Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô (bắp) (Zea mays L.) trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ

Tiến hành nhận diện các dòng này thông qua trình tự gene 16S rRNA bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và công cụ tin sinh học và khảo sát thêm các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật k

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ NGỌC THANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN TRONG ĐẤT

VÙNG RỄ VÀ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY NGÔ

(BẮP) (Zea mays L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM

VÙNG ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

Mã số 62 42 01 07

Cần Thơ, 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐẶNG THỊ NGỌC THANH

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN

CỐ ĐỊNH ĐẠM, HÒA TAN LÂN TRONG ĐẤT

VÙNG RỄ VÀ VI KHUẨN NỘI SINH CÂY NGÔ

(BẮP) (Zea mays L.) TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM

VÙNG ĐÔNG NAM BỘ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành VI SINH VẬT HỌC

Mã số 62 42 01 07

Người hướng dẫn khoa học

Gs Ts CAO NGỌC ĐIỆP

Cần Thơ, 2017

i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận án này, tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ và hỗ trợ thật quý báu của nhiều người Xin được bày tỏ lòng tri ân chân thành và sâu sắc!

Lời cảm ơn đầu tiên xin được gửi đến Thầy tôi, Gs Ts Cao Ngọc Điệp Thầy

đã tận tình hướng dẫn và chỉ dạy các phương pháp tiếp cận khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án tiến sĩ

Chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học đã truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức quý báu, phục vụ quá trình nghiên cứu và viết các báo cáo khoa học

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học, Phòng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sài Gòn, Ban Lãnh đạo Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh

Chân thành gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã quan tâm, giúp

đỡ và động viên tôi

Xin cảm ơn gia đình anh Nguyễn Văn Đẹp đã hỗ trợ đất và công sức canh tác giúp tôi triển khai thực hiện các thí nghiệm ngoài đồng Chân thành cảm ơn các em sinh viên Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Sư phạm Khoa học Tự nhiên Trường Đại học Sài Gòn đã cộng tác cùng tôi trong thời gian thực hiện thí nghiệm

Đặc biệt gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Xuân Mỵ, người đồng hành cùng tôi, và các em Lê Duy Tín, Lê Minh Đức, Mai Thị Trà Giang đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình triển khai và thực hiện nghiên cứu

Sau cùng xin được gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, những người thân trong gia đình, chồng và các con đã hết lòng ưu ái, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc xa nhà

Đặng Thị Ngọc Thanh

ii

TÓM TẮT

Ngô là cây lương thực quan trọng và là nguồn cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi ở Đông Nam Bộ Đất xám là một trong bốn loại đất trồng ngô chính của vùng, nhưng do có đặc tính nghèo dinh dưỡng nên để duy trì sản lượng cao, người ta thường sử dụng một lượng lớn phân hóa học, đặc biệt là phân đạm Điều này đã góp phần làm gia tăng chi phí sản xuất, và gây tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người Hướng tới sự sản xuất ngô bền vững và giảm sự lệ thuộc vào phân bón hóa học, cần thiết phải tìm kiếm và khai thác lợi ích của các loại vi khuẩn có khả

năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật Do vậy, đề tài “Phân lập, tuyển chọn và

nhận diện vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô (bắp) (Zea mays L.) trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ” đã

được thực hiện nhằm mục tiêu tìm kiếm nguồn vi khuẩn bản địa có khả năng bổ sung hai nguyên tố quan trọng là N và P cho cây ngô

Sử dụng các loại môi trường không đạm (Burk’s, NFb, LGI) cùng với môi trường NBRIP chứa lân khó tan để phân lập các dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân Khảo sát định lượng bằng phương pháp so

màu giúp tuyển chọn các dòng có khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro

tốt Tiến hành nhận diện các dòng này thông qua trình tự gene 16S rRNA bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và công cụ tin sinh học và khảo sát thêm các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác như sự tổng hợp IAA và siderophore nhằm chọn ra một số dòng đưa vào thử nghiệm trên cây ngô trồng trong chậu

và ngoài đồng Kết quả thu được là 180 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 319 dòng vi khuẩn nội sinh có cả 2 khả năng cố định N và hòa tan P Năm mươi lăm dòng tuyển chọn có sự tương đồng trình tự 16S rDNA với các chủng vi khuẩn có trong GenBank (NCBI) với mức độ tương đồng từ 97% - 100%, trong

đó chủ yếu thuộc về các chi Burkholderia, Enterobacter và Bacillus Tất cả các

dòng tuyển chọn đều có khả năng sản xuất IAA, hơn thế dòng DDN10b còn có khả năng sản xuất siderophore Thử nghiệm khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực

vật in vivo cho thấy 2 dòng DDN10b (Burkholderia sp.) và VTN2b (Bacillus

subtilis) là các ứng viên có tiềm năng sử dụng như các chế phẩm phân bón vì

giúp tiết kiệm 25% phân N và P hóa học, đồng thời làm tăng năng suất thêm 11,7 - 24,9%

Các nghiên cứu đã được đề xuất là tiếp tục đánh giá các hoạt tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác của các dòng tuyển chọn, và tiếp tục đánh giá hiệu

iii

quả của 2 dòng DDN10b và VTN2b trên các giống ngô trồng tại các vùng trọng điểm của Đông Nam Bộ

Từ khóa: cố định đạm, đất xám, hòa tan phosphate, thúc đẩy tăng

trưởng thực vật, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn đất vùng rễ

on chemical fertilizers, it is necessary to seek out and exploit the benefits of plant promoting bacteria Therefore, the topic “Isolation, selection and identification of nitrogen fixation and phosphate solubilization rhizopheric

bacteria and endophytic bacteria from maize (Zea mays L.) grown on acrisol

soils of the Southeast” was made to target indigenous bacteria having the capability of supplementing two important macronutrients as nitrogen and phosphorus for maize

N-free media (Burk’s, NFb, LGI) and NBRIP medium containing insoluble inorganic phosphate were used to isolate bacteria having both nitrogen fixation and phosphate solubilization characteristics Quantitative measurement

by colorimetric methods helped to select the best isolates of nitrogen-fixing and phosphate-solubilizing bacteria Identification of these isolates based on 16S rDNA sequences by molecular biological techniques and bioinformatics tools and exploring further plant growth promoting features such as IAA synthesis and siderophore synthesis were employed to select some isolates for testing in potted and field maize

The result of isolation was a total of 180 rhizopheric and 319 endophytic isolates having the both abilities Fifty-five selected isolates had 16S rDNA sequences similarities with bacterial strains in data of GenBank (NCBI) with the values ranging between 97% and 100% of similarity in which the majority was

Burkholderia, Enterobacter and Bacillus genera All selected isolates are

capable of producing IAA; moreover the isolate DDN10b having siderophore producing ability The in vivo plant growth promoting experiments

demonstrated that two isolates of DDN10b (Burkholderia sp.) and VTN2b (Bacillus subtilis) are potentially candidates for using as fertilizer inoculants

because helping to save 25% of total standard mounts of N and P fertilizers and improved the yields of maize up further from 11.7% to 24.9%

The next suggested studies will be other plant growth promotion potentials evaluations as well as continue to assess the effectiveness of the two bacterial

v

strains DDN10b and VTN2b on maize planting in the key areas of the Southeast

Keywords: acrisols, endophytic bacteria, nitrogen fixation, phosphate

solubilization, plant growth promoting, rhizospheric bacteria

vi

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Ngày……… Nghiên cứu sinh

Đặng Thị Ngọc Thanh

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iv

LỜI CAM ĐOAN vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xvii

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3

1.5 Nội dung nghiên cứu 3

1.6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án 4

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

2.1 Hiện trạng sản xuất ngô trên đất xám vùng Đông Nam Bộ 6

2.1.1 Đặc điểm của đất xám vùng Đông Nam Bộ 6

2.1.2 Đặc điểm của vùng ngô Đông Nam Bộ 9

2.1.3 Tình hình sử dụng phân bón và thuốc trừ sâu ở Đông Nam Bộ 12

2.2 Ứng dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật: một cách tiếp cận tiềm năng của nông nghiệp bền vững 15

2.2.1 Khái niệm nông nghiệp bền vững 15

2.2.2 Mối quan hệ giữa thực vật với các loại vi khuẩn liên hiệp thực vật 17

2.2.3 Vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh thực vật và các khái niệm liên quan 18

2.2.4 Cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật 19

2.2.5 Sử dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật như các loại chế phẩm chủng cho cây trồng 26

2.3 Các nghiên cứu về vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô trên thế giới 30

2.3.1 Sưu tập và xác định đặc tính của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô 30

2.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô dựa trên trình tự gene 16S rRNA 38

viii

2.3.3 Dò tìm các gene nif và nifH trong nghiên cứu khuẩn vùng rễ và vi

khuẩn nội sinh BNF 45

2.3.4 Nghiên cứu khả năng ứng dụng của các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh trong canh tác ngô 46

2.4 Triển vọng và thách thức trong nghiên cứu và ứng dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở ngô và các cây trồng khác 49

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

3.1 Vật liệu thí nghiệm 53

3.1.1 Loại đất và các giống ngô thu mẫu 53

3.1.2 Các giống ngô trồng thử nghiệm hiệu quả PGP 53

3.1.3 Đất xám trong thí nghiệm trồng ngô 54

3.1.4 Phân bón hóa học và liều lượng 54

3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 55

3.3 Phương pháp nghiên cứu 55

3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu 55

3.3.2 Phân tích đặc tính dinh dưỡng của đất 58

3.3.3 Xác định mật số tế bào vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô và tìm hiểu sự tương quan tuyến tính với các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất 58

3.3.4 Phân lập các vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ cây ngô 62

3.3.5 Phân lập các vi khuẩn nội sinh cố định đạm và hòa tan lân từ thân và rễ cây ngô 63

3.3.6 Xác định hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và sự chuyển động của các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân 65

3.3.7 Xác định Gram của các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân 66

3.3.8 Bảo quản các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân 67

3.3.9 Khảo sát định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô 67

3.3.10 Tuyển chọn các dòng cố định đạm và hòa tan lân tốt từ bộ sưu tập các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô 72

3.3.11 Nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 72

3.3.12 Một số nghiên cứu “đặc tính hóa phân tử” trên các dòng vi khuẩn tuyển chọn 77

3.3.13 Khảo sát đặc tính sinh tổng hợp IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 79

ix

3.3.14 Khảo sát khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi

khuẩn tuyển chọn trên cây ngô lai một tháng tuổi trồng trong chậu 81

3.3.15 Khảo sát tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết ở cây ngô lai trồng trong chậu 84

3.3.16 Khảo sát tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên năng suất lý thuyết và năng suất thực thụ ở cây ngô lai trồng ngoài đồng 87

3.4 Xử lý dữ liệu 90

3.4.1 Đối với các thí nghiệm có sử dụng phép đo OD 90

3.4.2 Đối với các thí nghiệm giá hiệu quả PGP in vivo trên cây ngô 90

3.4.3 Đối với các phân tích Tin sinh học 91

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 92

4.1 Mối quan hệ giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân với đặc tính dinh dưỡng của đất xám trồng ngô vùng Đông Nam Bộ 92

4.1.1 Đặc tính dinh dưỡng của đất xám trồng ngô vùng Đông Nam Bộ 92

4.1.2 Mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô 95

4.1.3 Tương quan tuyến tính đơn giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô với các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất 96

4.2 Kết quả phân lập các vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ và trong thân, rễ cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ 98

4.3 Đặc tính hình thái khuẩn lạc và tế bào của các vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân được phân lập từ đất vùng rễ và từ thân và rễ cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ 102

4.4 Khả năng cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ 105

4.4.1 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô 105

4.4.2 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô 108

4.4.3 Đặc tính cố định đạm và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 111

4.5 Kết quả nhận diện các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 116

4.5.1 Kết quả định Gram và trích lục hồ sơ (profile) của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 116

4.5.2 Kết quả khuếch đại và giải trình tự một phần gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 117

x

4.5.3 Kết quả dò tìm dòng tương đồng trình tự gene 16S rRNA trong cơ

sở dữ liệu của GenBank 118

4.5.4 Kết quả tìm hiểu quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gene 16S rRNA của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 124

4.6 Kết quả của một số phân tích Sinh học phân tử trên các dòng vi khuẩn tuyển chọn 133

4.6.1 Quan hệ di truyền giữa các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh đã tuyển chọn 133

4.6.2 Kết quả dò tìm gene nifH ở các vi khuẩn nội sinh cây ngô 135

4.6.3 Đa dạng di truyền gene 16S rRNA của các vi khuẩn nội sinh cây ngô 137

4.7 Đặc tính sinh tổng hợp IAA và siderophore của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 139

4.7.1 Đặc tính sinh tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 139

4.7.2 Đặc tính sinh tổng hợp siderophore của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 143 4.8 Khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây ngô lai 1 tháng tuổi trồng trong chậu 146

4.9 Tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết ở cây ngô lai trồng trong chậu 149

4.10 Tác động của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên năng suất lý thuyết và năng suất thực thụ ở cây ngô lai trồng ngoài đồng 161

4.11 Thảo luận thêm về khả năng an toàn sinh học và hiệu quả kinh tế khi sử dụng các dòng vi khuẩn tuyển chọn trong canh tác và sản xuất ngô lai giống Wax48 174

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 178

5.1 Kết luận 178

5.2 Đề xuất 179

TÀI LIỆU THAM KHẢO 180

PHỤ LỤC

xi

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô ở các tỉnh

thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010 9

Bảng 2.2: Một số khoản đầu tư cho canh tác ngô ở các vùng sinh thái nông nghiệp theo điều tra của IFAD-CIMMYT, năm 2001 14

Bảng 2.3: Các dạng PGPR và cơ chế hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật 28

Bảng 3.1: Công thức môi trường Burk’s 59

Bảng 3.2: Công thức môi trường NBRIP 60

Bảng 3.3: Công thức môi trường TSA 64

Bảng 3.4: Công thức môi trường LGI 64

Bảng 3.5: Công thức môi trường NFb 65

Bảng 3.6: Công thức các hóa chất dùng trong nhuộm Gram 66

Bảng 3.7: Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn NH4+ 70

Bảng 3.8: Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn P2O5 71

Bảng 3.9: : Công thức môi trường LB 73

Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR đối với vi khuẩn đất vùng rễ 74

Bảng 3.11: Thành phần phản ứng PCR đối với vi khuẩn nội sinh 75

Bảng 3.12: Thành phần thuốc thử Fe-HClO4 và nồng độ của đường chuẩn IAA 80

Bảng 3.13: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm chậu nhỏ (0,5 L) 83

Bảng 3.14: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm chậu lớn (8,0 L) 84

Bảng 3.15: Mô tả nghiệm thức và liều lượng phân NPK trong thí nghiệm ngoài đồng 89

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất xám trồng ngô và mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô tại 30 điểm thu mẫu 93

Bảng 4.2: Hệ số tương quan và phương trình hồi quy đơn giữa mật số vi khuẩn cố định đạm/hòa tan lân trong đất vùng rễ cây ngô với một số chỉ tiêu dinh dưỡng của đất 96

Bảng 4.3: Nguồn gốc và môi trường phân lập của 499 dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân 99

Bảng 4.4: Số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và số dòng vi khuẩn nội sinh tương ứng với khoảng nồng độ NH4+ đo được tại 4 thời điểm khảo sát 105

xii

Bảng 4.5: Số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và số dòng vi khuẩn nội sinh tương ứng với khoảng nồng độ phosphate hòa tan đo được tại 4 thời điểm khảo sát 108 Bảng 4.6: Các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô được tuyển chọn và kết quả định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân tương ứng 111 Bảng 4.7: Thông tin về các chủng có khả năng tương đồng cao nhất hiện

có trong GenBank, NCBI 119 Bảng 4.8: Đa dạng nucleotide trong trình tự gene 16S rRNA của các nhóm vi khuẩn nội sinh 138 Bảng 4.9: Kết quả định lượng khả năng sinh tổng hợp IAA của các dòng PAB đã tuyển chọn trong điều kiện không bổ sung và có bổ sung 100 mg/L trp 140 Bảng 4.10: Tóm tắt đặc tính PGP in vitro của 12 dòng PAB tuyển chọn 144 Bảng 4.11: Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn và các mức bón phân NPK trên cây ngô 1 tháng tuổi trồng trong chậu 146 Bảng 4.12: Ảnh hưởng của giống ngô và kiểu bón phối hợp hai dòng vi khuẩn tuyển chọn với các mức phân NP hóa học trên một số đặc tính sinh trưởng phát triển của giống ngô lai Wax48 và LVN10 trồng trong chậu ở thời điểm thu hoạch 150 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của giống ngô và kiểu bón phối hợp hai dòng vi khuẩn tuyển chọn với các mức phân NP hóa học trên một số yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết của ngô hạt 157 Bảng 4.14 A: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn và các mức phân NP hóa học trên một số đặc điểm sinh trưởng phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ngô giống Wax48 trồng ngoài đồng 162 Bảng 4.14 B: Ảnh hưởng của hai dòng vi khuẩn tuyển chọn và các mức phân NP hóa học trên một số đặc điểm sinh trưởng phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của cây ngô giống Wax48 trồng ngoài đồng (tiếp theo) 163 Bảng 4.15: Hiệu quả của các nghiệm thức phối hợp vi khuẩn và phân hóa học so với đối chứng sử dụng 100% phân hóa học 169

Hình 2.4: Các vi khuẩn nội sinh Pseudomonas putida trong quản bào

mạch gỗ của cây dương và trong vỏ rễ của cây đậu 32 Hình 2.5: Vòng halo trên các loại môi trường chứa lân khó tan 33 Hình 2.6: Phản ứng của IAA với thuốc thử của một số dòng vi khuẩn đất vùng rễ 35 Hình 2.7: Chỉ thị khả năng sản xuất siderophore trên môi trường thạch CAS và CAS lỏng 37 Hình 2.8: Khả năng kháng nấm bệnh Stenocarpella maydis của một số chủng vi khuẩn phân lập từ đất canh tác ngô ở Mexico 37 Hình 2.9: Vị trí tương đối của cặp mồi p515FPL và p13B trên gene 16S rRNA và kích thước sản phẩm khuếch đại khoảng 904 bp 40 Hình 2.10: Hai mươi ba chi vi khuẩn nội sinh ưu thế thường gặp ở 17 loại cây trồng trên thế giới 44 Hình 2.11: Hiệu quả thúc đẩy tăng trưởng thực vật của PGPR trên sự nảy mầm của hạt và trên cây ngô trồng trong chậu 20 ngày tuổi 48 Hình 3.1: Lưu đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 52 Hình 3.2: Bản đồ đất vùng Đông Nam Bộ và các vị trí thu mẫu 56 Hình 3.3: Quy trình pha loãng mẫu và đếm sống nhỏ giọt để xác định mật

số vi khuẩn 61 Hình 3.4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại gene 16S rRNA của vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô 75 Hình 3.5: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR để khuếch đại gene 16S rRNA của vi khuẩn nội sinh cây ngô 75

Hình 3.6: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gene nifH 78

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây trong chậu 0,5 L theo kiểu CRD 83 Hình 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây trong chậu 8,0 L theo kiểu CRD 86 Hình 3.9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng cây ngoài đồng theo kiểu lô phụ 88 Hình 4.1: “Đếm sống nhỏ giọt” để xác định mật số vi khuẩn cố định đạm trên môi trường Burk’s và mật số vi khuẩn hòa tan lân trên môi trường NBRIP 95

xiv

Hình 4.2: : Đồ thị hàm hồi quy tuyến tính của mật số vi khuẩn cố định đạm theo mật số vi khuẩn hòa tan lân 98 Hình 4.3: Màng mỏng xuất hiện sau 2 ngày nuôi cấy trong môi trường không đạm bán đặc NFb hoặc LGI và phát triển dày lên 101 Hình 4.4: Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn 102 Hình 4.5: Tỉ lệ % về các dạng hình thái khuẩn lạc thường gặp ở vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh 103 Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi điện tử quét tế bào của một số dòng vi khuẩn 104 Hình 4.7: Tỉ lệ % các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tương ứng với lượng đạm cố định được tại mỗi thời điểm khảo sát 106 Hình 4.8: Biểu đồ cột thể hiện số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có lượng đạm cố định đạt đỉnh tại mỗi thời điểm khảo sát 107 Hình 4.9: Tỉ lệ % các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh tương ứng với lượng phosphate hòa tan tại mỗi thời điểm khảo sát 109 Hình 4.10: Số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có lượng lân hòa tan đạt đỉnh tại mỗi thời điểm khảo sát 110 Hình 4.11: Lượng đạm cố định đo được theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn nội sinh tốt nhất 113 Hình 4.12: Lượng lân hòa tan đo được theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 6 dòng vi khuẩn nội sinh tốt nhất 114 Hình 4.13: Nguồn gốc về môi trường phân lập của các dòng PAB tuyển chọn 116 Hình 4.14: Kéo dây “String Test” và ảnh nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn Gram âm và Gram dương 117 Hình 4.15: Phổ điện di sản phẩm PCR 16S rDNA của một số dòng vi khuẩn đất vùng rễ và một số dòng vi khuẩn nội sinh cây ngô 118 Hình 4.16: Tỉ lệ % các taxon mà các dòng PAB tuyển chọn có sự tương đồng trình tự gene 16S rRNA 123 Hình 4.17: Cây phả hệ cho thấy vị trí tương đối của các dòng vi khuẩn đất vùng rễ đã tuyển chọn so với các chủng tương đồng có trong GenBank 125 Hình 4.18: Cây phả hệ cho thấy quan hệ di truyền về trình tự gene 16S rRNA của 25 dòng vi khuẩn đất vùng rễ cây ngô đã tuyển chọn 128 Hình 4.19: Cây phả hệ cho thấy vị trí tương đối của các dòng vi khuẩn nội sinh đã tuyển chọn so với các chủng tương đồng có trong GenBank 130 Hình 4.20: Cây phả hệ cho thấy quan hệ di truyền về trình tự gene 16S rRNA của 30 dòng vi khuẩn nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 131 Hình 4.21: Phổ điện di sản phẩm PCR 16S rDNA của một số dòng vi khuẩn đất vùng rễ với cặp mồi 8F và 1492R và với cặp mồi p515FPL và p13B 133

xv

Hình 4.22: Cây phả hệ cho thấy quan hệ di truyền về trình tự gene 16S rRNA của 5 dòng vi khuẩn đất vùng rễ và 30 dòng vi khuẩn nội sinh cây ngô đã tuyển chọn 134 Hình 4.23: Kết quả điện di sản phẩm PCR dò tìm gene nifH của các dòng

vi khuẩn nội sinh 136 Hình 4.24: Kết quả phân tích SNP và haplotype của các dòng vi khuẩn nội sinh đã tuyển chọn 137 Hình 4.25: Tỉ lệ % các dòng PAB có lượng IAA đạt đỉnh tại các thời điểm đo mẫu trong trường hợp không bổ sung và có bổ sung trp 141 Hình 4.26: Lượng IAA bình quân thu được của một số dòng vi khuẩn đất vùng rễ trong trường hợp không bổ sung và có bổ sung trp 142 Hình 4.27: Phản ứng tạo màu của một số dòng PAB trên môi trường thạch CAS ngay sau khi nhỏ giọt và ở 5 DAI 145 Hình 4.28: Dải chuyển màu của dòng DDN10b trên thạch đĩa PS-CAS ở 2 DAI và ở 4 DAI 145 Hình 4.29: Cây ngô 1 tháng tuổi thu được qua 10 nghiệm thức, trong đó cây được bón 100% NPK là tốt nhất 147 Hình 4.30: Hiệu quả của các dòng PAB đã tuyển chọn và các mức phân hóa học trên khối lượng thân lá tươi và khối lượng rễ tươi của cây ngô 1 tháng tuổi 148 Hình 4.31: Hiệu quả của các dòng PAB đã tuyển chọn và các mức phân hóa học trên khối lượng chất khô của cây ngô 1 tháng tuổi 148 Hình 4.33: Sự phối hợp 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn với 50% NP và 75% NP cho hiệu quả tương đương với đối chứng bón 100% NP trên chiều cao cây, chiều cao đóng bắp và khối lượng chất khô tổng số ở giống Wax48 152 Hình 4.34: Sự phối hợp 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn với 50% NP và 75% NP cho hiệu quả tương đương với đối chứng bón 100% NP trên chiều cao cây, chiều cao đóng bắp và khối lượng chất khô tổng số ở giống LVN10 153 Hình 4.35: Sự khác biệt về bộ rễ cây ngô giống Wax48 giữa các nghiệm thức bón 75% NP phối hợp vi khuẩn so với đối chứng bón 100% NP 154 Hình 4.36: Tác dụng của tổ hợp 2 dòng vi khuẩn tuyển chọn DDN10b và VTN2b trên bộ rễ cây ngô giống Wax48 155 Hình 4.37: Tác động của 5 nghiệm thức tốt nhất có sử dụng vi khuẩn trên một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của cây ngô 155 Hình 4.38: Bắp ngô giống LVN10 và Wax48 thu được từ các nghiệm thức 158 Hình 4.39: Hiệu quả của việc bón phối hợp 75% phân NP hóa học với hai dòng vi khuẩn tuyển chọn trên bắp ngô giống LVN10 và Wax48 159 Hình 4.40: Tác động của 4 nghiệm thức tốt nhất có sử dụng vi khuẩn trên các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất lý thuyết ngô hạt 160

xvi

Hình 4.41: Sự khác biệt giữa các nghiệm thức về chiều cao cây dưới ảnh hưởng của các mức phân NP hóa học 164 Hình 4.42: Sự khác biệt giữa các nghiệm thức về kích thước bắp ngô dưới ảnh hưởng của các mức phân NP hóa học 165 Hình 4.43: Sự khác biệt giữa các nghiệm thức về chiều cao cây dưới ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn tuyển chọn 167 Hình 4.44: Toàn cảnh một lô chính F3 sử dụng 75% mức phân NP nền 168 Hình 4.45: Kích thước bắp ngô của các nghiệm thức sử dụng các dòng vi khuẩn tuyển chọn kết hợp với 75% mức phân NP nền so với đối chứng 171 Hình 4.46: Ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn tuyển chọn khi phối hợp với 75% hoặc 100% mức phân NP nền trên NSLT và NSTT ngô hạt trong thí nghiệm ngoài đồng 172 Hình 4.47: Kích thước bắp ngô của các nghiệm thức sử dụng các dòng vi khuẩn tuyển chọn kết hợp với 100% mức phân NP nền so với các đối chứng không chủng vi khuẩn 174

xvii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

16S rRNA 16S ribosomal Ribonucleic Acid

AEFB Aerobic Endospore Forming Bacteria

AMF Arbuscular Mycorrhizal Fungi

ANOVA Analysis of Variance

ARA Acetylene Reduction Assay

ARDRA Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BNF Biological Nitrogen Fixation

CAS Chrome Azurol Sulfonate

CEC Cation Exchange Capacity

CFU Colony Forming Unit

CIMMYT International Maize and Wheat Improvement Center cmolc centimole of charge

CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide

DAI Days After Inoculation

DAPG 2,4-diacetylphloroglucinol

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DI De-ionized (water)

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribonucleic acid

EBI European Bioinformatics Institute

EDB Endophytic Diazotrophic Bacteria

EMBL European Molecular Biology Laboratory

ePGPR extracellular Plant Growth Promoting Rhizobacteria ESB European Soil Bureau

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

FAO Food and Agriculture Organization

FFP farmers' fertilizer practice

IAA Indole-3-acetic acid

ICM Improved crop management

IFAD International Fund for Agricultural Development Inc Incorporation

iPGPR intracellular Plant Growth Promoting Rhizobacteria IPNI International Plant Nutrition Institute

IPNS Integrated Plant Nutrition Systems

ISR Induction of Systemic Resistance

xviii

ITS Internal Transcribed Spacer

IUSS International Union of Soil Sciences

LB Luria & Bertani (personal names) medium

LGI Lipman-Goodale & Ivo (personal names) medium

LSD Least-Significant Difference

MSA Multiple Sequence Alignment

me milliequivalents

MES 2-morpholine ethanosulfonic acid

NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate medium NCBI National Center for Biotechnology Information

NFb “new” Fabio (personal names) medium

NPK phân đạm, lân, kali hóa học

NSLT Năng suất lý thuyết

NSTT Năng suất thực tế

OD Optical Density

OPV Open Pollinated Variety

PAB Plant Associated Bacteria

PCR Polymerase Chain Reation

PGP Plant Growth Promoting

PGPB Plant Growth Promoting Bacteria

PGPR Plant Growth Promoting Rhizobacteria

ppm parts per million

PQQ Pyrroquinoline quinine

PRA Participatory Rural Appraisal (surveys)

PSB Phosphate Solubilising Bacteria

PSM Phosphate Solubilising Microorganisms

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RCD Randomized Complete Design

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNS Reactive Nitrogen Species (chemical)

ROS Reactive Oxygen Species (chemical)

rpm rounds per minute

RRA Rapid Rural Appraisal (surveys)

SAR Systemic Acquired Resistance

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SEM Scanning Electron Microscopes

xix

SNPs Single Nucleotide Polymorphisms

SSNM site-specific nutrient management

SSU Small Subunit (ribosomal RNA)

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TCNNVN Tiêu chuẩn Nông nghiệp Việt Nam

Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane

TSA Trypticase Soy Agar medium

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Averages

VOC Volatile Organic Compound

v/v volume per volume

w/w weight per weight

ZSB Zinc Solubilising Bacteria

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, ngô (bắp) (Zea mays L.) là cây lương thực quan trọng và là

nguồn nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Việc sản xuất ngô đã tăng mạnh kể từ năm 1990 và dần trở thành một định hướng phát triển kinh tế khá ổn định đối với nông dân nhiều địa phương trong

cả nước (Thanh Ha et al., 2004, Nguyễn Đức Cường, 2010) Năm 2014, tổng

sản lượng ngô của cả nước ước đạt 5.191,7 nghìn tấn (Tổng cục Thống kê Việt Nam, 2014) Tuy vậy, mỗi năm nước ta vẫn phải bỏ ra khoảng nửa tỉ USD để nhập khẩu ngô hạt mới đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ (Nguyễn Đức Cường, 2010) Thách thức lớn đối với Việt Nam là làm thế nào để cung cấp đủ ngô cho một thị trường ngày một mở rộng nhưng vẫn đảm bảo gìn giữ môi trường và các

nguồn tài nguyên thiên nhiên (Thanh Ha et al., 2004)

Trong các giống ngô lai ở nước ta hiện nay có nhiều giống ngô ngắn ngày (60 – 98 ngày/vụ), thích hợp trồng thâm canh và có thể trồng ở mật độ dày (khoảng 53.000 – 71.000 cây/ha) Khi canh tác lâu dài các giống ngô này, đất trồng sẽ bị khai thác quá mức và dễ bị suy kiệt Bên cạnh đó, diện tích đất canh tác bình quân đầu người ở Việt Nam trong nửa sau thế kỷ XX đã giảm trung bình 1,1 – 1,4% mỗi năm (Phạm Văn Toản và Trương Hợp Tác, 2004) Như vậy, việc tăng sản lượng cây trồng ngày nay không chỉ dựa vào sự tăng diện tích đất canh tác mà chủ yếu là do tăng năng suất cây trồng, trong đó việc tăng cường phân bón cho cây là một yếu tố quan trọng Có thể nói “không có phân bón hóa học thì không thể có nền nông nghiệp thâm canh với năng suất cao” Thế nhưng bón phân không cân đối, không hợp lý sẽ gây tình trạng vừa thừa vừa thiếu, gây hiện tượng chai cứng, giảm độ phì, và thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất trồng, đồng thời còn gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe con người (Phạm Văn Toản và Trương Hợp Tác, 2004) Chính vì vậy, nhiều quốc gia gần đây đã quan tâm đặc biệt đến chiến lược nông nghiệp sinh thái, thân thiện và bền vững Người ta đã phát hiện được nhiều loài

vi khuẩn liên hiệp thực vật (Plant Associated Bacteria - PAB), bao gồm các vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh, có khả năng cải thiện sự tăng trưởng của thực vật theo nhiều cách Chúng có thể so sánh với các loại phân bón tổng hợp, thuốc trừ sâu và thuốc trừ cỏ nhưng lại có thể hỗ trợ cho việc duy trì tính bền vững trong năng suất cây trồng và sự an toàn của môi trường (Singh, 2013) Sự thúc đẩy tăng trưởng thực vật có thể trực tiếp thông qua cố định đạm sinh học (Biological Nitrogen Fixation - BNF), hòa tan phosphate, sản xuất

2

phytohormone, sản xuất siderophore, ức chế sinh tổng hợp ethylene nhằm đáp ứng với các stress vô sinh và hữu sinh, hay gián tiếp thông qua sự kiểm soát sinh học giúp bảo vệ cây khỏi sự ức chế tăng trưởng do mầm bệnh hoặc côn

trùng (Bhattacharya và Jha, 2012; Jha et al., 2013) Trên thế giới và ở Việt Nam

hiện nay, xu hướng phân lập, tuyển chọn và ứng dụng các loại vi khuẩn có ích này như là nguồn phân bón sinh học đã và đang đạt được các kết quả khả quan

Trong bối cảnh nêu trên, hướng nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ và vi khuẩn nội

sinh cây ngô (bắp) (Zea mays L.) trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ”

đã được thực hiện nhằm phát hiện nguồn vi khuẩn bản địa có khả năng bổ sung hai nguyên tố dinh dưỡng quan trọng cho cây ngô là N và P

Đông Nam Bộ vốn là một vùng ngô lớn trong bảy vùng sinh thái nông nghiệp của cả nước Năng suất ngô đạt 59,5 tạ/ha, xấp xỉ Đồng bằng sông Cửu Long (59,6 tạ/ha) và bằng 139,9% so với năng suất trung bình của cả nước (44,1 tạ/ha) (Tổng cục Thống kê Việt Nam, 2014) Ở Đông Nam Bộ, đất xám (acrisols) có diện tích 744.652 ha, chiếm gần 32% tổng diện tích tự nhiên của vùng Đất xám là một trong 4 loại đất trồng ngô chủ yếu nhưng do nghèo dinh dưỡng nên cần phải chú ý đầu tư phân bón để có thể đạt năng suất cao Tuy nhiên, theo Nguyễn Đức Khiển (2002), chỉ có 40 – 50% lượng phân đạm và không quá 30% lượng phân lân bón vào đất được cây trồng hấp thụ Trong khi

đó, nguồn đạm trong khí quyển dưới dạng N2 có thể xem là vô tận và trữ lượng lân có nguồn gốc từ phân bón hóa học tồn tại trong đất nông nghiệp dưới dạng

cố kết được cho là rất lớn Do vậy, các vi khuẩn có khả năng hòa tan lân và cố định đạm sinh học đóng một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất cũng như trong nông nghiệp sinh thái và phát triển bền vững

Hướng nghiên cứu này đã lựa chọn đất xám và cây ngô trồng trên đất xám làm nguồn phân lập, dò tìm và sưu tập các dòng vi khuẩn có các đặc tính quý với giả thuyết đặt ra là: trong một loại môi trường đất nghèo dinh dưỡng như vậy, để tồn tại một cách thích nghi, có thể các thực vật ở đây đã có mối quan hệ gắn bó với các vi khuẩn có khả năng chuyển hóa tốt các chất dinh dưỡng Các dòng vi khuẩn này, một khi được phát hiện, có thể được ứng dụng trong sản xuất phân bón vi sinh hay phân bón vi sinh chức năng chuyên dùng cho cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ Ngoài việc bổ sung các chất dinh dưỡng cho cây, chúng còn có khả năng cung cấp các đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật khác, từ đó góp phần làm giảm lượng phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, giảm chi phí canh tác và mở ra triển vọng sản xuất ngô bền vững,

an toàn sinh học và thân thiện với môi trường

3

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập, nhận diện và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân từ đất vùng rễ và nội sinh trong cây ngô trồng trên đất xám Đông Nam Bộ mà các dòng này có khả năng ứng dụng như các chế phẩm phân bón vi sinh cho cây ngô

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô có khả năng cố định đạm và hòa tan lân

Nghiên cứu được giới hạn trên đối tượng là các dòng vi khuẩn phân lập được từ 116 mẫu đất vùng rễ và các mẫu thân và mẫu rễ của 116 cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ được thu thập tại 30 địa điểm khác nhau của

17 huyện thuộc 6 tỉnh/thành trong thời gian từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2013

1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Việc thu mẫu và tiến hành phân lập, tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn có đặc tính tốt được tiến hành từ tháng 2/2013 đến tháng 8/2014 Việc đánh giá hiệu quả kích thích tăng trưởng thực vật của các dòng tuyển chọn trên cây ngô trồng trong chậu tiến hành từ tháng 1/2015 đến tháng 4/2015 và thí nghiệm ngoài đồng được tiến hành từ tháng 5/2015 đến tháng 7/2015 Các nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn được tiến hành tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật và Sinh hóa thuộc trường Đại học Sài Gòn và các phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và Sinh học phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Trường Đại học Cần Thơ Một số phân tích chuyên sâu được thực hiện bởi các cơ quan chuyên trách Các nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả kích thích tăng trưởng thực vật của các dòng tuyển chọn trên cây ngô trồng trong chậu và ngoài đồng được tiến hành tại vạt đất rộng khoảng 1.750

m2 trong tổng diện tích đất khoảng 3 ha thường trồng hoa màu của gia đình ông Nguyễn Văn Đẹp ở ấp 3, xã Phước Vĩnh An, huyện Củ Chi, Thành phố

Hồ Chí Minh

1.5 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu bao gồm các nội dung:

- Xác định các chỉ tiêu dinh dưỡng của đất xám tại nơi thu mẫu và tìm hiểu mối quan hệ giữa các chỉ tiêu này với mật số vi khuẩn cố định đạm/hòa tan lân

- Phân lập, làm thuần các dòng vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô có cả hai đặc tính cố định đạm và hòa tan lân trên các loại môi trường:

4

Burk’s/LGI/NFb không đạm (chọn lọc vi khuẩn cố định đạm) và NBRIP (chọn lọc vi khuẩn hòa tan orthophosphate)

- Đánh giá hoạt tính cố định đạm và hòa tan lân in vitro của các dòng vi

khuẩn thông qua các thí nghiệm định lượng

- Nhận diện, định danh và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng có các đặc tính tốt bằng phương pháp Sinh học phân tử và công cụ Tin sinh học kết hợp với một số mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã có

- Khảo sát thêm một số đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm và hòa tan lân tốt, bao gồm khả năng

tổng hợp IAA và siderophore nhằm chuẩn bị cho công tác đánh giá hiệu quả in

vivo trên cây ngô

- Tuyển chọn một số dòng tốt nhất để đánh giá hiệu quả kích thích tăng trưởng thực vật trên cây ngô con (1 tháng tuổi) trồng trong chậu đất, tiến đến chọn lọc để thu gọn nghiệm thức và đánh giá hiệu quả trên năng suất của cây ngô lai trồng trong chậu (1 vụ) và trồng ngoài đồng (1 vụ)

1.6 Đóng góp mới và ý nghĩa của luận án

Theo các tài liệu đã tham khảo, các nghiên cứu trong nước hiện nay hoặc chỉ phân lập và tuyển chọn ‘vi khuẩn nội sinh’, hoặc chỉ phân lập và tuyển

chọn ‘vi khuẩn đất vùng rễ’ Trong khi đó, Jha et al (2013) xếp cả hai đối tượng này vào chung nhóm ‘vi khuẩn liên hiệp thực vật’ và de Santi Ferrara et

al (2012) cho rằng cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật bởi cả hai nhóm này

là tương tự nhau Do vậy, việc kết hợp dò tìm, xác định đặc tính và nhận diện cùng lúc 2 đối tượng ‘vi khuẩn đất vùng rễ’ và ‘vi khuẩn nội sinh’ dựa trên giả thuyết về sự gần gũi trong nguồn gốc và quan hệ tương tác của chúng với cây chủ chính là một điểm mới của luận án Có thể tồn tại một dòng vi khuẩn nào

đó mà khi ở trong đất vùng rễ, chúng góp phần bổ sung dinh dưỡng cho cây qua các cơ chế hòa tan lân và các khoáng chất khác và khi ở điều kiện thích hợp, chúng có thể xâm nhập và phát tán đến các bộ phận của cây, cung cấp cho cây chủ những đặc tính quý khác như cố định đạm hay kích thích sinh trưởng bằng các phytohormone hoặc giúp cây kháng bệnh, v.v… Sau khi thực vật chết đi, tàn dư của chúng khi phát tán vào môi trường có thể đem theo các

vi khuẩn có ích này để bắt đầu một chu trình xâm nhiễm mới Thật vậy, sau khi thực hiện một số phân tích Sinh học phân tử và Tin sinh học xoay quanh trình tự gene 16S rRNA của một số dòng vi khuẩn tuyển chọn đã phát hiện mối quan hệ di truyền gần gũi của các dòng không phân biệt là đã được phân lập từ đất vùng rễ hay từ thân hoặc rễ cây ngô, thậm chí là các dòng này vốn được phân lập từ các nơi khá cách xa về mặt địa lý

5

Về mặt ý nghĩa lý luận, luận án đã khái quát được một số đặc tính chức năng và đặc tính phân tử của các vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây ngô, góp phần bổ sung vào cơ sở dữ liệu về lĩnh vực Nông học của vùng Đông Nam Bộ Kết quả đạt được là một bộ sưu tập gồm 180 dòng đất vùng rễ và

319 dòng vi khuẩn nội sinh cây ngô trồng trên đất xám vùng Đông Nam Bộ đã được đặc tính hóa về hình thái khuẩn lạc và tế bào cũng như khả năng cố định

đạm và hòa tan phosphate in vitro Trong đó, có 55 dòng có đặc tính tốt đã

được nhận diện dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA cũng như phân tích một

số đặc tính di truyền gene 16S rRNA và gene nifH Năm mươi lăm dòng này

cũng đã được xác định đặc tính sản xuất IAA và một số dòng đã được đánh giá

khả năng sản xuất siderophore in vitro cũng như khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo trên cây ngô ở cấp độ thí nghiệm trong chậu và ngoài

đồng

Về mặt ý nghĩa thực tiễn, trên cơ sở cho rằng vi sinh vật được phân lập

từ cây trồng và vùng đất bản địa sẽ đạt được trạng thái sinh trưởng tốt nhất và

có hiệu quả cao nhất khi được chủng trở lại loại cây trồng và vùng đất đó, cũng như có sự thân thiện với môi trường, một số dòng vi khuẩn đã được tuyển chọn để thử nghiệm bón trở lại cho cây ngô Qua đó, dòng vi khuẩn đất

vùng rễ DDN10b tương đồng với Burkholderia sp và dòng vi khuẩn nội sinh VTN2b tương đồng với Bacillus subtilis đã bộc lộ tiềm năng khai thác để chế

tạo phân bón vi sinh chuyên dùng cho cây ngô khi giúp tiết kiệm khoảng 25% phân N và P hóa học, đồng thời làm gia tăng năng suất ngô hạt thêm 10,0% – 24,9% trên cây ngô lai giống Wax48 trong các thí nghiệm ngoài đồng

6

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Hiện trạng sản xuất ngô trên đất xám vùng Đông Nam Bộ

Đông Nam Bộ trải dài từ 105o49’ đến 107o35’ kinh độ Đông và từ 10o20’ đến 12o17’ vĩ độ Bắc Đông Nam Bộ có 9 nhóm đất chính, trong đó đất xám có diện tích lớn thứ hai, gồm 744.652 ha, chiếm 31,75% tổng diện tích tự nhiên của vùng (Phạm Quang Khánh, 1995) Điều tra của Quỹ Phát triển Nông nghiệp Quốc tế (International Fund for Agricultural Development – IFAD) và Trung tâm Cải tiến Lúa mì và ngô Quốc tế (International Maize and Wheat Improvement Center – CIMMYT) vào năm 2001 cho thấy đất trồng ngô của vùng Đông Nam Bộ đa dạng nhất trong sáu vùng sinh thái nông nghiệp, bao gồm đất đen lộ sỏi, đất đỏ basalt, đất nâu đỏ, đất đỏ vàng, đất phù sa mới (ven sông suối), đất đầm lầy, đất sét đọng mùn gley, đất sét ít mùn và đất xám

(Thanh Ha et al., 2004)

2.1.1 Đặc điểm của đất xám vùng Đông Nam Bộ

Đất xám có danh pháp quốc tế là acrisols, một từ có nguồn gốc từ tiếng Latin ‘acris’, nghĩa tiếng Anh là ‘very acid’ Đây là loại đất hình thành do quá trình phong hóa mạnh diễn ra ở những vùng ấm và ẩm của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đất có bề mặt tích tụ các khoáng sét độ hoạt động thấp và có độ bão hòa base thấp Theo Cục Đất đai châu Âu (European Soil Bureau - ESB), đất acrisol nói chung nghèo các chất dinh dưỡng cần thiết cho cây, tích tụ nhiều nhôm và dễ bị xói mòn, sạt lở Đây là những mặt hạn chế chính khi sử dụng đất

xám cho mục đích canh tác nông nghiệp (Jones et al., 2005) Tuy gọi là đất xám

nhưng acrisol có thể có các màu vàng, đỏ cho đến nâu Đôi khi đất xám acrisol lại có hình thái phẫu diện giống loại đất podzol vàng-đỏ (red-yellow podzolic soil) của Indonesia Mô tả của Lê Huy Bá (2009) về hình thái phẫu diện mẫu đất xám trên phù sa cổ TB.16 a và TB 16b thu được ở Tân Châu, Tây Ninh cũng cho thấy các tầng đất từ 0 – 75 cm có các màu từ xám bạc, xám đến xám hơi nâu và loang lổ đỏ vàng, và từ độ sâu 76 – 120 cm, mẫu đất lại có màu nâu vàng đến nâu vàng sẫm Như vậy, tuy được gọi tên theo tiếng Việt là “đất xám” nhưng acrisol không nhất thiết phải có màu xám mà có thể mang các màu sắc khác nhau tùy theo tầng đất và các đặc tính phụ khác (Hình 2.1 A và 2.1 B)

7

Hình 2.1: Một phẫu diện đất xám trên phù sa cổ ở tỉnh Bình Dương, Việt Nam (A)

và một phẫu diện tự nhiên lộ ra do xói mòn của đất acrisol có màu đỏ vàng (B)

(Phạm Quang Khánh, 2011; Jones et al., 2005)

Tham chiếu mới đây của Tổ chức Nông-Lương Thế giới (Food and Agriculture Organization - FAO) (2015) đã mô tả các đặc tính cơ bản của acrisols Đây là loại đất có tầng đất cái (tầng B) cách mặt đất từ 100 cm trở lên Tầng này chứa sét và các khoáng chất lắng đọng như sắt, oxide nhôm và calcium carbonate Dung tích trao đổi cation (Cation Exchange Capacity – CEC) (trong NH4Oac 1 M, pH 7) đo ở độ sâu từ 50 cm trở lên của tầng đất cái

có trị số nhỏ hơn 24 cmol/kg sét Độ bão hòa các base hữu hiệu [gồm tỉ lệ (Ca+Mg+K+Na) trao đổi; các base trao đổi trong đệm NH4Oac 1 M (pH 7), Al trao đổi trong KCl 1 M] của tầng đất khoáng (từ tầng A đến tầng C) đo ở độ sâu

từ 50 – 100 cm luôn nhỏ hơn 50% Ngoài ra, đất xám có thể bao gồm các thuộc tính cơ bản như: ‘gleyic’ (từ gốc tiếng Nga ‘gley’, nghĩa tiếng Anh là ‘mucky soil mass’), khi đất có độ dày lớn hơn 25 cm và cách tầng đất mặt ≤75 cm;

‘ferralic’ (từ gốc tiếng Latin là ‘ferrum’ và ‘alumen’, tiếng Anh là ‘iron’ và

‘alum’), khi đất có lớp chứa nhôm và sắt cách mặt đất ≤150 cm; ‘haplic’ (từ gốc

Hy Lạp ‘haplous’, tiếng Anh là ‘simple’), khi đất bộc lộ được đặc tính điển hình; ‘plinthic’ (từ gốc Hy Lạp ‘plinthos’, tiếng Anh có nghĩa là ‘brick’), khi đất

có lớp chứa sét kết von cách mặt đất ≤100 cm Ngoài ra, còn có một số tính từ biểu thị các đặc tính bổ sung như ‘humic’ (từ gốc tiếng Latin là ‘humus’, tiếng Anh có nghĩa là ‘earth’) được dùng để chỉ loại đất có lượng carbon hữu cơ chiếm 1% trở lên (FAO, 2015) Bản đồ đất Việt Nam (2001) cho thấy đất xám ở nước ta có các thuộc tính cơ bản và các thuộc tính bổ sung như vừa kể Đất xám

ở Việt Nam bao gồm cả những loại đất xám thực sự và đất loang lổ đỏ vàng phát triển trên hệ tầng mẫu chất phù sa cổ, kể cả loại đất xám bị rửa trôi theo chiều ngang và theo chiều sâu làm tích tụ các oxide kim loại kiềm và kiềm thổ ở tầng thứ hai mà tên thường gọi là “đất bạc màu” Loại đất bạc màu điển hình

1, Quận 3, Tân Bình, Củ Chi (Thành phố Hồ Chí Minh); Gò Dầu, Trảng Bàng, Châu Thành, Dương Minh Châu, Hòa Thành, Bến Cầu, Tân Biên (tỉnh Tây Ninh), một số vùng của các huyện Châu Đức, Xuyên Mộc, Đất Đỏ (tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu) (Lê Huy Bá, 2009; Bản đồ Đất Việt Nam, 2001) Trên bản

đồ đất 1/250.000, đất xám được chia làm 3 đơn vị: Đất xám trên phù sa cổ (638.914 ha), đất xám đọng mùn gley (51.588 ha) và đất xám trên đá granite (54.150 ha) Đất xám trên phù sa cổ ở địa hình cao có thành phần cơ giới nhẹ, phân bố trên các địa hình đồi thoải, dễ thoát nước Đất xám trên phù sa cổ ở địa hình thấp có tầng sét loang lổ đặc trưng chạy suốt phẫu diện từ 30 – 150

cm, kết von cứng chiếm tỉ lệ nhỏ, chủ yếu là kết von dễ bóp vụn khi ẩm Đất xám trên phù sa cổ ở địa hình thấp và đọng nước có quá trình tích đọng hữu cơ tầng mặt nên còn được gọi là đất xám đọng mùn gley (Lê Huy Bá, 2009) Đất xám nói chung có thành phần cơ giới nhẹ (cát, cát pha) Đất xám trên phù sa cổ có tỉ lệ cấp hạt cát trung bình và mịn từ 40 – 45 %, cấp hạt sét chiếm

20 – 25% và gia tăng theo chiều sâu Chính vì vậy, khả năng giữ nước của đất xám nhìn chung là kém Dung trọng đất tầng mặt biến thiên từ 1,44 g/cm3 (đất rừng) đến 1,53 g/cm3 (đất trồng cao su) chứng tỏ đất có cấu trúc kém, dễ bị dí

dẽ Nhìn chung, tỉ lệ sét ở tầng thứ hai (20 – 45 cm) cao hơn tầng mặt, chứng

tỏ quá trình rửa trôi theo chiều sâu của đất xám trên phù sa cổ rất mạnh (Lê Huy Bá, 2009) Đất xám có tầng loang lổ và đất xám bạc màu có đặc tính chua: pHH2O từ 4,5 – 5, pHKCl xấp xỉ 4 CEC của đất xám rất thấp: 3,8 – 8,9 cmol/kg đất và <16 cmol/kg sét Đất xám có đặc tính nghèo dinh dưỡng: N tổng số từ 0,14 – 0,39%, P2O5 tổng số từ 0,051 – 0,087%, K2O tổng số từ 0,02 – 0,30% (tầng đất 0 – 25 cm), nghèo cả lân và kali dễ tiêu cũng như Ca2+ và

Mg2+ Kaolinite là khoáng sét chủ yếu của đất xám, loại khoáng này có khe hở giữa hai keo nhỏ (0,2 Å) và lực liên kết giữa các tinh tầng rất chặt nên khó trao đổi cation Chính vì vậy, dung tích hấp thu của đất xám rất thấp, thường từ 3,4 – 4,1, lại thêm hàm lượng mùn ở tầng mặt thấp và tỉ lệ sét thấp nên đất xám dễ

bị nghèo kiệt dinh dưỡng trong quá trình canh tác (Công Doãn Sắt và Đỗ Trung Bình, 1997; Lê Huy Bá, 2009)

Quá trình khoáng hóa chất hữu cơ trong đất xám rất mãnh liệt, có thể khoáng hóa hoàn toàn xác bã trong khoảng một năm ở điều kiện nhiệt độ là 35

9

– 36oC và ẩm độ là 80 – 85% Ngược lại, quá trình mùn hóa thường xảy ra rất chậm do hệ vi sinh vật tạo mùn cũng như các chất hữu cơ trung gian ít, hệ số mùn hóa chỉ 4 – 5% một năm Do mùn hóa chậm lại dễ bị rửa trôi nên tổng lượng mùn và acid mùn trong đất xám thường rất thấp Duy chỉ có loại đất xám đọng mùn gley ở địa hình thấp trũng, hứng nước từ các khu vực xung quanh xuống nên hàm lượng chất hữu cơ và đạm giàu hơn so với các loại đất xám khác, mùn có thể đạt 19,70% ở tầng đất 0 – 20 cm (Lê Huy Bá, 2009) Nhìn chung, đất xám ở Đông Nam Bộ thích hợp với nhiều loại cây trồng cạn như các loại cây lương thực, hoa màu, cây ăn quả, cây công nghiệp, trồng mới rừng và phát triển mô hình nông lâm kết hợp Tuy nhiên, do chất dinh dưỡng trong đất thường nghèo, lại thường bị rửa trôi trong điều kiện mưa nhiều nên nếu canh tác không đúng kĩ thuật, không kết hợp cây xanh che phủ, đốt bỏ tàn dư thực vật, bón phân mất cân đối, v.v… sẽ khiến đất bạc màu, chai cứng, lắng tụ nhanh, dí dẽ chặt, lãng phí một nguồn cơ chất hữu cơ góp và phần gây ô nhiễm môi trường (Moody và Phan Thi Cong, 2008; Lê Huy Bá, 2009)

2.1.2 Đặc điểm của vùng ngô Đông Nam Bộ

Vùng ngô Đông Nam Bộ có tổng diện tích gieo trồng là 80.000 ha và sản lượng đạt 475,7 nghìn tấn Trong đó, ba tỉnh có diện tích gieo trồng và năng suất cao nhất là Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tây Ninh (Bảng 2.1) (Tổng cục thống kê, 2014)

Bảng 2.1: Diện tích gieo trồng, năng suất và sản lượng ngô ở các tỉnh thành vùng Đông Nam Bộ, năm 2010 (Tổng cục thống kê, 2014)

(nghìn ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

60% còn lại phục vụ chăn nuôi tại nhà (Thanh Ha et al., 2004) Ở Đông Nam

Bộ, với diện tích nông trại trung bình là 1,0 ha và 5,7 nhân khẩu trong một nông

hộ, thu nhập đến từ buôn bán ngô chiếm 22% tổng thu nhập, 76% còn lại do các sản phẩm nông nghiệp khác và 2% thu nhập do các hoạt động ngoài nông nghiệp; so với ở Đồng bằng sông Cửu Long, một nông hộ có diện tích trung bình 1,3 ha và 5,7 nhân khẩu, các giá trị nêu trên lần lượt là 0,5%, 79,5% và

20% (Thanh Ha et al., 2004) Như vậy, thu nhập có từ buôn bán ngô ở Đông

Nam Bộ chiếm 28,21% tổng thu nhập từ nông nghiệp, cao gấp 45,14 lần so Đồng bằng sông Cửu Long (0,625%)

Nguồn giống ngô trồng ở Đông Nam Bộ khá đa dạng, từ các giống địa phương, giống thụ phấn tự nhiên (open pollinated variety - OPV) cho đến các giống ngô lai Tuy vậy, từ cuối thập niên 1990, do công nghệ ngô lai phát triển, các giống địa phương và OPV đã dần bị thay thế bởi các giống ngô lai thông thường như LVN10, DK888, LVN20 và một số giống thương mại do các công

ty sản xuất như Pacific, Bioseed và Cargill Thời điểm này, các giống ngô lai chiếm tới 89% diện tích gieo trồng Giống trồng được phổ biến nhất là LVN10

do hiệu quả cao Giống DK888 cũng được nông dân ưa chuộng vì tiềm năng năng suất nhưng có hạn chế là giá bán ra của ngô thành phẩm còn thấp Các giống ngô của công ty như Pacific, Bioseed ít được lựa chọn, chủ yếu do giá thành hạt giống còn cao, gấp 7 – 19 lần so với các giống địa phương và OPV

(Thanh Ha et al., 2004)

Do chế độ khí hậu và thủy văn như đã nêu trên, phần lớn vùng ngô Đông Nam Bộ canh tác nhờ mưa Diện tích canh tác ngô nhờ mưa chiếm đến 70% tổng diện tích canh tác Tại đây, ngô được trồng chủ yếu trong hai vụ: hè-thu và thu-đông Vụ hè-thu, từ cuối tháng 4 đến đầu tháng 8, thường cho năng suất cao Vụ thu-đông, từ đầu tháng 8 đến đầu tháng 11, thường trồng các giống ngô

ngắn ngày (Thanh Ha et al., 2004) Ngoài ra, trên các chân ruộng đảm bảo được

nước tưới, nông dân có thể trồng thêm vụ đông-xuân, từ tháng 12 đến tháng 3 năm sau, cũng cho năng suất khá Bên cạnh các vùng chuyên canh hai vụ ngô-ngô chiếm đến 70% tổng diện tích gieo trồng ngô, một số nơi còn áp dụng các biện pháp luân canh, xen canh để duy trì độ phì cho đất như luân canh đậu-ngô

11

(5%), hai vụ ngô và một vụ dưa (2,9%) hay xen canh ngô-đậu trong vườn cà phê (2%), cá biệt có vùng áp dụng thâm canh 3 vụ ngô/năm (0,1%) (Thanh Ha

et al., 2004) Gần đây, một số địa phương ở Đồng Nai mới bắt đầu áp dụng các

chính sách chuyển đổi cơ cấu cây trồng, trong đó có mô hình luân canh lúa-ngô, vốn phổ biến ở các vùng sinh thái nông nghiệp phía Bắc và vùng Đồng bằng sông Cửu Long

Ở những vùng đất cao, xói mòn và giảm độ phì của đất là hai trở ngại chính đối với năng suất ngô Điều tra của IFAD-CIMMYT (2001) cho thấy có nhiều nông dân biết đến các cách hạn chế xói mòn, ví dụ như trồng cây bao quanh ruộng, xen canh ngô trong vườn cà phê hay cây ăn trái, sử dụng đường đồng mức khi chuẩn bị đất, hay hạn chế cày xới và làm cỏ trên các vùng đất dốc, nhưng họ ít thực hành các biện pháp này vì cho rằng hiệu quả thu được

không đáng với công sức bỏ ra (Thanh Ha et al., 2004) Đối với việc tăng cường

dinh dưỡng cho đất, nhiều nông dân cũng biết cách thay vụ ngô thứ hai trong năm bằng một vụ đậu hay xen canh ngô với các cây trồng họ Đậu Họ cũng cho rằng việc sử dụng phân hữu cơ và vôi giúp tăng độ phì cho đất nhưng ngược lại, một số người cho rằng phân bón hóa học mới làm tăng dinh dưỡng cho đất Trong quá khứ, nhiều người dân tộc vùng cao ở Trung du và miền núi phía Bắc, Tây Nguyên và cả Đông Nam Bộ thường bỏ hoang đất sau một thời gian canh tác như một biện pháp cho đất nghỉ ngơi và tự phục hồi Ngày nay, với đà tăng dân số và giảm diện tích đất canh tác, điều này trở nên bất khả thi Như vậy, chính việc quản lý đất đai là một yếu tố quan trọng trong việc duy trì bền vững sản lượng ngô ở các vùng canh tác có địa hình cao, trong đó có Đông Nam Bộ

(Thanh Ha et al., 2004)

Trong 9 loại đất trồng ngô ở Đông Nam Bộ, có 4 loại đất chính, đó là: đất xám (gray soils), đất nâu đỏ (reddish brown soils), đất đỏ vàng (red-yellow soils), đất đen lộ sỏi (stony black soils) Hai loại đất xám (acrisols) thường được

sử dụng để trồng ngô ở Đông Nam Bộ là đất sét ít mùn (low-humic clay soil, theo cách gọi của nông dân) và đất xám điển hình (haplic/ferralic acrisols) Đất sét ít mùn có đặc tính giữ nước tốt nhưng độ phì thấp, dễ bị ngập úng khi mưa lớn, khó chuẩn bị đất và đòi hỏi nhiều phân bón Trong khi đó, đất xám điển hình thường thoát nước tốt, độ dày lớp đất canh tác cao, thích hợp cho các loại cây lâu năm có bộ rễ ăn sâu Mặt hạn chế của loại đất này là có độ phì thấp cho

đến trung bình và dễ bị xói mòn (Thanh Ha et al., 2004) Trung tâm Khảo kiểm

nghiệm giống cây trồng Trung ương (1999) cũng nhận định đất xám là loại đất thích hợp cho trồng ngô bởi các đặc tính có thành phần cơ giới nhẹ, dễ thoát nước và độ ẩm cây héo rất thấp Tuy vậy, vì độ phì của đất thấp nên khuyến nghị về phân bón cho ngô trồng trên đất xám và đất bạc màu (năng suất 6 – 8

12

tấn ngô hạt/ ha) là 333 – 400 kg urea, 935 – 1125 kg super phosphate, 375 – 450

kg KCl tương đương tỉ lệ N:P:K là 2:2:2,5 kèm theo 10 tấn phân chuồng Trong khi đó, tỉ lệ này ở các vùng đất phù sa được bồi hằng năm là 2:1:1, hoặc 2:1,5:1, đồng thời có thể không cần bón phân chuồng (Nguyễn Đức Cường, 2010)

2.1.3 Tình hình sử dụng phân bón và thuốc trừ sâu ở Đông Nam Bộ

Theo FAO (2009) (trích dẫn của Pasuquin et al., 2010), Việt Nam là một

trong 3 nước có diện tích trồng ngô lớn nhất Đông Nam Á, sau Indonesia và Philippines Chính vì vậy, ngay từ năm 2004, Viện Dinh dưỡng Thực vật Quốc

tế (International Plant Nutrition Institute - IPNI) đã tiến hành một dự án nghiên cứu nhằm đánh giá tiềm năng năng suất của các giống ngô trồng tại một số vùng ngô chính của 3 nước này cũng như để giới thiệu, phát triển và đánh giá hiệu quả của phương pháp Quản lý dinh dưỡng chuyên biệt theo vùng (site-specific nutrient management - SSNM), trong đó có đề xuất các xử lý ICM (Improved crop management - Quản lý mùa vụ cải tiến) như bón phân hóa học hợp lý, tăng mật độ cây trồng hoặc tăng cường bón phân chuồng và vôi Đông Nam Bộ là một trong 4 vùng sinh thái nông nghiệp được triển khai dự án, cùng với Đồng bằng sông Hồng, Tây Nguyên và Đồng bằng sông Cửu Long Điều tra cho thấy lượng phân bón NPK thực tế của nông dân (farmers’ fertilizer practice - FFP) ở nước ta bằng 104,83% so với khuyến cáo SSNM, trong khi ở Indonesia là 99,63% và ở Philippines là 63,89% Chi phí phân bón cho cây ngô ở Việt Nam

là 271 USD/ha, cao nhất trong 3 nước nên lợi nhuận thu được cũng thấp nhất (892 USD/ha) Ngoài ra, tỉ lệ N:P:K trong FFP cũng bộc lộ sự thiếu cân đối so với đề xuất SSNM Qua đó nhận thấy, nông dân Việt Nam có tập quán bón thừa đạm (166 so với 148 kg N/ha) nhưng lại thiếu kali cho cây ngô (78 so với 83 kg

K/ha) (Pasuquin et al., 2010)

Tiêu thụ phân bón hóa học ở Việt Nam đã tăng từ 155.000 tấn (N+P2O5+K2O) vào năm 1980 lên 560.000 tấn vào năm 1990, và 2.267.000 tấn vào năm 2000 So với thế giới, mức sử dụng phân bón (đơn vị kg N+P2O5+K2O/ha canh tác/năm) của Việt Nam trong 3 mốc thời gian nói trên lần lượt là 30,1%, 106,8% và 378,1% (Heffer, 2008 trích dẫn của Nguyễn Văn Bộ, 2013) Theo Phạm Văn Toản và Trương Hợp Tác (2004), không có phân bón hóa học thì không thể có nền nông nghiệp thâm canh với năng suất cao Thế nhưng, ở các nước đang phát triển với một nguồn cung hạn chế, việc nhập khẩu phân hóa học đại diện cho một khoản kinh phí lớn mà nông dân nghèo phải bỏ

ra (Khan et al., 2007) Chi phí sử dụng phân bón trên thế giới chiếm trên 30%

chi phí canh tác Riêng nước ta, chi phí này có khi chiếm hơn 50% (Võ Minh Kha, 2003) Tuy nhiên, không một loại phân nào có thể được thực vật hấp thụ hoàn toàn Chỉ có 40 – 50% lượng phân đạm và không quá 30% lượng phân lân

13

bón vào đất được cây trồng hấp thụ, số còn lại bị thất thoát do nhiều nguyên nhân (Nguyễn Đức Khiển, 2002) Thật sự, bản thân các loại phân bón vô cơ thường là không có hại Những ảnh hưởng xấu của phân vô cơ chủ yếu là do việc bón phân chưa được phối hợp cân đối (Võ Minh Kha, 2003) Bón phân không cân đối, thiếu hợp lý sẽ gây tình trạng thiếu dinh dưỡng cho cây nhưng tồn dư một lượng phân không hữu hiệu trong đất Từ đó, gây thay đổi tính chất vật lý, hóa học và sinh học của đất trồng, cũng như gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và sức khỏe con người (Phạm Văn Toản và Trương Hợp Tác, 2004) Hầu hết các loại phân ammonium có tác dụng làm chua đất do sự chuyển đổi NH4+ sang NO3- và giải phóng H+ Sử dụng lâu dài các loại phân có nitrate

và sulfate trong điều kiện không cân bằng ion base hoặc các loại phân có dư lượng acid như super phosphate cũng có tác dụng làm chua đất pH acid sẽ tạo điều kiện giải phóng Al3+, Mn2+ trong đất, từ đó gây hại cho cây trồng và góp phần làm giảm hoạt tính sinh học của đất Đạm nitrate nếu bón thừa sẽ dễ dàng

bị rửa trôi hoặc ngấm sâu gây ô nhiễm nước ngầm do không được keo đất hấp

phụ (Chu Thị Thơm ctv., 2005) Lạm dụng phân đạm hóa học còn khiến nông

sản có hàm lượng nitrate quá cao, vượt quá giới hạn cho phép, gây nguy hại sức khỏe con người như gây đột biến, phát triển khối u, gây bệnh ung thư (Phạm Thị Thùy, 2010) Phân đạm dễ bay hơi dưới dạng NH3, thường mất đến 25% lượng bón Giới hạn cho phép của NH3 trong không khí là 20 mg/m3, vượt quá ngưỡng sẽ gây ô nhiễm không khí Quá trình phản đạm hóa làm giảm hiệu suất phân đạm từ 15 – 25 % và thải vào khí quyển dưới dạng N2, N2O, NO sẽ phá

hoại tầng ozone (Chu Thị Thơm và ctv., 2005) Phân lân vô cơ sau một thời gian

bón vào đất thường bị cố định dưới dạng khó tan như nhôm phosphate, sắt phosphate trong đất chua phèn hay calcium phosphate trong đất kiềm (Cao Ngọc Điệp, 2011) Một tấn super lân có chứa 50 – 170 g cadmium (Cd) (Phạm Thị Thùy, 2010) Thời gian bán hủy của Cd trong cơ thể rất lâu, từ 7 – 30 năm

Cd có thể gây các bệnh về hô hấp, tiêu hóa; tiếp xúc lâu dài có thể gây bệnh ở phổi, xương, thậm chí ung thư (Nguyễn Đức Khiển, 2002) Bón 1 tấn phân lân

sẽ đưa vào đất gần 160 kg flouride (F) Flouride có ảnh hưởng xấu đến quá trình quang hợp, tổng hợp các chất béo và phá hủy các men trong cây, tích lũy trong

nông sản, từ đó gây hại cho người và gia súc (Chu Thị Thơm và ctv., 2005)

Tương tự, phân kali khi bón vào đất cũng thường bị thất thoát, cây trồng chỉ hấp thu được 40 – 60% (Nguyễn Đức Khiển, 2002)

Số liệu công bố của IPNI (2005 – 2008) (trích dẫn của Pasuquin et al.,

2010) nêu trên chỉ cho thấy sự khác biệt trong mức đầu tư bón phân hóa học đầu vào và sản lượng đầu ra của Việt Nam (qua 4 vùng điều tra) so với hai nước khác trong khu vực Nhưng điều tra của IFAD-CIMMYT (2001) (trích dẫn của

14

Thanh Ha et al., 2004) mới bộc lộ được sự khác nhau rõ rệt trong tập quán canh

tác ngô giữa các vùng sinh thái nông nghiệp trong cả nước (Bảng 2.2) Sự khác nhau này thể hiện phần nào qua một số khoản đầu tư như giống, phân, thuốc bảo vệ thực vật và công lao động

Bảng 2.2: Một số khoản đầu tư cho canh tác ngô ở các vùng sinh thái nông

nghiệp theo điều tra của IFAD-CIMMYT, năm 2001 (Thanh Ha et al., 2004)

Vùng ngô Hạt giống

(kg/ha)

Phân hóa học các loại (kg/ha)

Phân chuồng (kg/ha)

Thuốc bảo

vệ thực vật (kg/ha)

Nhân công (người/ha) Trung du và

Miền núi phía Bắc 24 604 4750 25 181 Đồng bằng sông Hồng 27 810 8100 270 243 Bắc Trung Bộ và

Duyên hải miền Trung 22 242 0 1 188

Đông Nam Bộ là vùng sử dụng phân hóa học với lượng lớn thứ hai trong

cả nước, chỉ sau Đồng bằng sông Hồng Phân hóa học dùng cho cây ngô khá đa dạng, gồm NPK, DAP, urea và các phân đơn khác chứa ammonium sulfate, P, hay K, với tổng lượng dùng là 725 kg/ha Nông dân vùng Đông Nam Bộ gần như không có thói quen sử dụng phân chuồng cho cây ngô như ở các tỉnh phía Bắc Ở một số nơi người ta có xu hướng chỉ dùng loại phân hữu cơ này cho các loại cây trồng có giá trị cao như cà phê và hồ tiêu Trong khi đó, phân chuồng lại được khuyến cáo nên dùng bổ sung cho cây ngô trồng trên đất xám và đất bạc màu (Nguyễn Đức Cường, 2010) Lý giải cho điều này có thể là khoản tiền công lao động dành cho việc chuẩn bị cũng như vận chuyển phân hữu cơ, thường tốn kém và không sẵn có như phân vô cơ hay phân hóa học (Thanh Ha

et al., 2004)

Trái với tập quán dùng nhiều phân hóa học, theo điều tra của CIMMYT, vùng Đông Nam Bộ là nơi ít sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật trên cây ngô Lượng dùng 4 kg/ha chỉ cao hơn so với vùng ngô Bắc Trung Bộ

IFAD-và duyên hải miền Trung (1 kg/ha) IFAD-và chỉ bằng 1,48% so với vùng ngô Đồng

bằng sông Hồng là nơi tiêu tốn nhiều thuốc trừ sâu nhất nước (Thanh Ha et al.,

2004) Nếu như năm 1957, nước ta mới bắt đầu sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật với lượng khoảng 100 tấn thành phẩm thì đến năm 1990 lại sử dụng đến

15

3.500 – 4.000 tấn hoạt chất, tương đương 13 – 15 nghìn tấn thành phẩm Nếu như năm 1990, chỉ sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật cho gần 9 triệu ha cây trồng thì đến năm 1999 lại dùng cho 10,5 triệu ha, tăng gấp 17,63 lần và tốn khoảng 158,7 triệu USD Hóa chất bảo vệ thực vật sử dụng chủ yếu cho cho lúa, rau màu và cây công nghiệp ngắn ngày Dùng càng nhiều chất bảo vệ thực vật,

sự tác động xấu đến môi trường và sức khỏe con người càng lớn Theo ước tính, khi phun thuốc trừ sâu, chỉ có 50% lượng thuốc bám trên mặt lá, 50% còn lại sẽ rơi xuống đất và nước Hóa chất bảo vệ thực vật thất thoát do rửa trôi, theo nước hồi quy trôi ra kênh tiêu, sông ngòi, do gió thổi phát tán trong không khí, bám

vào bụi lơ lửng trong không khí rồi lắng đọng xuống (Chu Thị Thơm và ctv.,

2005) Dư lượng thuốc trừ sâu tích lũy trong cơ thể người gây ngộ độc mãn tính, làm tổn xương, thiếu máu, tăng cường ung thư, sảy thai, dị tật bẩm sinh và ảnh hưởng thần kinh thực vật (Nguyễn Đức Khiển, 2002)

2.2 Ứng dụng các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật: một cách tiếp cận tiềm năng của nông nghiệp bền vững

Qua phân tích các dẫn liệu bên trên, có thể thấy đất xám (acrisols) là một trong những loại đất chính được dùng để trồng ngô ở Đông Nam Bộ - một vùng ngô tiềm năng của Việt Nam Tuy ít sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật trên cây ngô so với các vùng ngô khác trong cả nước nhưng nông dân địa phương có tập quán bón nhiều phân hóa học, đặc biệt là tỉ lệ bón N:P:K chưa cân đối hợp lý Tăng cường phân bón hóa học có thể giúp tăng năng suất và sản lượng nhưng đồng thời cũng gây ra các tác động tiêu cực đối với môi trường như xói mòn đất, ô nhiễm nước ngầm, phú dưỡng sông ngòi, lãng phí tài nguyên nước, sự phát triển mạnh của cỏ dại và xuất hiện sự đề kháng với các chất kiểm soát hóa

học (Lichtfouse et al., 2009) Đây cũng là những mặt hạn chế chính của “nông

nghiệp truyền thống” mà nhiều quốc gia trên thế giới hiện nay đang quan tâm khắc phục, trong đó “nông nghiệp bền vững” là một giải pháp có thể được lựa chọn Sử dụng các vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB) như các chế phẩm bón cho cây có thể làm giảm lượng dùng phân hóa học, do vậy, nhiều nhà khoa học đã nhận định các vi khuẩn này là các vi khuẩn tiềm năng cho nông nghiệp bền vững (Bhattacharyya

và Jha, 2012; Singh, 2013)

2.2.1 Khái niệm nông nghiệp bền vững

Sau định nghĩa của Ủy ban Brutland (1987) về khái niệm “bền vững”, đến nay đã có khoảng 70 định nghĩa khác nhau về “nông nghiệp bền vững” (Lê Tân Khoa, 1999 trích dẫn của Võ Minh Kha, 2003) Có thể xem “nông nghiệp bền vững” như một trường phái, một quan điểm hiện đại trong nông nghiệp hoặc

16

một mục tiêu mà tất cả các trường phái nông nghiệp hiện nay chấp thuận và theo đuổi (Võ Minh Kha, 2003) “Nông nghiệp bền vững” tích hợp các khoa học sinh học, hóa học, vật lý học, sinh thái học, kinh tế học và xã hội học một cách toàn diện để phát triển các phương thức canh tác mới một cách an toàn và

không làm suy thoái môi trường (Lichtfouse et al., 2009) Để đạt được lợi

nhuận kinh tế, an toàn môi trường và công bằng xã hội, hệ thống canh tác trong nông nghiệp bền vững thường sử dụng các chiến lược sao cho ít sử dụng nguồn lực và “đầu vào” (input) nhưng không làm suy giảm đáng kể sản lượng đầu ra

(output) (Lichtfouse et al., 2009)

Đối với lĩnh vực trồng trọt, phân bón là một đầu vào quan trọng có tính chất quyết định cho năng suất đầu ra Ở Việt Nam, đã lưu truyền một kinh nghiệm dân gian trong canh tác: “nhất nước, nhì phân, tam cần, tứ giống”, qua

đó đề cao vai trò của phân bón Từ khi ra đời cho đến nay, phân bón hóa học đã mang lại những lợi ích không thể chối cãi trong việc tăng năng suất cây trồng,

từ đó làm tăng sản lượng lương thực thực phẩm nuôi sống nhân loại và làm giảm đói nghèo Tuy vậy, trong xu thế nông nghiệp bền vững, người ta thường chú trọng các biện pháp làm giảm sự lạm dụng phân hóa học bằng các biện pháp phối hợp cân đối giữa các loại phân bón với nhau, chẳng hạn “hệ thống dinh dưỡng cây trồng hợp nhất” (Integrated plant nutrition systems - IPNS), hay

sự thay thế một phần phân hóa học bằng các loại phân sinh học như phân vi sinh, phân vi sinh hỗn hợp và phân vi sinh chức năng (Võ Minh Kha, 2003) Việc khai thác lợi ích của các vi sinh vật đất trong trồng trọt đã được áp dụng một cách tự phát từ ngay thời cổ đại Theophrastus (372-287 trước Công nguyên) cho rằng sự pha trộn của các loại đất khác nhau như là một phương tiện

“khắc phục các khuyết tật và thêm trái tim cho đất” (Vessey, 2003) Trong tác phẩm thi ca nói về nông nghiệp “Georgics” khoảng năm 30 trước Công nguyên, Virgil cũng xác nhận những tác động có lợi của việc luân canh cây họ Đậu (Vessey, 2003) Thế nhưng, kể từ cuối thế kỷ XIX cho đến nay, người ta mới đi sâu vào việc khám phá bản chất, cơ chế của các hiện tượng này và ứng dụng vi sinh vật đất như các chế phẩm bón cho cây Năm 1888, Hellriegel và Wilfarth

đã tiến hành nghiên cứu sự dòng hóa của vi khuẩn trong đất vào vùng rễ các Hòa thảo và cây họ Đậu, cũng như khả năng chuyển đổi N2 khí quyển thành các hình thức mà cây có thể sử dụng được (trích dẫn của Bhattacharyya và Jha, 2012) Từ cuối thế kỷ XIX, “Nitragin” là một chế phẩm giúp bổ sung đạm cho

cây với thành phần là vi khuẩn nốt rễ Rhizobium sp cũng sớm được ra đời

(Bashan, 1998) Qua quá trình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật để bón cho cây, người ta đã biết đến khái niệm ‘vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật’ (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB) và các khái niệm liên quan

17

khác, ví dụ như ‘vi khuẩn liên hiệp thực vật’ (PAB), ‘vi khuẩn vùng rễ’ (rhizopheric bacteria), ‘vi khuẩn nội sinh’ (endophytic bacteria), v.v

2.2.2 Mối quan hệ giữa thực vật với các loại vi khuẩn liên hiệp thực vật

Theo Hinsinger et al (2009), sự sống trên Trái đất được duy trì bởi một

lượng đất nhỏ bao xung quanh rễ và chịu ảnh hưởng bởi rễ, đó chính là ‘vùng rễ’ (rhizophere) Vi môi trường này là nơi tập trung của đa dạng sinh học, và có lẽ là môi trường sống năng động nhất trên Trái đất (Jones và Hinsinger, 2008) Sự dồi dào của chất dinh dưỡng tại vùng rễ khiến cho vi sinh vật quần tụ nhiều hơn và đa dạng hơn Dịch tiết rễ cung cấp các hợp chất carbon như là nguồn dinh dưỡng và năng lượng sẵn có cho các sinh vật dị dưỡng, tạo ra các phức chất như carboxylate, phenol hoặc siderophore giúp cơ động hóa và hấp thu các khoáng chất khó hòa tan, làm thay đổi độ pH và thế oxy hóa khử trong vùng rễ tạo nên các điều kiện lý, hóa đặc biệt Bên cạnh đó, sự giới hạn của một số chất dinh dưỡng trong đất, thành phần hóa học và khả năng khuếch tán của dịch tiết rễ, sự tiết các chất có tính kháng khuẩn ví dụ như các chất hoạt động có chứa oxygen hoặc nitrogen (Reactive Oxygen Species and Reactive Nitrogen Species - ROS and RNS), đã tạo ra một áp

lực chọn lọc trên vi sinh vật vùng rễ (Hartmann et al., 2009) Tất cả những điều này

đã tạo nên một khu hệ vi sinh vật đặc biệt cùng tồn tại trong vùng rễ, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và tảo, trong đó vi khuẩn là nhóm phong phú nhất và có ảnh hưởng lớn đến hoạt động chức năng của cây cũng như có khả năng cạnh tranh cao trong tiến trình dòng hóa vào rễ (Saharan và Nehra, 2011)

Sau khi tập trung ở đất vùng rễ, các vi khuẩn có thể di chuyển đến bề mặt

rễ (rhizoplane) Một số chủng, loài còn có khả năng tiếp tục xâm nhập vào bên trong rễ (endorhizophere), hay tiếp tục di chuyển vào các bộ phận khác của cây Ngoài cửa ngõ là vùng rễ, người ta cũng đã phát hiện nhiều con đường xâm nhập

khác của vi khuẩn để vào bên trong thực vật (Compant et al., 2010) Beattie (2006)

cho rằng thực vật có thể cung cấp cho các vi khuẩn nhiều nơi sống đa dạng: vùng

rễ (rhizophere), vùng đất bao quanh hạt đang nảy mầm (spermosphere), bề mặt lá cây (phyllosphere), mô mạch và những vùng khác bên trong thực vật Các vi khuẩn sống dựa vào thực vật như thế có thể được xem là các ‘vi khuẩn liên hiệp thực vật’ Tại nơi cư trú, nếu các vi khuẩn không có các biểu hiện đặc tính gây hại hoặc gây bệnh cho cây chủ mà trái lại còn giúp ích cho cây bằng cách kích thích sự tăng trưởng một cách trực tiếp hay gián tiếp, các vi khuẩn như vậy sẽ được gọi chung là

‘vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật’ (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB)

18

2.2.3 Vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh và các khái niệm liên quan

Có thể nói, ranh giới giữa các khái niệm liên quan đến các vi khuẩn có sự tương tác với thực vật (vi khuẩn liên hiệp thực vật) và các vi khuẩn có lợi, giúp tăng cường sự sinh trưởng của cây (vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật) là khá linh hoạt Quan điểm của một số nhà khoa học sau đây sẽ được trích dẫn để làm rõ điều đó

De La Fuente và Burdman (2011) đã chia PAB làm hai nhóm: có lợi và gây bệnh Trong đó, các PAB có lợi sở hữu một loạt các thuộc tính trao đổi chất giúp

điều chỉnh sự tăng trưởng của thực vật (Hardoim et al., 2012) Dựa vào vị trí dòng hóa, Jha et al (2013) đã phân chia PAB thành các nhóm: vi khuẩn đất vùng

rễ, vi khuẩn biểu sinh rễ và vi khuẩn nội sinh

Thuật ngữ ‘vi khuẩn vùng rễ’(rhizopheric bacteria) được Kloepper và Schroth (1978) (trích dẫn của Bhattacharyya và Jha, 2012) lần đầu tiên giới thiệu, nhằm mô tả các vi khuẩn đất có khả năng cạnh tranh tốt trong tiến trình dòng hóa rễ cây và kích thích tăng trưởng thực vật, từ đó làm giảm tỉ lệ nhiễm bệnh ở cây (cải củ) Kloepper và Schroth (1981) (trích dẫn của Bhattacharyya

và Jha, 2012) gọi những vi khuẩn vùng rễ có lợi là ‘vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật’ (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR) PGPR

có thể được xem như là một phần không thể thiếu của sinh vật vùng rễ, khi mà kết hợp với cây chủ, chúng có thể kích thích sự tăng trưởng của cây (Bhattacharyya và Jha, 2012) Dựa vào mức độ kết hợp với các tế bào rễ thực vật, các PGPR có thể được phân thành ‘vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật ngoại bào’ (extracellular plant growth promoting rhizobacteria - ePGPR) và ‘vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật nội bào’ (intracellular plant growth promoting rhizobacteria - iPGPR) Các ePGPR có thể tồn tại trong vùng rễ, trên bề mặt rễ hoặc trong không gian giữa các tế bào của vỏ rễ Ngược lại, các iPGPR thường nằm trong các cấu trúc chuyên biệt của

rễ, chẳng hạn như nốt rễ (Martinez-Viveros et al., 2010)

Khái niệm ‘vi khuẩn nội sinh’ để chỉ các vi khuẩn sống bên trong các bộ phận của cây như rễ, thân hoặc hạt giống mà không gây bệnh hay bất kỳ tác

động có hại nào đối với cây chủ (Hallmann et al., 1997; Schulz và Boyle, 2006)

Các vi khuẩn nội sinh có thể tương tác mật thiết với các tế bào của cây chủ, sử dụng các chất chuyển hóa do thực vật tiết ra và ngược lại, chúng sản sinh ra các

hợp chất thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Hardoim et al., 2012) PAB cũng có thể

được xem như là các vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPB) dựa trên các cơ chế mà thông qua đó chúng có thể gây ra tác động tích cực lên sự lớn lên

của cây chủ (Jha et al., 2013) Các cơ chế này bao gồm sự thúc đẩy tăng trưởng

thực vật một cách trực tiếp hay gián tiếp thông qua sự kiểm soát sinh học mà

19

dựa vào đó, Bashan và Holguin (1998) đã đề nghị phân các vi khuẩn có lợi này

ra làm hai nhóm: PGPB và PGPB-kiểm soát sinh học

Về nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh thực vật, Hardoim et al (2012) đã đề

cập đến 3 loại: từ vùng đất xung quanh rễ (exorhizosphere), từ không khí (exophyllosphere) và từ các vật liệu nhân giống vô tính, chẳng hạn như hạt giống, thân và cành Tuy vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ có thể có cùng

nguồn gốc từ đất (Hardoim et al., 2012; Jha et al., 2013) và cơ chế tác động đến tăng trưởng thực vật của cả hai nhóm là tương tự nhau (de Santi Frara et al., 2012; Jha et al., 2013), song giữa chúng cũng có những khác biệt căn bản về

thành phần loài, sức chống chịu với các nhân tố sinh thái, đặc biệt là tác động của chúng trên thực vật trong canh tác nông nghiệp (Rosenblueth và Martínez-

Romero, 2006; Fageria và Stone, 2006; de Santi Ferrara et al., 2012)

Qua các khái niệm và quan điểm nêu trên, có thể thấy hai đối tượng mà đề tài nghiên cứu đã lựa chọn là “vi khuẩn đất vùng rễ” và “vi khuẩn nội sinh thực vật” có mối quan hệ gần gũi nên có thể gộp chung chúng vào nhóm “vi khuẩn liên hiệp thực vật” và đánh giá khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật của chúng dựa trên cơ chế chung Tuy vậy cũng cần phải lưu ý đến những nét đặc trưng của mỗi nhóm trong công tác phân lập, xác định đặc tính và nhận diện đối tượng

2.2.4 Cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của các vi khuẩn vùng rễ

và vi khuẩn nội sinh thực vật

Trong vài thập kỷ qua, một tập hợp nhiều chi vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting – PGP) đã được báo cáo, bao

gồm Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter,

Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus, Rhizobium, Serratia… Cơ chế

chính xác mà các PGPB thúc đẩy tăng trưởng thực vật vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ nhưng thường được phân thành hai nhóm: các cơ chế trực tiếp và các cơ chế gián tiếp (Saharan và Nehra, 2011) Cơ chế trực tiếp giúp tăng cường sự sinh trưởng phát triển của thực vật hay tạo điều kiện cho sự hấp thu các chất dinh dưỡng

từ môi trường, gồm có: (1) sản xuất hoặc thay đổi nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như acid indoleacetic, acid gibberellic, cytokinin và ethylene; (2) cố định N2 cộng sinh và không cộng sinh; (3) hòa tan phosphate và các khoáng dinh dưỡng khác Cơ chế gián tiếp giúp ngăn ngừa tác hại của các tác nhân gây bệnh bởi sự sản xuất siderophore, kháng sinh và cyanide Nói cách khác, các cơ chế này giúp thực vật có khả năng ‘kiểm soát sinh học’, đề kháng với bệnh hại, qua

đó gián tiếp đẩy mạnh sự tăng trưởng của cây Ngoài ra, các PGPB còn có thể giúp thực vật chống chịu hoặc đề kháng với stress Đặc tính này cũng gián tiếp góp phần thúc đẩy tăng trưởng thực vật ở những nơi có điều kiện bất lợi cho canh tác nông