báo cáo thí nghiệm vi sinh môi trường - luận văn, đồ án, đề tài tốt nghiệp

Đê ông nghiệm tránh Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4... Kỹ thuật pha môi trường chứa, đóng nút bông, bao gói giấy báo Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi tr

TRUONG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THUC PHAM

THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

-==#»s& LEÌ@»s@

Bio edo: TH NGHIEM

VI SINH MOI TRUONG

SVTH: Ngô Thái Bảo : 3009110516

Trần Thị Hồng Cắm:3009110470 Trần Thiên Ân:3009110373

Nguyễn Dũ:3009110440

TP.HCM.tháng 6 năm 2013

PHAN 1: DUNG CU VÀ THIẾT BỊ, -22-°©E+++#E++E£+EEE++etEEEEEttEEEExeetrEExretrrrxrrrrrrrrrrrrrrrree 1

1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn hỌC:: - - + + + E*E*EEk£E Event tr 1

LL nh 1

PHAN 2: MỘT SÓ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH -s2 10

2.2.1 Kỹ thuật tiêu bản tạm thời

2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường - + + 52+ vvvvrrxgvrrrrrkrrrrrrrkrkrrrrrkrrrrrrrkrererrrre 11 2.2.3 Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : . 2222+2222E222v+222E2E2EE.222E1111 2 1 rrrrrrer 12

2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật -c:+ 5222222cct22222 2E 22211111 1 2111111 1111 1xee 13

2.2.5 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật - +22 ss+xveverrtrrkrrrrrrrrrrkrrrrrrrrkrrrrrrrrrrerrrrrre 15

2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu -©2222+222E++2EEEEErtEEEErtttErtrrrttrrrtrtrrrrrrrrrrrrrierrer 18 2.2.7 Phương pháp hộp đổ -ccc+++222Vc+2+++t2EEEE2 E227 xe 19

2.2.8 Phương pháp hộp trải . ¿-5- 5-5-5252 St xxx 20 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn - 2-55 StS*S*‡*+E#E#EEEvExrxexererrertrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrrerrree 2 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) - + 55+ 5+ S+S*2*+E+£e£ezexexerersrersrrrree 23 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính Win View eeccccccssssseesscccesssssessccessssnssesccesssssseeseceessntssseseesssneeeeseessnnneess 26

PHAN 3: KET QUA PHAN TICH VI SINH MÔI TRƯỜNG 2-+£+Eez+2++ez+crzxe 28

3.1 Vi sinh vật phân giải celÏuÏOse ¿5-2 5++*+*+x* + +#+t+xexeEeErtrrrvererrrrrrrrrrrrkrrrrrrrrrrerrrrrre 28 3.1.1 Nguyên tắc

3.1.2 KẾ quả 222222 s22 12122222 1 2 1 1 1 28

E1 31 3.2 Vi sinh vật phân giải phOsphOr . ¿-+- 5-5525 +v++xexeEeEtrtrvrterrrrrrrrrrrkrrrrrrrrrrerrrrrre 31 3.2.1 Nguyên tẮC -2c2ccc222 22 2222211111 1 1 1 31

3.4.2 KẾ quả -52222cv 2222221111222 TT 1 1 re 36

3.5 Vi sinh vật trong xử lý nước thải: . ¿ - + +52 s++xevevertrrrtrterrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrerrrrrre 38

3.5.1 Nguyên tẮC -. cc-+22 22 t2 1111 1 2 1 1 1 xee 38 3.5.2 Kết quả 22222vv 22222211 1.2221.111 T1 xee 40

PHAN 1: DUNG CU VA THIET BI

1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học:

Dùng để chứa đựng

dung dịch với thể

tích nhỏ, nuôi cấy vi

sinh vật trong môi

trường lỏng hay môi

Bình tam giác

Coc thiy tinh

Trải giọt ` sinh khôi

'VSV lên bê mặt thạch Que trang

hay phan lap VSV

môi trường nuôi cấy

hay dung dịch hóa chất

kia dùng khi miệng

Nghiền nhỏ mẫu đất

Cối

dé bay hoi trong không khí

báo,gang tay, khâu trang đã sử dụng

Đê ông nghiệm tránh

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 4

va hai giỏ inox ra ngoài `

Nôi hâp " Cho nước cât vào nôi

khử trùng hâp đên khi ngập con ôc cảm

ứng khoảng 1-2 cm tiếp tục cho giỏ inox lớn vào nổi

môi trường ra (nếu muốn hạ

áp suất của nồi hấp thì mở nắp nồi hắp )

Tủ sấy

— Mở cửa tủ sây cho vật liệu sấy vào và đóng lại ( đây thanh tay cầm sang trái để

thời gian sây ( dùng phím

“AW” dé cai thoi gian), nêu chạy liên tục thì để thời gian

cài đặt bằng 0

— Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài ở bước 4

và 5

- Khi đạt nhiệt độ sấy màn hình nhấp nháy liên tục hai thông số đã cài đặt, khi thời gian cài đựt về 0 thì kết

thúc quá trình sấy, tắt tủ sấy lấy vật liệu sấy ra

+ Bật công tắc lên nếu

muốn sử dụng chế độ lắc gián đoạn(Manual) Nhấn

nhẹ và giữ chặt ống nghiệm trong vài giây rồi nhấc ống nghiệm ra

+ Bật công tắc xuống nếu muốn sử dụng chế độ lắc liên

PHAN 2: MOT SO KY THUAT CO BAN TRONG PHAN

TICH VI SINH

2.2.1 Kỹ thuật tiêu bán tạm thời

Nội dung công

2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường

chứa, đóng nút bông, bao

gói giấy báo

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 11

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 12

Bước 3: Làm nút bông

và bịt nắp ông nghiệm

2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 13

mẫu và ông cây)

o Tay phải cam

o Rồi đưa que cấy

vào đáy ống nghiệm

ria theo đường dzích

dzăc từ dưới kéo về

o Đóng nút bông lại

o Khw tring que cay va dé

lắc xong, tay

phải cam que cấy, dùng ngón tay Út mở nút

bông, khử trùng

nghiệm bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn nghiệm gần ngọn lửa Dat petri va ông

Bước 5:

o Khử trùng que cấy trên

ngọn lửa đèn cồn

cho đến khi nóng

đỏ

o Đưa que cấy vào giữa ống nghiệm chứa

để que cấy trong không gian vô trùng

© Tay trái

mở nắp petri, tay phải cam que cấy ria trên bề

o6 Chú ý thao tác cẩn

6 Ghi tên sinh

viên, môi trường, tên

VSV lên đĩa petri và

bao gói lại bảo quản

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 17

2.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu

* Với mẫu nước

Nội dung công việc Hình ảnh minh họa | Ghỉ chú

Bước 2: Dùng pipette vô

trùng hút Iml mẫu cho

vào ống nghiệm chứa 9ml

Bước 1: Chuan bi mau dat,

ding céi gid dat nhuyén

ra, can 10g cho vao binh

tam giác có chứa 90ml

2.2.7

Bước 2: Lắc đêu bình tam

giá chứa mẫu, dùng

pipette hút Iml cho vào

o Petri, pipette,bao gói

giấy báo và đem hấp khử

trùng

làm việc bằng đèn cồn đều trước khi hút

khử trùng hút 1ml dịch vsv

cho vào đĩa petri vô trùng

chưa có môi trường

trang trong suốt

quá trình thao tác thí nghiệm

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 19

vao dia petri da cấy giống

vsv, day nap dia petri

Dat dia petri lén mat

phang ngang, xoay nhe dia

petri theo 2 chiéu ngugc

hiện trong không gian vô trùng (gân

đáy của đĩa petri và trộn

đều trong môi trường cấy

Đợi môi trường đông, lật

ngược đĩa petri lại, bao gói

và đem bảo quản ở nhiệt độ

o St dung cac dia petri

chứa môi trường đã chuẩn

trình tiến hành

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 20

lên bề mặt môi trường ngọn lửa đèn cồn

thạch đĩa trong không gian

vô trùng

70, đốt trên ngọn

lửa đèn cồn để khử

trùng

o Mo dia petri, dùng que trang gạt

và xoay đều giọt vsv

trên bề mặt thạch

Trong khi gat,xoay

dia petri toi lui 3 — 4

lần, mỗi lần % chu vi

cho dich vsv trai déu khắp trên bề mặt môi trường

o Dan nhan, bao

gói, bảo quản ở nhiệt

2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn

cho I giọt sinh khôi vsv

trải đều lên phiến kính, hơ

trên ngọn lửa đèn cồn cho

Bước 3: Hơ lại trên ngọn

lửa đèn cồn, để yên khoảng

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 22

cedre lên vêt nhuộm, dưa =—— -

lên bàn mẫu, điều chỉnh

2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram)

Nội dung công việc Hinh anh minh hoa Ghi chú

Bước 2:Nhuộm vết bôi

bằng dung dịch tím kết tỉnh

6 Nhỏ 2 giọt methyl violet lên vết bôi giữ 30 giây

© Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm rồi hơ khô

hết màu và hơ khô

sarañn lên vết bôi,

đê yên 30 giây

o Rua vét bôi bang nước, hơ khô

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 26

mẫu vật sau cho mẫu

vsv phải nằm trong vùng thị trường

quang,đóng bớt chắn sang sao cho nhìn rõ đươc hình ảnh

o Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính lớn hơn và điều chỉnh ốc

| dụng xong | | |

PHAN 3: KET QUA PHAN TICH VI SINH MOI TRUONG

3.1 Vi sinh vat phan giai cellulose

3.1.1 Nguyên tắc

- Cellulose (CaH¡gO¿)ạ là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Hằng năm

có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc đù là chất cao phân tử, khá bền,

chúng vẫn bị phân giải đưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ âm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau

- Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa lớn trong quá trình xử lý môi trường

- Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose Dưới tác dụng

của enzyme nay, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C¡;H›;O¡¡) lại tạo thành

ølucose (CzH¡2O¿) nhờ tác dụng của enzyme celloblase

- Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuân, nắm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng

3.1.2 Kết quả

- Kết quả phân tích :

Tính kết quả:

Số tế bào/g =N x = xnx K=26x m x 10000 x 1= 26.10” (tế bào/g)

N: Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)

V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)

n: số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10 >n=10000) K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=l)

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 28

- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ

- Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được

- Hình ảnh vi nắm phân giải cellulose, mô tả chỉ tiết

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 29

3.1.3 Nhận xét:

- Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu

- Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường đề tận dụng hết bề mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy

- Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài

3.2 Vỉ sinh vật phân giải phosphor

3.2.1 Nguyên tắc

- Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyên hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoj vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác nhau

- Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Caz(PO/); Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt

3.2.2 Kết quả

- Nong độ pha loãng 107: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được

- Nong dé pha loãng 10: gồm 76 khuẩn lạc, khuẩn lạc có màu trắng xung quanh có những vòng phân giải trong suốt

N: Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)

V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)

n: số nghịch đảo của nồng độ pha loãng

K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=l)

- Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chỉ tiết

3.2.3 Nhận xét:

- Khi đồ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay đề tránh nhiễm vi

sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đồ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử

khuẩn của đèn cồn

-_ Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn

- Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm

khác dé hoàn thiện bài báo cáo

3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá

3.3.1 Nguyên tắc

- Quá trình mtrit hoá

NH¿ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO; gọi là quá trình nitrit hoá ÑOz sẽ tác dụng với dung địch Griss I và

Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng

- Quá trình nitrat

NH¿ đưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để

biến thành NO;ˆ gọi là quá trình nitrat hoá Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hod tạo sản phâm nitrit NO; và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO;' Xác định

sự hiện diện của NOx bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dịch có màu xanh

- Qué trinh phan nitrat hoa

Là quá trình khử NO; qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng

của vi sinh vật Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phan nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thé hiện sự hình thành các bọt

khí trong môi trường nuôi cấy

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 32

3.3.2 Kết quá

3.3.2.1 Vi khuẩn amon trong môi trường lồng:

- Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau:

Sự đục môi trường

L] Sự tạo bông, cặn

CO Sự nổi váng trên bề mặt

- Phản ứng sinh hoá:

Sự biến đổi màu sắc của giấy thử pH: giá trị pH

TÏl Sự biến đổi màu của giấy lọc thấm acetate chì

Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của giấy pH

- Sau vài ngày,trong quá trình nuôi cấy không ngừng sinh ra bọt khí và trên bề mặt

môi trường có một lớp bọt khí Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO; và sinh ra khi Np

3.3.2.2 Vi khuan nitrat hoa:

- Phản ứng định tính nitrit:

Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng

Nhỏ I giọt dung dịch Griess I, Griess II : mau hồng

- _ Chọn ống nghiệm đương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi

-_ Mô tả,so sánh các hình thái tế bào vi khuẩn quan sát được về: hình đạng,khả năng

di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo

Báo cáo thí nghiệm vi sinh kỹ thuật môi trường Page 34

Hình: Sự đổi màu của vi khuẩn Nitrat

3.3.2.3 Vi khuẩn phản Nitrat hoá:

khuynh hướng thoát ra ngoài như các bong bóng nỗi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trén

bề mặt môi trường nên không khí bên ngoài không vào được và nito bên rong môi trường

cũng không thoát ra ngoài được Trong quá trình thí nghiệm cần thao tác cần thận tránh

dé không khí bên ngoài vào

- O quá trình nitrat hóa: sự đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động của

vi khuẩn mạnh

3.4 E.coli,Coliform

3.4.1 Nguyên tắc

- Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms

phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable

number)

- Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy nồng độ thập phân; 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm có môi

trường thích hợp có ống Durham bẫy khí Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại

- Theo đối sự sinh hơi và đôi màu đề định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm, đây

là các ống đương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện

diện trong 1g (hoặc Iml) mẫu ban đầu