báo cáo thí nghiệm vi sinh

Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác.Agar trong môi trường nuôi cấy vi sinh đóng một vai trò là "giá đở".. - Tạo điều kiện vô trùng cho môi trườn

MÃ HP: 162ENMI327010 NHÓM THỰC HIỆN: Nhóm 4 HỌC KỲ: II NĂM HỌC: 2016-2017 GVHD: TS Nguyễn Mỹ Linh

Tp Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 05 năm 2017

ĐIỂM:

HỌ TÊN SINH VIÊN THỰC HIỆN

NHẬN XÉT CỦA GV

………

………

………

………

……….

………

………

………

………

………

………

………

GV kí tên

Thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường

MỤC LỤC

Mục lục….

Bài 3: Chuẩn bị Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật……….4 Bài 4: Các phương pháp phân lập vi sinh vật……….…… 8 Bài 5: Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật………11 Bài 6: Các phương pháp nhuộm màu và quan sát hình thái vi sinh vật……… 14 Bài 7: Tổng số vi sinh vật hiếu khí……….…20 Bài 8: Phương pháp kiểm tra tổng coliformtrong nước thải……… 24 Bài 9: Kiểm tra E coli trong nước thải……… 28

Bài 3:

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG NÔI CẤY VI SINH VẬT

1 Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG

Các chất dinh dưỡng là những chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm

vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môitrường

Người ta dựa vào các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường:

- Theo thành phần và nguồn gốc: môi trường tự nhiên, môi trường tổng hợp và môitrường bán tổng hợp;

- Theo tính chất lý học: môi trường lỏng, môi trường đặc và môi trường và môitrường bán lỏng;

- Theo công dụng: môi trường cơ bản và môi trường chọn lọc

2 NGUYÊN TẮC

Thao tác phải hết sức cẩn thận, thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn

Người ta thường phân phối môi trường vào ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác.Agar trong môi trường nuôi cấy vi sinh đóng một vai trò là "giá đở" Nếu nhiều quáhoặc ít quá thì cũng có ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy

Khử trùng môi trường dinh dưỡng nhằm mục đích:

- Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi trường

- Tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy chính xác.Sau khi khử trùng môi trường phải đảm bảo một số điều kiện sau:

 Không làm biến tính môi trường, không làm biến tính một số chất trongmôi trường

 Sau khi khử trùng , trong môi trường không sản sinh ra chất độc gây chết visinh vật nuôi cấy

 Phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối sau khi khử trùng

 Bảo đảm an toàn đối với người sử dụng

Nơi cất giữ môi trường phải thuận tiện cho việc theo dõi, sử dụng và bảo quản

3 PHƯƠNG PHÁP

- Phương pháp thực hiện: Làm thạch nghiêng; Đổ đĩa petri

- Phương pháp khử trùng: autoclave (121oC)

4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

a Chuẩn bị môi trường

Cân chính xác các thành phần của môi trường:

- Saccharose or Maltore: 10gr - Pepton: 2gr

- KH2PO4: 0.6gr - MgSO4: 1gr

- Agar: 4gr - Nước cất: 200ml

Cho hỗn hợp trên vào bình tam giác có chứa 200 mL nước cất, khuấy tan hỗn hợp.Sau đó đậy kín miệng lại bằng nút bông và bọc giấy bạc Hấp tiệt trùng ở 121oC trong 2giờ

b Chuẩn bị dụng cụ:

Làm nút bông cho ống nghiệm, gói giấy báo đĩa petri và ống nghiệm Sau đó chovào tủ sấy

c Phân phối môi trường vào dụng cụ vào dụng cụ:

Thao tác dưới ngọn lửa đèn cồn, quá trình làm cẩn thận tránh để môi trường rơi rangoài

- Môi trường cần được đun cho hóa chất lỏng rồi cho vào các dụng cụ

- Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường

- Tay phải kẹp nút bông và kéo ra

- Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại

Ống nghiệm thạch nghiêng: Cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường kếtthúc và môi trường chưa đông đặc

Đổ thạch vào đĩa petri: Toàn bộ qui trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện dướingọn lửa đèn cồn

Chú ý: Thao tác hết sức khẩn trương và khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn Mặt

thạch phải phẵn, nhẵn, có độ dày khoảng 2mm Thông thường ¼ lít môi trường có thểphân phối 22 25 đĩa petri

Sau khi đã phân phối môi trường vào dụng cụ, chờ thạch đông lại, rồi đem ủ trong tủ

ủ ở 35oC từ 1 - 2 ngày

5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Môi trường sau khi đã được phân phối vào dụng cụ:

Môi trường sau khi ủ trong 2 ngày:

6 NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Sau khi đã ủ trong tủ ủ 2 ngày, lấy ra quan sát kết quả ta thấy: Trong số 8 nghiệmchứa môi trường thì có 5 ống nghiệm vô khuẩn ( môi trường không thay đổi so với trướckhi ủ) đạt chuẩn và có 3 ống nghiệm có vi sinh phát triển

Nguyên nhân nhiểm khuẩn: có thể trong quá trình thao tác cách xa ngọn lửa đèncồn, tay chưa được vệ sinh cồn đúng cách

Bài 4:

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH

1 Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG:

Phân lập vi sinh vật là quá trình tách rời các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu vàđưa về dạng thuần khiết

Trong thiên nhiên hay trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh thường tồn tại ở dạnghỗn hợp nhiều loài khác nhau Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hóa hoặc úngdụng vào đời sống thực tiễn một loài nào đó thì cần phải đưa về dạng thuần khiết.

Bước 1: Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẻ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

Bước 2: Phân lập vi sinh vật thuần khiết

Bước 3: Kiểm tra độ tinh khiết cảu những khuẩn lạc

Chú ý: Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn cần đưa về dạng lỏng để phân lập bằng cáchtiến hành các bước sau

- Nghiền mẫu.

- Hòa tan mẫu trong nước cất vô trùng.

- Pha loãng mẫu ỏ nồng độ thích hợp.

- Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó.

Để có được chủng thuần chủng cần tiến hành lập lại nhiều lần các kĩ thuật tiến hànhpha loãng như trên cho đến khi đồng nhất các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường

a Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn: (Phương pháp cấy ria)

- Hơ đỏ que cấy, làm nguội rồi lấy đầy que cấy 1 vòng vi sinh vật cần phân lập.

- Nghiên hở Petri Dùng que cấy gạch những đường song song ở phần a của hộp

Petri

- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần b của đĩa Petri.

- Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở phần b của đĩa Petri.

- Lật ngược hộp Petri có chứa vi sinh vật và cho vào tủ ấm ở 35 độ C trong 24 đến

48h

Phương pháp cấy ria

b Phương pháp trải đĩa:

- Dùng Pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0.1 ml dịch chứa vi

sinh lên bề mặt môi trường trong đĩa Petri

- Nhúng que trang vào cồn rồi hơ trên ngọn lữa đèn cồn để khử trùng, để nguội dưới

ngọn lữa đèn cồn

- Mở nhẹ nắp Petri, dùng que trang nhẹ nhàng trãi đều mẫu khắp mặt thạch.

- Rút nhanh que trang khỏi đĩa, đậy đĩa và gói đãi đem ủ ở nhiệt độ và thời gian

thích hợp

c Phương pháp đỗ đĩa

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng đưa 1 ml dung dịch mẫu đã được pha loãng lên

trên bề mặt đĩa petri

- Đỗ khoảng 10 -15ml môi trường vào đĩa (chú ý để nguội môi trường đến nhiệt độ

thích hợp để tránh gây sốc nhiệt cho vi sinh vật)

- Xoay nhẹ đĩa Petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để được trộn

đều trong môi trường cấy

- Đậy nắp đĩa Petri và để đông tự nhiên rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp.

5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM:

Sau khi ủ trong 24h, kết quả được thể hiện qua hình ảnh như sau:

- Phương pháp cấy ria

- Phương pháp trãi đĩa , đổ đĩa:

6 NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

a Nhận xét: Trong phương páp cấy ria có hiện tượng nhiễm khuẩn Qua hình ảnhcho thấy số lượng VSV có trong mẫu là khá nhiều, chúng thể hiện qua việc mọc với mật

độ nhiều trong môi trường ở cả hai phương pháp

b Bàn luận: Trong quá trình khử trùng, môi trường khử trùng không đạt được yêucầu Trong thao tác thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn không cẩn thận gây nhiễm

BÀI 5:

KỸ THUẬT GIEO CẤY VI SINH VẬT

1 Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG

Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môitrường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác thậm chí

là bình serum đối với vi sinh vật kị khí Để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật pháttriển Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thíchhợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vậtluôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết

2 NGUYÊN TẮC

Thao tác cấy chuyền phải hết sức cẩn thận, tránh làm hỏng bề mặt môi trường cótrong ống nghiệm

Thực hiện dưới ngọn lửa đèn cồn

Mỗi lần cấy chuyền chỉ nên dùng với một loại vi sinh vật để tránh lây nhiễm chéocác loại VSV với nhau

Vi sinh vật thường được cấy chuyền bằng que cấy vòng hay que cấy nhọn Trongnhững trường hợp đặc biệt có thể dùng pipet, que đầu có quấn bông hay que trang

3 PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp cấy truyền

4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

Ghi nhãn từng ống nghiệm với đầy đủ thông tin: tên vi sinh vật, ngày cấy chuyền,môi trường cấy chuyền

Cầm que cấy trong tay phải ( tay thuận ), ống nghiệm gốc và ống nghiệm sẽ cấychuyền trong tay trái

Tiệt trùng que cấy bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi que cấy nóng đỏ

Mở nắp ống nghiệm gốc trước bằng cách dùng ngón tay út kẹp chặt nút bông tronglòng bàn tay và kéo nút bông ra khỏi ống nghiệm, hơ nút bông và miệng ống nghiệm gốctrên ngọn lửa đèn cồn

Mở nắp ông nghiệm cấy chuyền bằng cách kẹp chặt nút ống nghiệm giữa ngón út vàngón áp út ( làm tương tự như ống nghiệm gốc ).

Cho que cấy đã vô khuẩn và làm nguội vào ông nghiệm gốc, lấy một vòng que cấymôi trường có chứa VSV và chuyển nó sang môi trường ống nghiệm thứ 2

Lướt que cấy trên mặt thạch nghiêng theo hình chữ chi, hình xoắn, hình vạch songsong

Rút que cấy ra, hơ đỏ trên ngọn lửa đèn cồn vô khuẩn sau đó đặt que cấy lên giá đỡống nghiệm

Hơ lần lượt miệng ống nghiệm và nút bông qua ngọn lử đèn cồn sau đó đậy nắp ốngnghiệm lại

Mang ống nghiệm đi ủ nhiệt độ 35ºC trong 24 – 48 giờ

5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Ống nghiệm sau khi được cấy chuyền và ủ ở nhiệt độ 35ºC trong khoảng 36 giờ

6 NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

Sau khi đã ủ khoảng 36h, lấy ra quan sát kết quả ta thấy: tất cả 8 ống nghiệm chứamôi trường đều có VSV phát triển nhưng chỉ có 2 ống nghiệm có vi sinh phát triển vàmọc tương đối đều

Nguyên nhân: Khi phân phối môi trường thạch nghiêng thì môi trường đông đặckhông giữ được mặt thạch nghiêng, nên khi cấy vi sinh vật và bỏ vào tủ sấy thạch chảyđẫn đến kết quả không được như mong muốn

Có thể trong quá trình thao tác cách xa ngọn lửa đèn cồn nên bị nhiễm khuẩn Cácthao tác cấy không đúng (cấy không đều tay, quá mạnh tay làm hỏng bề mặt môi trường)

Bài 6:

CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI

SINH VẬT

1 Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG

Xác định hình thái tế bào VSV, xác định kích thước và sự sắp xếp của chúng

Quan sát tế bào sống VSV Tế bào đã cố định và nhuộm màu, đặc điểm hình thái

2 NGUYÊN TẮC

Loại tiêu bản giọt treo theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động

và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích

Phương pháp nhuộm màu sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc đối với vi sinhvật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt độngsau khi nhuộm màu

Phương pháp nhuộm Gram: Tất cả các vi khuẩn chia làm 2 nhóm lớn:

- Nhóm 1: Giữ được phức chất tạo thành giữa tím tinh khiết và iod, khi sử lý bằng

cồn, vi khuẩn nhuộm Gram +

- Nhóm 2: Vi khuẩn không có khả năng giữ được phức chất và bị mất màu khi xử

lí bằng cồn, vi khuẩn nhuộm Gram -

3 PHƯƠNG PHÁP

Có 2 phương pháp chính để nhuộm màu và quan sát hình thái vi sinh vật là: Phươngpháp làm tiêu bản cố định và phương pháp làm tiêu bản tạm thời Phương pháp thườngđược sử dụng là một phương pháp làm tiêu bản cố định và nhuộm Gram: Là phươngpháp nhuộm để phân loại vi khuẩn theo khả năng bắt màu với các thuốc nhuộm tím kếttinh và iod

4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

a Tiêu bản tạm thời

Tiêu bản giọt ép

- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi Giống vi sinh

được sử dụng là nấm men; bùn hoạt tính; nước dưa chua

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí Muốn

vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ là kính xuống

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.

Tiêu bản giọt treo

- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa

- Bôi vazolin quanh phần lõm của phiến kính.

- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên

phần lõm của phiến kính

b Tiêu bản tạm thời có nhuộm màu

- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh metylen 0,001% lên phiến kính.

- Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm Vi sinh vật được sử dụng để

quan sát là nấm men bia

- Đậy lá kính lên giọt dịch.

- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40).

c Tiêu bản cố định

Bước 1: Làm vết bôi ( trải trùng)

- Vi khuẩn trong môi trường lỏng: dùng que cấy đầu tròn lấy 1 giọt vi khuẩn đặt lên

lamelle sạch

- Vi khuẩn trong môi trường đặc: lấy 1 giọt nước vô trùng đặt lên lamelle.

- Lấy vi khuẩn trộn đều trong 1 giọt nước ( trải mỏng lên lamelle)

- Cố định vết bôi: Để khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn.

- Mục đích cố định: Gắn tế bào VSV lên phiến kính, tránh bị rửa trôi về sau  Vếtbôi dễ bắt màu thuốc nhuộm

Bước 2: Nhuộm tiêu bản bằng Crytasl Violet ( Getian violet) trong 1 phút.Bước 3: Nhuộm lugol trong 1 phút ( rửa nước hoặc không).

Bước 4: Rửa nước, tẩy cồn 1 phút, rửa nước

Bước 5: Nhuộm Fuschin (Safanin) 1 phút, rửa nước, để khô

Bước 6: Nhỏ dầu, quan sát ở vật kính (x 100)

- Tiêu bản đem quan sát

5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

a Tiêu bản tạm thời nhuộm màu

Nấm men ( vật kính x10)

Nấm men ( vật kính x40)

Dưa chua( vật kính X10)

Dưa chua (vật kính x40)

b Tiêu bản cố định: Nấm men ( vật kính x100)

6 NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN KẾT QUẢ

Nhận xét:

- Ở tiêu bản tạm thời nhuộm màu nấm men quan sát hình thái VSV rất rõ nét

- Ở tiêu bản tạm thời nhuộm dưa chua hình thái VSV quan sát không rõ

- Ở tiêu bản cố định ta chỉ quan sát được đối với Nấm men còn Dưa chua thì không

thấy kết quả

Bàn luận kết quả:

- Số lượng nấm men cao, các bước thực hiện làm tiêu bản chính xác và sử dụng

kính hiển vi thành thạo nên cho kết quả rõ nét

- ở dưa chua do số lượng VSV trong dưa chua thấp, trong quá trình thực hiện còn

nhiều sai sót nên không đạt được kết quả mong muốn

Bài 7:

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

1 Ý NGHĨA MÔI TRƯỜNG

Việc đếm tổng số vi sinh vật cung cấp một phương tiện tiêu chuẩn để xác định mật

độ vi khuẩn dị dưỡng hiếu khí và kị khí, tùy tiện trong nước Có 3 phương pháp và 3 loạimôi trường để xác định chỉ tiêu này

Kỹ thuật đếm trên đĩa các tế bào dị dưỡng là phương pháp tốt nhất xác định thànhphần vi khuẩn tổng quát có trong mẫu nước, để có thể đánh giá hiệu quả nhà máy xử línước, sự tăng trưởng sau đó của vi khuẩn trong các đường ống, trong các nguồnnước v v

2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Phương pháp đổ đĩa: Đầu tiên được xem là phương pháp đếm tiêu chuẩn Nhược điểm: hạn chế số lượng tối đa của vi khuẩn trên môi trường do nhiệt độ ủ và thờigian xét nghiệm ( nhiệt độ môi trường 44-460C có thể gây sốc nhiệt cho vi khuẩn ) Môitrường giàu dinh dưỡng có thể làm giảm sự phát triển của những vi khuẩn thiếu dinhdưỡng Kỹ thuật cãi tiến có thể khắc phục những hạn chế trên

Phương pháp trải đĩa: Không bị sốc nhiệt do nhiệt độ của thạch Thêm vào đó, tất cảkhuẩn lạc mọc trên mặt thạch có thể nhìn thấy và đếm dễ dàng và cũng dễ phân biệtnhững khuẩn lạc riêng biệt hoặc những bong bóng khí Kỹ thuật này có hạn chế sử dụngmẫu thể tích nhỏ: 0.1 – 0.5 ml và phụ thuộc vào khả năng hấp phụ của thạch

3 MÔI TRƯỜNG

Trytone glucose extract agar: dùng cho phương pháp đỗ đĩa và trãi đĩa pH được

chỉnh ở 6.8-7.0 Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút

Place count agar: dùng cho phương pháp đổ đĩa và trãi đĩa pH được chỉnh ở

7.0-7.2 Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút

R2A: dùng cho phương pháp đỗ đĩa, trải đĩa và màng lọc Môi trường này không ở

dạng dehydrate mà phải chuẩn bị theo những thành phần cơ bản theo công thức môitrường Điều chỉnh pH đến 7.2 bằng K2HPO4 hoặc KH2PO4 dạng rắn trước khi thêm agar

và khử trùng ở 1210C, 15 phút

4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM