình sống để

phân giải lân vô cơ (Ca3(PO4)2 và bột apatit) và hợp chất lân hữu cơ Vì vậy,

Bacillus megaterium thường được ứng dụng làm phân vi sinh

(Lê Quốc Tuấn, 2009)

c) Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, đường

kính khoảng 1 m, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Jesus,

2004) Vi khuẩn Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí

hoặc hiếu khí nhưng trong điều kiện ít oxy thì phát triển tốt nhất Trong môi trường nuôi cấy chúng tạo khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Jesus, 2004)

Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định

đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ của nhiều loại cây như bắp, lúa mì, cà phê, lúa (Scarpella, 2003) Người ta tìm thấy được

khoảng 30 loài Burkholderia (Coenye và Vadnamme, 2003) bao gồm vi khuẩn cố

định đạm trong đất, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây, gây bệnh ở người

và cây trồng (Tipper và Meegan, 1998)

Vi khuẩn Burkholderia còn được tìm thấy ở khóm, chuối (Weber và ctv., 1999) Loài Burkholderia vietnamiensis tìm thấy trong rễ lúa trồng ở miền Nam Việt Nam (Van et al., 2000; Gillis et al., 1995) Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng loài Burkholderia cepacia cộng sinh ở rễ bắp trồng ở Châu Âu, rễ lúa và đậu trồng ở Úc (Balandereau et al., 2001) giúp cây phát triển nhanh tăng năng suất (Chiarini et al., 1998) tăng khả năng kháng bệnh, giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng (Daubaras et al., 1996) Người ta tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn

Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi

khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây

Thí nghiệm ở lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày

chủng giúp tăng khả năng đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt lá tăng 30%, năng suất lúa tăng 13-22% Thí nghiệm cũng cho thấy lúa được chủng

Burkholderia vietnamiensis và lúa trồng ngoài đồng bón phân đạm 25-30kg N/ha

thì năng suất tương đương nhau (Van et al., 2000) Ngoài ra, dòng Burkholderia

phymatum có khả năng tổng hợp IAA (Vandamme et al., 2002)

d) Vi khuẩn Enterobacter

Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ– Proteobacteria, hầu hết là vi

khuẩn Gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc Một số loài của

vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng

cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật

Hwangbo et al (2003) đã phân lập từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên được loài Enterobacter intermedium có khả năng hòa tan các phosphate khó

tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất ketogluconic acid

2-Hình 6 Vi khuẩn Enterobacter

and-Although-it-Is-Part-of-the-Normal-Flora-Posters_i9006027_.htm)

(http://www.allposters.com/-sp/Enterobacter-Is-Highly-Motile-Bacteria-e) Vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở

cực nên bơi tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử , sống tự do, hiện diện khắp nơi như trong đất, nước, thực vật, động vật, một số làm hư thực phẩm Vi

khuẩn Pseudomonas có khả năng hô hấp hiếu khí hay kỵ khí trong môi trường không có oxy Nhiệt độ thuận lợi để Pseudomonas phát triển là 30 – 37oC, tuy

nhiên một số chủng Pseudomonas lại có thể sống ở 400C Một vài chủng có thể

tạo huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254nm

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh những loài thuộc giống vi

khuẩn Pseudomonas spp có khả năng cố định đạm như Pseudomonas diminuta,

Pseudoflava, Pseudomonas putida, Pseudomonas saccharophila, Pseudomonas

(Döbereiner và Pedrosa, 1987)

Hình 7.Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

(http://www.muski.com/muski_report.htm)

Môi trường sử dụng để nuôi cấy Pseudomonas trong phòng thí nghiệm là môi trường King B Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong

sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở

một số loài như Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas

syringae Một số chủng Pseudomonas hòa tan lân ở dạng khó tan thành dạng dễ

tan giúp cây trồng hấp thụ tốt như Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas

putida, Pseudomonas chlororaphis Theo Cao Ngọc Điệp (2005), khi chủng Pseudomonas spp lên lúa cao sản giúp gia tăng năng suất lúa từ 20,36 đến

37,02% so với đối chứng âm

2.3.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh hiện nay

Hiện nay, nhiều giống vi khuẩn nội sinh được tìm ra như: Azoarcus,

Herbaspirillum… ở các cây lương thực, cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ

Các nhà khoa học tập trung nghiên cứu các dòng vi khuẩn nội sinh có các đặc tính tốt như giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây bằng cách tổng hợp kích

thích tố auxin (IAA) (Barbieri et al., 1986), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng nhiều nguồn bệnh khác nhau của cây (Fashey et al., 1991; Bandara et al., 2006), cố định nitơ trong không khí (Xu et al., 1998), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al.,

2007) Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa

các chất trong các cây còn non (Rovira et al., 1983) vi khuẩn nốt rễ sống trong

rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et

al., 2000) Chaintreuil et al., (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống

trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc

từ những cây điên điển (Sesbania spp.) mọc chen lẫn với cây lúa hoang Năm,

1980, Berg nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh ở cây mía

giúp tăng cường hoạt tính của enzyme nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng hợp đạm của cây

Ở Thụy Điển, tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi các

vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984)

Ở Nhật, xác định được các vi khuẩn nội sinh Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbelatagy et al., 2001) Tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa,

kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho

cây (Verma et al., 2001)

Ở Mỹ, nghiên cứu ở 4 loại cây trồng (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì)

và 27 loại cỏ tự nhiên khác nhau trong 6 năm để xác định được 15 giống vi khuẩn nội sinh: Agrobacterium, Bacillus, Bradyrhizobium, Erwinia, Cellulomonas, Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia,

Xanthomonas (Zinniel et al., 2002), trong đó số vi khuẩn Gram dương xấp xỉ

bằng số vi khuẩn Gram âm

Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau, vi khuẩn nội sinh

Gluconacetobacter diazotrophicus được xác định là có khả năng cố định đạm

nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2005)

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã được tiến hành khá nhiều những năm gần đây Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh

trong các loài cây ở Việt Nam như Nguyễn Thị Thu Hà et al (2008) đã phân lập

được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi, Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang

Tại Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học – Đại học Cần Thơ,

Cao Ngọc Điệp đã phân lập hơn 44 dòng vi khuẩn Azospirillum từ lúa hoang, lúa

mùa và lúa cao sản tại một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Năm 2007, Cao

Ngọc Điệp đã phân lập được vi khuẩn Azospirillum lipoferum từ lúa mùa ở Đồng

bằng sông Cửu Long (Cao Ngọc Điệp, Phạm Thị Khánh Vân, Lăng Ngọc Dậu

2007 Phát hiện vi khuẩn nội sinh Azospirillum lipoferum trong các giống lúa mùa (Oryza sativa L.) trồng ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam)

Năm 2008, Nguyễn Hữu Hiệp phân lập được một số dòng vi khuẩn

Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía

trồng tại huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, Tỉnh Sóc Trăng

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Giống lúa ML213 tại tỉnh Phú Yên

Mười dòng vi khuẩn do ThS Văn Thị Phương Như, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Đại Học Cần Thơ phân lập, lưu trữ và cung cấp

Bảng 2 Tên khoa học của 10 dòng vi khuẩn

Ký hiệu Tên khoa học của vi khuẩn (tương đồng 99%)

ML10 Pantoea agglomerans strain BJCP3

 Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)

 Cân điện tử Sartorius (Đức)

 pH kế Orion 420A (Mỹ)

 Máy chụp hình Sony

Hình 8 Tủ cấy vi sinh vật vi sinh vật Hình 9 Nồi khử trùng nhiệt ướt

Hình 10 Cân điện tử Hình 11 Máy lắc mẫu

Hình 12 pH kế

3.2.4 Hóa chất

a) Khử trùng mẫu

Cồn 70%, hypochloride 1%, hydrogen peroxide 3%, nước cất vô trùng

b) Môi trường nhân mật số vi khuẩn

Bảng 3 Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof và ctv, 1997)

Bromthymol blue 0.5% trong KOH 0.2N 2ml

Hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc

c) Môi trường trồng lúa

Bảng 4 Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976)

Hóa chất Lượng cần

(g/4l)

Lượng stock cần cho 1 lít môi trường (ml/l)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

số vi khuẩn đạt 109 tế bào/1ml bằng phương pháp đếm sống

 Chủng vi khuẩn vào lúa

Hạt lúa nảy mầm (rễ mầm khoảng 1 cm) được chủng vi khuẩn (109 tế bào/ml) trong 3 giờ (hạt lúa giống ở các nghiệm thức đối chứng dương và đối

chứng âm không chủng vi khuẩn)

Hình 14 Hạt lúa giống có và không chủng vi khuẩn

3.3.2 Đánh giá hiệu quả cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan của 10 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213

Thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi chai chứa 200 ml dung dịch khoáng và cấy 5 hạt lúa nảy mầm vào dung dịch khoáng) Sau đó, dùng giấy bọc kín bình môi trường, không cho ánh sáng xuyên qua môi trường trồng lúa

3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

Khảo sát các chỉ tiêu chiều cao cây, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21

và ngày 28), trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô toàn cây (ngày 28)