Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh môi trường ĐH Công nghiệp thực phẩm

Báo cáo: Thí nghiệm vi sinh môi trường ĐH Công nghiệp thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

-

VI SINH MÔI TRƯỜNG SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516 Trần Thị Hồng Cẩm:3009110470 Trần Thiên Ân:3009110373

Nguyễn Dũ:3009110440

TP.HCM,tháng 6 năm 2013

PHẦN 1: DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1

1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 1

1.1 Dụng cụ 1

1.2 Thiết bị 5

PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH 10

2.2.1 Kỹ thuật tiêu bản tạm thời 10

2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường 11

2.2.3 Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : 12

2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật 13

2.2.5 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật 15

2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu 18

2.2.7 Phương pháp hộp đổ 19

2.2.8 Phương pháp hộp trải 20

2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn 22

2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) 23

2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG 28

3.1 Vi sinh vật phân giải cellulose 28

3.1.1 Nguyên tắc 28

3.1.2 Kết quả 28

3.1.3 Nhận xét: 31

3.2 Vi sinh vật phân giải phosphor 31

3.2.1 Nguyên tắc 31

3.2.2 Kết quả 31

3.2.3 Nhận xét: 32

3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 32

3.3.1 Nguyên tắc 32

3.3.2 Kết quả 33

3.3.3 Nhận xét: 35

3.4 E.coli,Coliform 36

3.4.2 Kết quả 36

3.5 Vi sinh vật trong xử lý nước thải: 38

3.5.1 Nguyên tắc 38

3.5.2 Kết quả 40

3.5.3 Nhận xét 41

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

4.1 Kết luận 42

4.2 Kiến nghị 42

4.3 Bài học kinh nghiệm 43

Bình tam giác

Chứa môi trường nuôi cấy hay dung môi hóa chất trong pha chế môi trường

Phiến kính và lá

kính

Phiến kính:chứa giọt VSV ở trạng thái sống hoặc nhuộm màu khi quan sát bằng kính hiển vi

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 2

Lá kính : dung để đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV

Cốc thủy tinh

Dùng để chứa cồn, hóa chất…

Đèn cồn Tạo không gian vô

trùng, khử trùng các loại que cấy

Micropipette

Định lượng một thể tích chính xác VSV, môi trường nuôi cấy hay dung dịch hóa chất

Kính lúp Quan sát các vật có

kích thước nhỏ

Phễu thủy tinh

Chuyển dung môi từ dụng cụ chứa này sang dụng cụ chứa kia dùng khi miệng dụng cụ chứa nhỏ Ống đong

Sử dụng để định mức lượng hóa chất cần dùng với độ chính xác cao

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4

dễ bay hơi trong không khí

Chậu thủy tinh Chứa rác như giấy

báo,gang tay, khẩu trang … đã sử dụng

Giá để pipet

Dùng để để pipet, đũa thủy tinh

Bình tia Chứa nước cất

- Cho nước cất vào nồi hấp đến khi ngập con ốc cảm ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục cho giỏ inox lớn vào nồi hấp

- Cho dụng cụ và môi trường cần hấp khử trùng vào giỏ nhỏ rồi đưa vào nồi hấp

- Đóng nắp và khóa van

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 6

- Bật công tắt ở bên hông, cài đặt thông số nhiệt độ,áp suất, thời gian, bấm lần lượt các nút “set” và

“start”

- Khi đã có tín hiệu thì

mở nồi hấp ra, chờ 1 phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ môi trường ra (nếu muốn hạ

áp suất của nồi hấp thì mở nắp nồi hấp )

Tủ sấy

- Mở cửa tủ sấy cho vật liệu sấy vào và đóng lại ( đẩy thanh tay cầm sang trái để

mở, sang trái để đóng)

- Cắm nguồn điện chờ 10s rồi mới bật on/off để mở máy

- Nhấn phím “▲▼” để chọn chương trình P3, chờ 5s

để xác nhận chương trình đã chọn

- Nhấn phím X/W để cài nhiệt độ sấy( dùng phím

“▲▼” để cài nhiệt độ )

- Nhấn phím X/W để cài thời gian sấy ( dùng phím

“▲▼” để cài thời gian), nếu chạy liên tục thì để thời gian cài đặt bằng 0

- Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài ở bước 4

và 5

- Khi đạt nhiệt độ sấy màn hình nhấp nháy liên tục hai thông số đã cài đặt, khi thời gian cài đựt về 0 thì kết thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy lấy vật liệu sấy ra

- Vệ sinh tủ sấy Cân điện tử

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 8

Máy lắc

ống nghiệm

- Cắm điện

- Đặt ống nghiệm lên phần núm đen

+ Bật công tắc lên nếu muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual) Nhấn nhẹ và giữ chặt ống nghiệm trong vài giây rồi nhấc ống nghiệm ra

+ Bật công tắc xuống nếu muốn sử dụng chế độ lắc liên tục(Continuous)

Lò vi ba

Bếp điện

- Chọn vật kính:

tùy theo mẫu tiêu bản

và mục đích quan sát

mà ta chọn vật kính thích hợp

- Nhỏ 1 giọt dầu soi lên phiến kính khi soi vật kính x100

- Điều chỉnh ánh sáng

- Điều chỉnh tụ quang

- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính

- Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc chỉnh thô đến khi thấy hình ảnh mờ, tiếp tục điều chỉnh ốc chỉnh tinh đến khi nhìn rõ vật

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 10

PHẦN 2: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH

2.2.1 Kỹ thuật tiêu bản tạm thời

Nội dung công

và hạ lá kính xuống để

có bọt khí

2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú

Bước 1: Cân từng thành

phần của môi trường

 Cân chính xác lượng hóa chất

Bước 3: Phân phối môi

trường vào các dụng cụ

chứa, đóng nút bông, bao

gói giấy báo

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12

o Khử trùng tay

và khu vực làm thí nghiệm bằng cồn trước khi tiến hành

o Thao tác nhanh, môi trường rất dễ đông

Không di chuyển ống nghiệm khi môi trường chưa đông đặc

2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú

o Sử dụng khẩu trang trong suốt quá trình cấy

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 14

o Rồi đưa que cấy

vào đáy ống nghiệm

ria theo đường dzích

dzăc từ dưới kéo về

hướng miệng ống

nghiệm

Tránh để vỡ thạch Không ria nhiều lần

Bước 6:

o Rút que cấy ra, hơ miệng ống nghiệm

o Đóng nút bông lại

o Khử trùng que cấy và để

vào giá Bước 7 : Dán nhãn, bao

gói, bảo quản

2.2.5 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật

2.2.5.1 Kỹ thuật hộp ria

Bước 1: Chuẩn bị

o Petri chứa môi trường thạch

o Ống nghiệm chứa vsv cần cấy,nút bông bằng gạc

o Dụng cụ cần thiết (que cấy, cồn, đèn cồn, bông,…)

Petri không bị nhiễm

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 16

Bước 3: Dùng máy lắc,

lắc đều ống nghiệm

chứa VSV

Giữ chặt ống nghiệm tránh làm rơi ra ngoài

Bước 4:

o Để petri gần đèn cồn

o Tay trái cầm ống nghiệm chứa VSV vừa lắc xong, tay phải cầm que cấy, dùng ngón tay út mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn

Đặt petri và ống nghiệm gần ngọn lửa đèn cồn trong phạm vi

< 15cm

Bước 5:

o Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng

đỏ

o Đưa que cấy vào giữa ống nghiệm chứa VSV lấy một ít sinh khối VSV

o Khử trùng miệng ống nghiệm, tiệt trùng nút bông

và đóng bông ống nghiệm và

để que cấy trong không gian vô trùng

o Tay trái

mở nắp petri, tay phải cầm que cấy ria trên bề mặt thạch, đậy nắp petri lại

o Để que cấy vào miệng ống nghiệm cho bớt nóng

o Chú ý thao tác cẩn thận để không làm vỡ thạch

Bước 6:

o Khử trùng que

cấy khi cấy ria xong và

để vào giá đựng

o Ghi tên sinh

viên, môi trường, tên

VSV lên đĩa petri và

bao gói lại bảo quản

Bao gói cẩn thận bảo quản để không bị nhiễm sv khác

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 18

2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu

 Với mẫu nước

Bước 1: Hút 10ml mẫu

cho vào bình tam giác đã

có 90ml nước cất

Lắc đều mẫu trong bình tam giác ít nhất 2 phút

Làm tương tự như trên đến khi đạt nồng độ yêu cầu

 Với mẫu đất

Bước 1: Chuẩn bị mẫu đất,

dùng cối giã đất nhuyễn

ra, cân 10g cho vào bình

tam giác có chứa 90ml

nước cất

Lắc đều mẫu,ta được nồng độ

10-1

Bước 2: Lắc đều bình tam

giác chứa mẫu, dùng

pipette hút 1ml cho vào

ống nghiệm chứa 9ml

nước cất

Lắc đều dung dịch

ta được mẫu có nồng độ pha loãng

o Petri, pipette,bao gói

giấy báo và đem hấp khử

cho vào đĩa petri vô trùng

chưa có môi trường

o Mẫu chứa vsv phải dược lắc đều trước khi hút

o Sử dụng găng tay và khẩu trang trong suốt quá trình thao tác thí nghiệm

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 20

Bước 3:

Đỗ khoảng 15 – 0ml môi

trường nóng chảy ở 450

C vào đĩa petri đã cấy giống

vsv, đậy nắp đĩa petri

Đặt đĩa petri lên mặt

phẳng ngang, xoay nhẹ đĩa

petri theo 2 chiều ngược

nhau mỗi chiều từ 3 – 5 lần

để dịch vsv dàn đều ở mặt

đáy của đĩa petri và trộn

đều trong môi trường cấy

Xoay đều đĩa petri để vsv dàn đều và mặt thạch bằng phẳng

Các thao tác phải được thực hiện trong không gian vô trùng (gần ngọn lửa đèn cồn)

Bước 4:

Để đông tự nhiên gần

ngọn lửa đèn cồn

Dán tên sinh viên ,môi

trường, VSV,…lên đĩa

petri

Đợi môi trường đông, lật

ngược đĩa petri lại, bao gói

và đem bảo quản ở nhiệt độ

Bước 2: Dùng pipette vô

trùng hút 0,1ml dịch vsv

lên bề mặt môi trường

thạch đĩa trong không gian

vô trùng

Hút trong không gian vô trùng gần ngọn lửa đèn cồn

Bước 3:

o Nhúng đầu que trang vào cốc thủy tinh chứa cồn

700, đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng

o Mở đĩa petri, dùng que trang gạt

và xoay đều giọt vsv trên bề mặt thạch Trong khi gạt,xoay đĩa petri tới lui 3 – 4 lần, mỗi lần ½ chu vi cho dịch vsv trải đều khắp trên bề mặt môi trường

Thao tác cấy được thực hiện trong không gian vô trùng

Bước 4:

o Rút que trang khỏi đĩa, đậy đĩa,úp ngược petri

o Dán nhãn, bao gói, bảo quản ở nhiệt

độ thich hợp cho từng vsv mục tiêu

Bao gói kỹ và bảo quản đúng thời gian và nhiệt độ

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 22

2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú

Bước 1: Chọn 1 phiến kính

sạch,cố định vsv bằng cách

cho 1 giọt sinh khối vsv

trải đều lên phiến kính, hơ

trên ngọn lửa đèn cồn cho

đến khi khô

Hơ đến khi khô nhưng không để cháy

Bước 2: Cho 1 giọt lớn

Bước 3: Hơ lại trên ngọn

lửa đèn cồn, để yên khoảng

Bước 4: Nhỏ 1 giọt dầu

cedre lên vết nhuộm, dưa

lên bàn mẫu, điều chỉnh

kính hiển vi và quan sát

đến khi thấy rõ ảnh

2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram)

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú

Bước 1: Cho 1 giọt sinh

khối vsv lên phiến kính

sạch, hơ khô trên ngọn lửa

đèn cồn

Không để quá gần ngọn lửa làm cháy vết bôi

Bước 2:Nhuộm vết bôi

bằng dung dịch tím kết tinh

o Nhỏ 2 giọt methyl violet lên vết bôi giữ 30 giây

o Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm rồi hơ khô

Không rửa trôi hết vsv

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 24

Bước 3:

o Nhuộm vết bôi bằng dung dịch Lugol

o Nhỏ 2 giọt

I2/KI lên vết bôi, để

1 phút

o Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm đến khi mất hết màu và hơ khô

Sử dụng khẩu trang khi tiến hành thí nghiệm

Bước 4:

o Nhỏ 2 giọt sarafin lên vết bôi,

để yên 30 giây

o Rửa vết bôi bằng nước, hơ khô

o Nhỏ 2 giọt dầu soi kính lên vệt bôi

o Đưa lên bàn mẫu chỉnh kính hiển

vi và quan sát

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 26

2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính hiển vi

Bước 1: Kiểm tra kính hiển

vi:

o Cắm điện, bật công tắc đèn kiểm tra

o Kiểm tra ốc,vật kính còn tốt, còn sử dụng được không

o Kiểm tra vật kính, lau sạch nếu thấy còn bẩn

o Hạ tụ quang,đóng bớt chắn sang sao cho nhìn rõ đươc hình ảnh

o Tùy loài vsv

mà sử dụng vật kính thích hợp (10X,40X,100X)

o Dùng ốc chỉnh thô, điều chỉnh cho vật mẫu lên sát vật kính cho đến khi thấy được ảnh vsv

o Dùng ốc chỉnh tinh vặn chỉnh để thấy rõ ảnh vsv

o Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính lớn hơn và điều chỉnh ốc chỉnh tinh để tìm ảnh

Chọn vật kính thích hợp để quan sát từng loài vsv

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 28

dụng xong

PHẦN 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VI SINH MÔI TRƯỜNG

3.1 Vi sinh vật phân giải cellulose

3.1.1 Nguyên tắc

- Cellulose (C6H10O5)n là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Hằng năm

có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc dù là chất cao phân tử, khá bền, chúng vẫn bị phân giải dưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn

hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ ẩm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau

- Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa lớn trong quá trình xử lý môi trường

- Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose Dưới tác dụng của enzyme này, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C12H22O11) lại tạo thành

glucose (C6H12O6) nhờ tác dụng của enzyme celloblase

- Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng

N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)

V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)

n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10-4 n=10000) K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1)

Khuẩn lạc Kích thước Màu sắc Mức độ phân giải Số khuẩn lạc

- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ

- Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được

- Hình ảnh vi nấm phân giải cellulose, mô tả chi tiết

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 30

Hình: Vi sinh vật phân giải cellulose ở môi trường Hutchinson

3.1.3 Nhận xét:

- Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu

- Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường để tận dụng hết bề mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy

- Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài

3.2 Vi sinh vật phân giải phosphor

3.2.1 Nguyên tắc

- Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyển hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoị vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác nhau

- Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Ca3(PO4)2 Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt

3.2.2 Kết quả

Nồng độ 10-2 Nồng độ 10-3

- Nồng độ pha loãng 10-2: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được

- Nồng độ pha loãng 10-3: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có những vòng phân giải trong suốt

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 32

N : Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)

V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)

n : số nghịch đảo của nồng độ pha loãng

K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=1)

- Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chi tiết

3.2.3 Nhận xét:

- Khi đổ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay để tránh nhiễm vi

sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đổ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử khuẩn của đèn cồn

- Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn

- Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm khác để hoàn thiện bài báo cáo

3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá

3.3.1 Nguyên tắc

- Quá trình nitrit hoá

NH4+ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO2- gọi là quá trình nitrit hoá NO2- sẽ tác dụng với dung dịch Griss I và Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng

- Quá trình nitrat

NH4+ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO3- gọi là quá trình nitrat hoá Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hoá tạo sản phẩm nitrit NO2- và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO3- Xác định

sự hiện diện của NO3- bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dich có màu xanh

- Quá trình phản nitrat hoá

Là quá trình khử NO3- qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng của vi sinh vật Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phần nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thể hiện sự hình thành các bọt khí trong môi trường nuôi cấy