bài dịch nhóm 7 hoan chinhx

bài dịch về công nghệ sinh học thực vật

Cải thiện Protocol cho vi nhân giống của cây

Mallotus repandus

TÓM TẮT | đốt thân và mô phân sinh lóng của cây Mallotus repandus được nuôi

cấy trên môi trường cân bản là (BM: Murashige và Skoog (MS) với sucrose 3% và 0,55% Agargel) khoảng 0-18 ngày trước khi đem nuôi cấy trong môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM: BM thêm với 4,44 M benzylaminopurine) trong 4 tuần Việc nuôi cấy sau đó được chuyển đến BM khoảng 4 tuần cho việc kéo dài chồi Đốt thân được nuôi cấy trước trên BM khoảng 14 ngày trước khi nuôi cấy trên SIM tại một điều kiện tối ưu cho việc tạo chồi với tỷ lệ 95%, so với 21% cho các nuôi cấy trước mà không có kiểm soát Mô phân sinh lóng nuôi cấy trước trên BM khoảng

16 ngày với một tỷ lệ tạo chồi tối ưu 69%, trong khi tỷ lệ ở mẫu (control) đối chứng là 6% Tỷ lệ tạo chồi tối đa tương ứng là 3,1 ± 0,3 và 2,7 ± 0,4 chồi / mẫu cấy ở đốt thân và mô phân sinh lóng Nghiên cứu này chứng minh lần đầu tiên rằng việc phát sinh chồi có thể được tạo ra từ mô phân sinh lóng của M repandus Hơn nữa, kết quả cho thấy rằng mẫu cấy cần đạt được những khả năng trước khi phát sinh chồi Rễ được tạo ra bằng cách nuôi cấy chồi tái sinh trên môi trường có nồng

độ ½ MS với 10,74 M axit 1-naphthylacetic khoảng 1 tuần tuần trước khi nuôi cấy trên môi trường có nồng độ ½ MS trong 4 tuần Cây hoàn chỉnh được chuyển thành công ra môi trường đất

Giới thiệu:

Mallotus repandus (Willd.) Mull.Arg (Euphorbiaceae), một loại cây leo thân gỗ,

được sử dụng truyền thống ở thái lan để điều trị đau cơ xương khớp (Chuakul et al., 2000) Các nghiên cứu hóa học đã tìm thấy hợp chất triterpenoid trong thân cây (Sutthivaiyakit et al., 2001) và rễ của chúng(Huang et al., 1999) Chiết suất ethanol của thân cây cho thấy có cả hai hoạt động là chống viêm và giảm đau (Lin et al, 1992; Rattanamanee, 2004; Rattanamanee et al., 2004) Thực vật chưa phát triển như là kiểu thảo dược y học cho sự điều trị các cơn đau cơ bắp Tuy nhiên với sự quan tâm ngày càng tăng trong y học thảo dược và việc ưa chuộng các hợp chất thiên nhiên ngỳ càng tăng trong chăm sóc sức khỏe, Các nguồn nguyên liệu thiên nhiên của thực vật đang chịu nhiều sức ép Hơn thế nửa, bộ sưu tập các nguyên liệu thực vật từ các nguồn tài nguyên hoang dã được trang bị đầy đủ với 1 vài bất

lợi như nguồn cung không chắc chắn và không thường xuyên, chất lượng thay đổi bất thường của nguyên liệu

Kỹ thuật vi nhân giống đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất chồi mầm cho việc trồng trọt và bảo tồn Do đó chúng ta đã cố gắng để thiết lập protocol vi nhân giống của M.repandus bằng cách nghiên cứu tác dụng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật (GPS) trên sự gia tăng nhanh các chồi non của thực vật Đốt thân

và đỉnh chồi được nuôi trên môi trường Murashige và Skoog (MS) với benzylaminopurine (BA), chỉ có N6-(2-isopentyl) adenine (2iP) và kinetin (Kin) hoặc kết hợp với 1-naphthylacetic acid (NAA) khoảng 8 tuần Tỉ lệ đáp ứng thấp

và khác nhau (12-100%) cho sự hình thành chồi đã được báo cáo Kết quả tốt nhất thu được từ MS với 4.44M BA là 61% với 3.4 chồi/ mẫu cấy, mỗi chồi dài trung bình 0,5cm (Kaewsuwan et al., 2005) Vì vậy, chúng ta chỉ sử dụng 4.44 M BA trong cuộc khảo sát này

Bên cạnh sự cân bằng auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy, giai đoạn phát triển tối ưu cho sự tái tạo nên được xác định Sự phát sinh cơ quan trong invitro,

mô và tế bào thực vật trong suốt thí nghiệm phân biệt các giai đoạn phát triển nhận định như (1) khả năng tạo hình, (2) xác định phát triển sau khi ứng dụng các chất điều hòa sinh trưởng ngoại sinh, và (3) sự khác biệt về hình thái (Christianson and Wamick, 1983; Hicks, 1994; Lo et al., 1997) .Để cải thiện sự tái tạo của M.repandus, chúng ta xác định thời gian có khả năng đến sự phát sinh chồi non của cây và do đó cải thiện protocol vi nhân giống

Vật liệu và phương pháp

Nguyên liệu là thực vật M repandus (Cây có mép lượn sóng) hai tháng tuổi được trồng trong điều kiện nhà kính tại Bangkok, Thái Lan Các loài thực vật này đã được phun rải dung dịch chống nấm (0,1% Funguran ®) một lần một ngày trong 7 ngày trước khi bắt đầu các thí nghiệm Chồi được thu thập, lá được tỉa xén, và đã dùng vòi nước để rửa sạch Chồi đã cắt được rửa sạch bằng cồn 70% trong 1 phút và rửa sạch bằng nước cất Các chồi được ngâm 20 phút trong 250ml dung dịch sodium hypochlorite 1% có chứa 50l Tween 80 và rửa sạch ba lần trong nước cất vô trùng trong điều kiện vô trùng Chồi khi được khử

trùng sau đó cắt các đốt và các mô phân sinh lóng dài 1-cm Đốt và mô phân sinh lóng được cấy tương ứng theo chiều dọc và theo chiều ngang trên môi trường nuôi cấy.

Môi trường và điều kiện nuôi cấy.

Để xác định thời gian khả năng phát sinh chồi của đốt và mô phân sinh lóng M repandus (có mép lượn sóng), được cấy trên môi trường cơ bản (môi trường BM: MS muối và vitamin có sucrose 3%, làm rắn môi trường bằng Agargel ® 0,55%; Murashige và Skoog, 1962) khoảng 0, 2,

4, 6, 8, 10, 12, 14, hoặc 16 ngày trước khi chuyển chồi sang môi trường cảm ứng (SIM, BM với Springer 4,44 M BA) trong 4 tuần Sau đó được quay trở lại nuôi cấy trên BM thêm 4 tuần để kéo dài chồi

Đối với rễ của những chồi được tái tạo, những chồi được ủ trên môi trường MS có chứa 1/2 nồng độ muối và vitamin, sucrose 1,5%, 0,55% Agargel ®, và 10,74M NAA trong 1 tuần trước khi nuôi cấy trên một môi trường có nồng độ MS giảm đi một nữa mà không cho thêm NAA trong 4 tuần.

Đối với mỗi lần xử lý, hai thí nghiệm đã được thực hiện với tổng số

30-44 lần Mỗi mô cấy được cấy trong bình thủy tinh 120 ml với 20 ml môi trường Việc nuôi cấy được duy trì ở 25°C dưới một chu kỳ sáng 16-h (37,5 mol m-2 s-1 thoáng mát ,ánh đèn huỳnh quang trắng)

Làm quen với khí hậu

Sau khi ra rễ, cây con hoàn chỉnh được chuyển sang chậu nhỏ có cát và tro trấu (1:1) và bảo quản trong một hệ thống phun sương Cây còn sống sót được chuyển ra trồng trong điều kiện nhà kính

Phân tích thống kê

Dữ liệu bao gồm cả những quan sát trên tần số đáp ứng mô cấy chồi sinh

cơ quan, số chồi tạo ra mỗi phản ứng mô cấy, và độ dài chồi cho mỗi lần xử lý được thu thập (từ cả hai thí nghiệm) và các sai số trung bình và tiêu chuẩn tính toán Hồi quy tuyến tính được sử dụng để mô hình hóa

các mối quan hệ giữa thời gian preincubation trước khi ủ và tỷ lệ đáp ứng, tỉ lệ khởi phát chồi, hoặc kéo dài chồi (Compton, năm 1994; Mize

và Chun1988,).

Kết quả

Bắt đầu cấy mẫu Thiết lập đốt thân không bị nhiễm và mô phân sinh lóng phụ

thuộc việc xử lý mẫu thực vật M.repandus Các điều kiện khử trùng được xác định

để tối ưu và được sử dụng cho tất cả các thí nghiệm tỉ lệ nhiễm vi khuẩn và nấm tương ứng là 9,8 và 0,4%

Mẫu cấy đốt thân Trong tất cả các xử lý, sự nảy chồi được quan sát trong vòng 2-4

tuần cấy trên SIM (hình 1a) Khoảng thời gian trước khi cấy trên BM đã có ảnh hưởng đáng kể tuyến tính trên tỷ lệ phần trăm của việc cấy đốt thân hình thành chồi và tốc độ cảm ứng chồi, nhưng không kéo dài chồi (Bảng 1) Sau 4 tuần nuôi cấy trên SIM, đốt thân được cấy trước trên BM khoảng 14 ngày thấy tỷ lệ đáp ứng cao nhất 90% Tỷ lệ đáp ứng tăng lên 95% sau khi cấy trên BM thêm 4 tuần nữa, với một tỷ lệ tạo chồi là 3,1 ± 0,3 chồi /mẫu cấy Sự cảm ứng chồi bất định từ đốt thân thì tốt nhất khi mẫu cấy được nuôi cấy trên BM khoảng 16 ngày trước khi cấy trên SIM và BM (3.4±0.3chồi /mẫu cấy) Chiều dài xuất hiện ở chồi là 0,6-1,0 cm trong suốt 4 tuần nuôi cấy trên SIM và dài đến 0,7-1,2 cm sau 4 tuần nuôi cấy nữa trên BM Sự tạo sẹo có thể được tìm thấy phần dưới cùng của mẫu cấy trong tất cả các xử lý

Mô phân sinh lóng Sự xuất hiện của sẹo màu xanh lá cây từ khi cắt mô phân sinh

lóng là đáp ứng đầu tiên trong tất cả các xử lý sau 1-2 tuần nuôi cấy trên SIM Một

số các mô sẹo nhỏ gắn chặt bắt đầu hình thành các cụm chồi ban đầu (Hình 1 b) Chồi dài ra sau khi chuyển mẫu sang cấy trên BM khoảng 4 tuần nữa (Hình lc) Khoảng thời gian nuôi cấy trước trên BM đã có tác động đáng kể tuyến tính trên đáp ứng phần trăm mô phân sinh lóng, tỉ lệ cảm ứng chồi, và kéo dài chồi chỉ khi được nuôi cấy trên SIM Các mô phân sinh lóng trước nuôi cấy trên BM khoảng 16 ngày cho thấy tỷ lệ đáp ứng cao nhất là 56% khi nuôi cấy trên SIM trong 4 tuần Sau đó, tỷ lệ đáp ứng tăng 69% sau khi cấy trên BM thêm 4 tuần nữa Sự cảm ứng chồi bất định từ mô phân sinh lóng là tốt nhất tại 3.0±0.4 chồi/mẫu cấy khi mẫu được nuôi cấy trên BM khoảng 16 ngày trước khi cấy trên SIM Sau khi chuyển

Hình 1 (a) mẫu đốt thân A M repandus cấy trước khoảng 14 ngày và ủ trên SIM khoảng 4 tuần (b-c) mô phân sinh lóng cấy trước khoảng 16 ngày và cấy trên SIM khoảng 4 tuần (ib) và BM khoảng 4 tuần (c) (d) sự tao rễ, (e) Cây M repandus hoàn chỉnh, 1 tháng tuổi dưới điều kiện nhà kính Bars indicate 1 cm.

đến BM tỉ lệ cảm ứng chồi giảm xuống đến 2,7±0,4 chồi/mẫu cấy Chiều dài của chồi được tạo ra giữa 0,5-0,7 cm sau 8 tuần nuôi cấy trên SIM và BM (bảng 2)

Bảng 1 Đáp ứng Expiant, tỷ lệ tạo chồi, và độ dài trung bình của chồi tái sinh của

mô phân sinh lóng M répandus sau khi trước nuôi cấy trên BM khoảng 0-18 ngày bằng việc cấy trên SIM khoảng 4 tuần và BM khoảng 4 tuần.

Sự khác nhau đáng kể được quan sát tại p < 0,01 a bằng hồi qui tuyến tính.

Sự thích nghi và tạo rễ Chồi in vitro tạo rễ khi nuôi cấy trên môi trường có nồng

độ ½ MS với 10,74 M NAA khoảng 1 tuần trước khi nuôi cấy trên ½ MS khoảng

4 tuần.Trung bình, ba rễ được tạo thành trên mỗi cây non trong 86% việc nuôi cấy (Hình 1 d) Sau khi ra rễ, cây hoàn chỉnh được chuyển sang chậu nhỏ có chứa cát

và tro trấu (1:1) và làm cho nó cứng cáp trong một căn lều có màn che Những cây sống được phát triển dưới điều kiện nhà kính Đặc điểm hình thái của cây tái sinh giống hệt cây mẹ (Hình 1e)

Thảo luận:

(Đốt thân và mô phân sinh lóng của M répandus nuôi cấy trước trên BM tăng tỉ lệ hình thàh chồi mối quan hệ này có thể sử dụng hồi qui tuyến tính)

Điều tra này hiện nay được cải thiện tỷ lệ đáp ứng lên đến 95% với 3,1 chồi / mẫu cấy và chiều dài 1,0 cm (Bảng 1) so với 61% với 3,4 chồi / mẫu cấy và chiều dài 0,5 cm từ báo cáo trước (Kaewsuwan và cộng sự, 2005) Mặc dù, số chồi trên mẫu cấy ít hơn so với báo cáo trước nhưng chúng tôi đã tăng tần số của mẫu cấy Do đó, tổng số chồi được tạo ra cao hơn Hơn nữa, cấy truyền sang BM khoảng 4 tuần cho

sự kéo dài chồi gia tăng chiều dài chồi trung bình cũng như cải thiện sự thành công

việc tạo rễ Hơn nữa, chúng tôi báo cáo cảm ứng tạo chồi từ mô phân sinh lóng M repandus cho lần đầu tiên

Chúng tôi đã chứng minh rằng mẫu cấy M repandus cần một khoảng thời gian có

khả năng để đáp ứng tín hiệu phát sinh cơ quan, tức là, một sự điều chỉnh tăng trưởng cây Kết quả của chúng tôi hỗ trợ các nghiên cứu trước đây, cho thấy rằng một thời gian thu hồi khả năng được yêu cầu bởi mô nuôi cấy cho phát sinh cơ quan Cây bìm bìm và mô Nicotiana không đủ khả năng để đáp ứng với các tín hiệu cảm ứng chồi trong suốt những ngày đầu tiên của việc nuôi cấy (Christianson

và Wamick, 1983; Attfield và Evans, 1991) Mẫu Lá hoa violet ở châu Phi được nuôi cấy trước trên môi trường PGR-free trước khi chuyển đến môi trường SIM chồi được tạo ra sớm hơn kiểm soát (Lo và cộng sự, 1997) Trong cây Arabidopsis thaliana, một cDNA, ESR1 (để tăng cường tái sinh chồi) việc tạo chồi có kiểm soát, đòi hỏi việc thu được khả năng phát sinh cơ quan (Banno và cộng sự, 2001) Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng có một nhu cầu cho một khoảng thời gian của khả năng phát sinh cơ quan trong M repandus, mà có thể cải thiện tần số của mẫu cấy để tạo chồi Để đảm bảo tái sinh thành công trong khó khăn để tái sinh các loài, khả năng của các loài thực vật nên được xác định khi các tín hiệu cảm ứng gây sẽ được cung cấp Nghiên cứu sâu hơn ở cấp độ phân tử nên có ích trong việc tìm hiểu phản ứng của sinh cơ quan cây trồng

Bảng 2