PHỤC TRÁNG GIỐNG lúa JASMINE 85 có CHẤT LƯỢNG tốt

Ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE và một số kỹ thuật phân tích phẩm chất gạo của IRRI để phục tráng giống Jasmine 85 này và kết quả thí nghiệm đã chọn được 2 dòng lúa Jasmine 85

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ TRUNG HIẾU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện:

PGS.Ts Võ Công Thành Lê Trung Hiếu 3087636 Ths Quan Thị Ái Liên

Cần Thơ, 2012

i

Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

CHỌN DÒNG THUẦN TỪ GIỐNG LÚA JASMINE 85 THEO HƯỚNG THUẦN, PHẨM CHẤT TỐT

Do sinh viên Lê Trung Hiếu thực hiện

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày ….tháng…….năm 2012 Cán bộ hướng dẫn

PGs.Ts Võ Công Thành

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN DI TRUYỀN – GIỐNG NÔNG NGHIỆP

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt Kỹ sư ngành Khoa học cây trồng – Chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

CHỌN DÒNG THUẦN TỪ GIỐNG LÚA JASMINE 85 THEO HƯỚNG THUẦN, PHẨM CHẤT TỐT



Do sinh viên Lê Trung Hiếu thực hiện và bảo vệ trước Hội Đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Luận văn tốt nghiệp được đánh giá

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012 Hội đồng

DUYỆT KHOA Trưởng Khoa Nông Nghiệp

iii

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Lê Trung Hiếu

iv

QUÁ TRÌNH HỌC TẬP



I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Họ và tên: Lê Trung Hiếu Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 12/08/1990 Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: TP Cần Thơ

Địa chỉ thường trú: 379 AC2 Đường số 5 KDC Hồng Phát, Phường An Bình, Quận Ninh Kiều, TP Cần Thơ

Ngày tháng năm 2012

Người khai

Lê Trung Hiếu

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

 PGs.Ts Võ Công Thành người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong việc nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp này

 Ths Quan Thị Ái Liên đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

 Ks Nguyễn Thị Mai Hạnh và Ktv Đái Phương Mai đã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện tốt các công việc trong phòng thí nghiệm

Xin chân thành cảm ơn

 Ths Hứa Minh Sang, Master Trần Ngọc Quý, Ks Nguyễn Thị Ngọc Hân, Ks Trần Thị Phương Thảo, Ktv Đặng Thị Ngọc Nhiên

đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong việc phân tích mẫu trong phòng thí nghiệm

 Ktv Võ Quang Trung, Ktv Nguyễn Bùi Khiêm, Ktv Nguyễn Thành Tâm đã giúp đỡ tôi các công việc ngoài nhà lưới

 Các bạn sinh viên khóa 34 và các em sinh viên khóa 35 tại phòng thí nghiệm Chọn giống và ứng dụng CNSH, Bộ môn Di truyền Giống Nông Nghiệp, Khoa Nông nghiệp và SHƯD – ĐHCT đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện Luận văn

 Tôi xin ghi nhớ những tình cảm thấm thiết của 67 sinh viên trong tập thể lớp Công nghệ giống cây trồng khóa 34 những người đã cùng tôi trải qua những năm tháng vui buồn của thời sinh viên

vi

TRẦN BẢO TRUNG, 2012 “Chọn dòng thuần từ giống Jasmine 85 theo

hướng thuần, phẩm chất tốt” Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Khoa học cây trồng -

Chuyên ngành Công nghệ giống cây trồng, trường đại học Cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn: PGs.Ts Võ Công Thành và Ths Quan Thị Ái Liên

TÓM LƯỢC

Hiện nay giống lúa Jasmine 85 là một trong những giống lúa thơm chất lượng cao nằm trong cơ cấu giống lúa phục vụ cho việc xuất khẩu với diện tích canh tác trên hàng chục ngàn hecta tại Đồng bằng Sông Cửu Long Nhưng sau nhiều năm canh tác giống lúa này đã bị thoái hóa và lẫn tạp do nhiều nguyên nhân Vì lý do trên nên đề tài phục tráng giống Jasmine 85 được thực hiện nhằm mục tiêu chọn được dòng lúa Jasmine 85 thuần, thơm và phẩm chất tốt Ứng dụng kỹ thuật điện di protein SDS-PAGE và một số kỹ thuật phân tích phẩm chất gạo của IRRI để phục tráng giống Jasmine 85 này và kết quả thí nghiệm đã chọn được 2 dòng lúa Jasmine 85 thuần, thơm có phẩm chất tốt Dòng 1 (amylose= 18.42%; protein= 9.43%; TGST= 95 ngày), dòng 3 (amylose= 16.32%; protein= 8.51%; TGST= 95 ngày)

1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử cải tiến chất lượng hạt giống 2 1.1.1 Kỹ thuật SDS-PAGE protein 2 1.1.2 Những nghiên cứu liên quan đến protein hạt 3 1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật DNA trong chọn giống 5 1.2 Sơ lược về cây lúa 8 1.3 Chỉ tiêu đánh giá phẩm chất hạt gạo 10 1.3.1 Hàm lượng Amylose 10 1.3.2 Hàm lượng Protein 11 1.3.3 Nhiệt trở hồ 13 1.3.4 Độ bền thể Gel 14 1.3.4 Tính thơm của lúa 14

2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Thời gian và địa điểm 16 2.2 Vật liệu thí nghiệm 16 2.3 Phương pháp 17 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu chung 17 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể 18

3 KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 26

3.1 Chọn cá thể từ giống Jasmine 85 ban đầu 26 3.2 Kiểm tra tính thơm bằng kỹ thuật DNA 27 3.3 Chỉ tiêu nông học các dòng lúa Jamine 85 phục tráng 28 3.4 Phân tích chỉ tiêu phẩm chất 31 3.5 Kiểm tra độ thuần các dòng lúa bằng SDS-PAGE 33

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

ix

Bảng Tựa bảng Trang

1.1 Các loại DNA Marker 6 1.2 Hàm lượng Amylose trong gạo theo thang điểm của IRRI (1980) 10 1.3 Phân cấp mùi thơm theo thang điểm của IRRI 1988 15 2.1 Công thức pha dung dịch tạo một gel 19 2.2 Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng Amylose cho lúa (IRRI,1988) 24 2.3 Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979) 25 2.4 Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979) 25 2.5 Phân cấp độ bền thể gel theo thang đánh giá của IRRI (1996) 26 2.6 Phân loại chiều dài hình dạng hạt gạo (Khush and Paul, 1979) 27 3.1 Chiều cao cây, tổng số chồi, số chồi hữu hiệu và thời gian sinh

trưởng của các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng 29 3.2 Trọng lượng 1000 hạt, chiều dài bông, số hạt chắc trên bông và

tỷ lệ chắc các dòng Jasmine 85 phục tráng 30 3.2 Hàm lượng Amylose và Protein các dòng Jasmine 85 phục tráng 31 3.4 Độ bền thể gel các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng 32

x

DANH MỤC HÌNH

Hình Tựa hình Trang

1.1 Cấu trúc hạt lúa 9 1.2 Phổ điện di Protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa

(Tanaka origimal, 1988) 13 2.1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng cho điện di SDS-PAGE 17 3.1 Phổ điện di Protein tổng số giống lúa Jasmine 85 ban đầu 26 3.2 Những cá thể được trồng riêng thành dòng trong nhà lưới 27 3.3 Hình gel DNA của các dòng lúa Jasmine 85 phục tráng 27 3.4 Chiều cao cây 28 3.5 Độ bền thể gel 32 3.6 Phổ điện di protein tổng số của dòng 3 Jasmine 85 phục tráng 33

MỞ ĐẦU

Hàng nghìn năm qua, lúa gạo có tầm quan trọng sống còn đối với hơn một nửa dân số thế giới

Nó là loại lương thực chủ yếu hiện nay của hàng tỷ người dân ở Châu Á, Châu Phi, Mỹ La Tinh và khu vực Trung Đông Trong tương lai, nó vẫn là loại lương thực hàng đầu

Việt Nam là một nước có nền nông nghiệp rất phát triển Trong đó, cây lúa là cây trồng lâu đời, là cây lương thực chủ yếu và là nguồn thu nhập chính của người dân Hiện nay, Việt Nam

là một quốc gia có sản lượng lúa gạo xuất khẩu đứng hàng thứ hai trên thế giới

Những năm gần đây nhu cầu sản xuất lúa gạo chất lượng cao phục vụ cho xuất khẩu luôn là mục tiêu hàng đầu của nền nông nghiệp Việt Nam Gạo thơm Việt Nam xuất khẩu tăng hơn 100% trong khi gạo chất lượng thấp xuất khẩu đã giảm gần 62% Và một trong những giống lúa thơm chủ lực trong cơ cấu giống chất lượng cao là Jasmine 85 Được nhập vào Việt Nam

từ những năm 1990, Jasmine 85 là giống lúa ngon cơm, thơm nhưng qua nhiều năm canh tác giống này đã bị lẫn tạp, thoái hóa do nhiều nguyên nhân

Kỹ thuật điện di protein SDS PAGE cho phép thanh lọc được các dòng bị thoái hóa và lẫn tạp, đồng thời kỹ thuật này cũng giúp xác định được những dòng ưu tú có chất lượng gạo đáp ứng được các yêu cầu cho xuất khẩu cũng như tiêu thụ nội địa theo ý muốn như ngon cơm (nâng cao cả hàm lượng protein tổng số và protein thành phần như Glutenlin hay Globulin), đồng thời đạt được hàm lượng amylose thấp đáp ứng theo yêu cầu xuất khẩu Vì vậy việc phục tráng giống lúa Jasmine 85 đã thoái hóa nhằm tạo ra các dòng lúa chất lượng tốt hơn để phục vụ cho việc xuất khẩu là yêu cầu rất cần thiết

Xuất phát từ những yêu cầu trên đề tài thực hiện: “PHỤC TRÁNG GIỐNG LÚA JASMINE

85 CÓ CHẤT LƯỢNG TỐT” Nhằm mục tiêu: Chọn được từ 2-3 dòng thuần, thơm có hàm

lượng amylose ≤20%, protein ≥8%

2

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Ứng dụng chỉ thị phân tử cải tiến chất lượng hạt giống

1.1.1 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di (Davis E Garfin, 1985) bao gồm các bước: ly trích protein, tinh sạch protein, và điện di Trong dịch ly trích protein thường người ta dùng chất đệm Tris-base (pH>10), chất tẩy SDS, 2-Mercaptoethanol Khi đun nóng hỗn hợp protein trong dung dịch có dung dịch đệm SDS (2%) và nhờ vào chất hóa học có gốc thiol (2-mercapthoethanol) với nồng độ thường là 5%, protein sẽ bị phân cắt các cầu nối lưu huỳnh và biến tính thành các polypeptide mà vẫn giữ cấu trúc của nó nhờ sự áo của 1,4g SDS vào 1g polypeptide Ornstein Davis (1964)

Hơn nữa, mật độ điện tích SDS-polypeptide sẽ độc lập với pH trong khoảng từ 7 đến 10 Phân đoạn protein trong gel bị lưới của acrylamide ngăn chặn nên tách rời các polypeptide Dựa theo nguyên lý trên người ta cho thêm protein chuẩn có trọng lượng phân tử biết trước để xác định trọng lượng phân tử của các polypeptide trong phổ điện di để phát hiện protein, người ta thường dùng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 (0,1-1 g) cho mỗi vạch protein trong phổ điện di (Somith, 1974) hay nhuộm bạc 2-10 ng cho mỗi vạch protein (Ornstein-Davis 1964)

1.1.2 Những nghiên cứu liên quan đến protein hạt

Protein được xem là chỉ thị di truyền trong công tác chọn giống

Giống như DNA và enzyme, protein dự trữ cũng đã được dùng làm dấu phân tử trong công tác chọn tạo giống vì:

Chúng có độ đa hình cao ngay cả bên trong và giữa các quần thể Tập đoàn giống lúa cổ truyền trồng ven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Việt Nam có độ đa dạng di truyền tương đối cao (Vương Hỗ, 2003) Đa dạng di truyền về glutelin có trọng lượng phân tử cao ở lúa mì hoang

dại (Triticum turgidum var dicoccoides) có phân phối bằng nhau bên trong cũng như giữa các

quần thể lúa mì trồng Paul Gepts, (1990)

Độ đa hình của chúng được xác định phần lớn là do di truyền Bởi vì các mức độ đa hình và tính ổn định môi trường cao nên protein dự trữ có thể dùng để xác định giống hay liên quan đến các dấu (Marker) khác Xác định giống thông qua protein của hạt đã áp dụng ở cây lúa mì, đậu faba, lúa đại mạch, bắp… Độ đa hình protein dự trữ bên trong loài cũng đã được xác định

ở nhiều loài cây trồng và mối quan hệ của nó với loài hoang dại Đậu Phaseolus, đậu phộng, bắp, đậu nành (Mori và ctv., 1987) Kết quả so sánh với phương pháp phân tích bằng isoenzyme, người ta thấy rằng kỹ thuật protein phát hiện đa dạng hơn gấp nhiều lần, thí dụ trong thí nghiệm của Paul Gepts, (1990) đánh giá rằng protein dạng hordeins mức độ đa dạng gấp 10-30 lần

Kiểm soát di truyền về các biến dị di truyền chất lượng thì đơn giản và bao gồm một số locus

có giới hạn nằm trong bộ gen trong nhân tế bào Gene conglycinin hay globulin 7S ở hạt đậu nành quyết định đến phẩm chất chế biến, bao gồm protein ',  và  đều do một gen kiểm soát (Kitamura và ctv., 1984)

Tính đồng dạng về protein dự trữ của các loài khác nhau sẽ được xác định Các nguồn phân tử

về tính đa hình protein dự trữ đã được biết cho thấy hầu hết các thể biến dị protein là đồng nhất

và do đó có thể được xem như là các chỉ thị (marker) về tiến hóa

Kiểm tra sự khác biệt giữa các loài

Dựa trên phân tích trọng lượng phân tử khác nhau của protein dự trữ mà người ta đánh giá tính

đa hình và phổ biến Do vạch protein trong phổ điện di là kết quả của một chuỗi phức tạp ở mức độ phân tử nên không có một vạch protein nào có thể xuất hiện hai lần, do đó mỗi mẫu có một nguồn gốc riêng và các kiểu gen có cùng dạng mẫu là có nguồn gốc chung Kết quả phân

4

tích nầy giống như kết quả phân tích trên mức độ chuỗi trình tự DNA bởi vì các protein dự trữ được mã hóa do một số locus phức tạp có giới hạn Hơn nữa, nghiên cứu sinh học phân tử và hóa học của các protein dự trữ cho thấy có sự đồng dạng giữa các thành phần protein có tính phổ biến trong hệ thống phân loại (Paul Gepts, 1990) Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền và phân biệt hai loài lúa hoang ở ĐBSCL dựa vào mức

độ ăn màu Coomassie của băng protein chỉ thị dạng glutelin và dạng prolamin (Phạm Văn Phượng, 2006)

Nghiên cứu sự tiến hoá của loài (cây phả hệ)

Giống như mức độ biểu hiện DNA, sự biểu hiện mức độ ăn màu protein cũng được ghi nhận ở mức độ nhị phân, có ăn màu được ghi nhận là 1, không có ăn màu do đột biến các amino acid bên trong sẽ được ghi nhận là 0 Từ đó, dựa vào sự giống nhau hay khác biệt các băng protein

để tính theo chỉ số Jascard và chuyển đổi ma trận sự khác biệt để lập biểu đồ nhóm (cluster) để cho ta thông tin về mối quan hệ tiến hóa giữa các loài Thông qua biểu đồ như vậy nhà chọn giống sẽ chọn lựa và tiến hành chọn cặp cha mẹ để lai (Võ Công Thành và ctv., 2003)

Xác định độ thuần của giống cây trồng

Khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất, và tính ổn định của giống cây trồng DUS (Distinctness, Uniformity, và Stability) thường dựa trên các phương pháp hình thái nên kết quả thường phản ánh không chính xác do ảnh hưởng của môi trường Các dấu hình thái thường chưa phản ánh hết hoàn toàn tính đa dạng di truyền giữa các giống có sự giống nhau chồng chéo về dạng hình và các mẫu giống đồng nhất về hình thái Do đó, nhà chọn giống cần có một công cụ mới để phân biệt được Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzyme và protein (Paul Gepts, 1990) Phương pháp phân tích nội nhũ từ ½ hạt lúa không chứa phôi bằng

Kỹ thuật điện di SDS-PAGE protein giúp nhà chọn giống chọn được những cá thể ưu tú chất lượng cao từ những quần thể giống đã bị thoái hóa Dòng 007 giống lúa Tài Nguyên mùa; Dòng 124 giống lúa Klong Kluong; Dòng 03 giống lúa VD20 và dòng 1-2 giống lúa Nếp Bè được chọn lọc dòng thuần từ 4 giống lúa đặc sản đã bị thoái hóa (Phạm Văn Phượng ,2006)

1.1.3 Ứng dụng kỹ thuật DNA trong chọn giống

Việc cải thiện những giống lúa thơm bằng cách áp dụng các biện pháp lai tạo cổ điển rất khó thực hiện được do một số tính trạng chất lượng có thể bị mất trong quá trình thụ phấn và tạo hợp tử Để khắc phục hiện tượng đó kỹ thuật sinh học phân tử có thể được coi là một giải pháp

có hiệu quả Một số thành tựu đó như là sử dụng RFLP marker RG 28 để phát triển gen mã hoá tính thơm, hay marker RZ 323 liên quan đến sự giản nở của chiều dài hạt ở giống Basmati 370 (Ahn và ctv., 1993)

Ngoài các RFLP marker còn có kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) cũng được sử dụng để phát hiện gen thơm của lúa Năm 1995, Jin và ctv., đã phát hiện ra một con mồi, Jas 1.5, có thể dùng để phân biệt giữa các giống lúa thơm và giống lúa thường

Tìm được marker cho gen qui định mùi thơm của lúa, band thơm có trọng lượng phân tử là 257bp, band không thơm có trọng lượng phân tử là 355bp (Louis và ctv., 2005)

 Các loại DNA Marker:

Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem như là một DNA marker Các DNA marker có thể được chia thành hai nhóm như sau:

 PCR- based : ALP, AFLP, SSR, SSCP

 DNA/ DNA hybridization-based : RFLP, minisatellite

Các marker thuộc nhóm PCR-based có thể được chia nhỏ thành:

 Marker ngắn, có tính ngẫu nhiên: RAPD, AP-PCR, DAF, AFLP

 Amplicon đơn: ALP, SSR, SSCP

Bảng 1.1 Các loại DNA marker

Marker Tên đầy đủ

RFLP Restriction frament length polymorphism

ALP Amplicon length polymorphism

AFLP Amplified fragment length polymorphism

RAPD Random amplified polymorphicDNA

DAF DNA amplification fingerprinting

6

SSR Simple sequence repeat (microsatellite)

AP-PCR Arbitrary priner-PCR

SSCP Single strand conformation polymorphism

MRDHV-DNA

Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatelltie)

 Nguyên tắc cơ bản của PCR

Phản ứng chuỗi của polymerase thường được viết tắt là PCR (polymerase chain reaction) Đây

là một kỹ thuật phân tử tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi mã hóa di truyền DNA bằng cách phát triển primer một cách đồng loạt trên các dây đơn DNA Toàn bộ tiến trình được hoàn thiện do sự biến chất của DNA cần thiết, sự tác động của các primer tại đầu của các dây đơn DNA này, kế đến là sự phát triển của các primer do phản ứng DNA polymerase

Có hai vấn đề chính trong nguyên tắc PCR:

 Polymerase được sử dụng là những enzyme sống, nhạy cảm về độ nhiệt, phải được thêm vào trong mỗi chu kỳ

 Phải có một quy trình hướng dẫn cụ thể trong khi thực hiện từng giai đoạn của chu kỳ PCR

Cả hai tiến trình nói trên đều nặng nhọc và bất lợi cho các nhà nghiên cứu, nếu họ có phương tiện quá hạn chế khi áp dụng PCR

Tuy nhiên, trong thiên nhiên vẫn có những sinh vật có thể sống ở nhiệt độ cao Thí dụ

polymerase được phân lập từ Thermus aquaticus có khả năng là vật thể ổn định về nhiệt lượng

Taq polymerase có hai thuận lợi chính: [i] hồi phục sau khi tác động nhiệt không cần kéo dài, [ii] enzyme này rất hoạt động ở nhiệt độ cao, lúc đó việc tác động của các primer ở đầu dây đơn sẽ chuyên biệt hơn và sinh tổng hợp DNA sẽ nhanh hơn

DNA polymerase được dùng phổ biến là Taq polymerase, lấy từ Thermus aquaticus, có tính ổn

dịnh nhiệt rất cao Một nửa chu kỳ của Taq polymerase được giữ ở nhiệt độ 940C trong vòng

40 phút Taq polymerase có một mức tối hảo về nhiệt độ cao trong sinh tổng hợp DNA

[70-720C] Ở quảng nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của Taq polymerase có thể cao như 150 nucleotide/giây/enzyme Do đó người ta phải cố gắng phát triển ở quãng nhiệt độ 70-720C trong vòng một phút Từ đó hàng kilo bp của các đoạn DNA có thể được tổng hợp

Taq polymerase nhạy cảm với ion magnesium Nồng độ tối hảo của Mg2+ là 1,5-2,5mM Vì deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) có thể gắn với Mg2+, cho nên nồng độ chính xác của magnesium tùy thuộc vào nồng độ của dNTP Các thành phần khác ít mẫn cảm với Taq polymerase là KCL và Tris

 Primer và dNTP

Trong PCR tiêu chuẩn, người ta cần có một cặp primer Sự khuyếch đại chuyên biệt nào đối với một đoạn DNA cần nghiên cứu, đều phải tùy thuộc các primer tương xứng Cả hai yếu tố: chiều dài primer và thành phần G+C đều có ảnh hưởng quan trọng đối với nhiệt độ trong quá trình tác động ở đầu dây đơn Nhiệt độ này sẽ là 2x (# của A+T) + 4x(# của G+C) + 50C nếu

có 50% G+C, thì chiều dài của primer phải có kích thước tương ứng là 18-20 nucleotide

Người ta thường mua các nucleotide ở các công ty hóa chất, có chất lượng tốt Nếu nó được bảo quản ở dạng bột đông khô [freeze-dried powder] Sau đó người ta phải điều chỉnh lại độ

pH, trước khi sử dụng

 DNA mục tiêu (Target DNA)

Người ta cần phải có các đoạn DNA mang mật mã đã biết trước, được gọi với thuật ngữ “target DNA” trong kỹ thuật PCR người ta sẽ nhận được những kết quả tốt nhất, nếu DNA thật sự thuần khiết, DNA từ mô lá Số lượng DNA cần cho một phản ứng không nhiều lắm, chỉ cần 5-

10 ngDNA thuần khiết, đủ để cho những kết quả theo mong muốn Người ta cần có ethanol trong lần cuối của quy trình chuẩn bị DNA Với 10% ethanol, nó vẫn chưa có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của Taq polymerase

8

Điều ghi nhận quan trọng là: phải có một mM EDTA trong chất đệm TE trong khi sử dụng để hòa tan DNA EDTA sẽ gắn với Mg2+, sao cho thể tích của DNA mục tiêu không vượt quá 1/5 của thể tích PCR

 Phát hiện DNA có tính đa hình nhờ PCR

Sản phẩm của PCR là những đoạn mã DNA Khi DNA xuất phát từ hai dòng lai với nhau được khuếch đại lên nhờ các primer tại locus đặc biệt nào đó, thì trọng lượng phân tử của sản phẩm PCR này có thể rất khác nhau, vì có những thay đổi vật lý trên chuỗi mã DNA, nghĩa là, sự mất đoạn hay thêm đoạn DNA sẽ xảy ra trong vùng bị khuyếch đại nầy Thể đa hình này được gọi là “amplicon length polymorphism” [ALP] phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể/ các dòng lai/ các giống lúa Thuận lợi của ALP so với RFLP trong việc phát hiện này là:(1) nó rất nhanh, chỉ cần một ngày giúp ta tìm ra kết quả, (2) không có chất đồng vị, (3) rẻ tiền, (4) cần rất ít DNA Bất lợi của ALP là người ta phải biết rõ chuỗi mã DNA đầu tiên khi tổng hợp primer

1.1 Sơ lược về cây lúa

Đặc điểm hình thái cây lúa

 Rễ

Rễ lúa thuộc loại rễ chùm, có chức năng giữ vững cây trong đất và hút nước, dinh dưỡng để nuôi cây Rễ lúa có hai loại: rễ mầm và rễ phụ Khi hạt nảy mầm, rễ xuất hiện đầu tiên là rễ mầm Tiếp theo là các rễ khác mọc ra từ các đốt thân (rễ phụ) và khi cây lúa có một lá thật thì cây lúa đã có 4-6 rễ mới Càng về sau số lượng rễ càng nhiều Số lượng rễ nhiều hay ít tùy thuộc vào số mắt ở đốt thân Bộ rễ lúa thường có khoảng 500-800 rễ với tổng chiều dài 168 m

Số rễ đạt tối đa ở giai đoạn trước trổ bông và giảm khi vào thời kỳ chín (Đinh Thế Lộc, 2006)

 Thân

Thân lúa gồm hai loại: thân giả và thân thật Thân giả do bẹ lá kết hợp lại với nhau Thân thật được tạo nên bởi các đốt lóng kế tiếp nhau Nó được hình thành kể từ khi cây lúa phân hóa đốt

và là kết quả của sự vươn dài của các đốt Số đốt của thân nhiều hay ít tùy giống và ít thay đổi

do điều kiện của môi trường (Đinh Thế Lộc, 2006)

 Lá

Lúa là cây đơn tử diệp, gân lá song song Có ba loại lá: lá bao mầm, lá không hoàn toàn và lá thật Một lá thật có các bộ phận: phiến lá, thìa lá, cổ lá, tai lá, bẹ lá và ở một số giống còn có lông trên lá Trong đó, phiến lá giữ vai trò quan trọng vì đây là nơi diễn ra quá trình quang hợp Hình dạng và màu sắc lá khác nhau tùy giống Lá ra sau cùng là lá đòng Lá đòng có vai trò nuôi dưỡng bông lúa sau khi trổ (Đinh Thế Lộc, 2006)

 Hạt gạo

10

Hạt gạo gồm nội nhũ và phôi Nội nhũ được bọc bởi một lớp vỏ cám Màu sắc vỏ cám khác nhau tùy giống Bên ngoài còn được bọc bởi một lớp aleuron Tùy theo giống mà độ dày tầng aleuron khác nhau Nội nhũ là nơi dự trữ dinh dưỡng nuôi phôi Phôi là nơi dự trữ chất dinh dưỡng và nảy mầm tạo cây mới khi gặp điều kiện thuận lợi (Đinh Thế Lộc, 2006)

1.3 Chỉ tiêu đánh giá phẩm chất hạt gạo

1.3.1 Hàm lượng Amylose

Hàm lượng amylose là kết quả của kiểu gene và một vài thay đổi của môi trường (Heu and Part, 1976) Nó có thể biến động đến 6% khi trồng ở nơi này so với nơi khác từ vụ này sang vụ khác, nhiệt độ cao khi lúa chín cũng làm giảm lượng amylose (Jennings et al.,1979) Hàm lượng amylose trong hạt gạo là một yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phẩm chất của cơm,

nó tương quan nghịch với độ dẻo, độ mềm, độ bóng của cơm (Bao et al., 2001)

Bảng 1.2 Hàm lượng amylose trong hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1980)

Stt Hàm lượng Amylose (%) Đánh giá Phân loại gạo

William (1999) cho rằng ở nhóm Japonica có hàm lượng amylose cao khi sự phát triển của hạt

lúa trong điều kiện nhiệt độ thấp từ 15-20 0C và không có sự tương quan giữa nhiệt độ và hàm

lượng amylose ở nhóm Indica Cơ chế di truyền về hàm lượng amylose chưa được biết rõ

Heda and Reddy (1986) kết luận rằng hàm lượng amylose bị chi phối bởi hai cặp gene, hàm lượng amylose cao trội so với hàm lượng amylose thấp

Ở hạt lúa amylose có trọng lượng phân tử là 100-200 kDa, chuỗi amylose tạo thành có dạng xoắn ló xo với 6 gốc glucose trên một vòng và mỗi vòng có thể hấp thu một phân tử iodine vào bên trong bởi các nhóm carbohydrate tạo ra dung dịch có màu xanh, người ta dựa vào đặc tính này để xác định hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose là kết quả của sự tương tác giữa kiểu gen và điều kiện môi trường (Sectharaman, 1959; Juliano at al., 1964; Kahlon, 1965; Ghosh và Govindaswamy, 1972; Bollick và Webb, 1973; Somrich, 1974; Heu và Park, 1976) Tuy nhiên hàm lượng amylose cao là trội hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, nó được kiểm soát bởi một gen chủ yếu

và nhiều gen phụ mang tính chất cải biên (Ghosh và Govindaswamy, 1972; Bollick và Webb, 1973; Somrich, 1974; Heu và Park, 1976; Trương Bá Thảo, 2006)

Hàm lượng amylose được qui định bởi yếu tố di truyền, ở lúa locus Waxy nằm trên nhiễm sắc thể (NST) thứ ba, kiểm soát sản phẩm amylose tạo thành trong nội nhũ (Khush,1979) Hàm lượng amylose được kiểm soát bởi một gene chính, tính dẻo được kiểm soát bởi một gene lặn waxy, wx (Li, 1999) Nội nhũ của gạo nếp chỉ chứa amylopectin với kiểu gene 3n=wx wx wx, ngược lại ở gạo tẻ bao gồm cả amylose và amylopectin được kiểm soát bởi gene trội Wx, số lượng gene trội Wx ảnh hưởng đến hàm lượng amylose trong nội nhũ (IRRI, 1976; Heu và Park, 1976)

1.3.2 Hàm lượng Protein

Theo Higgins et al (1984) protein dự trữ là tất cả các protein tích lũy với hàm lượng đáng kể trong quá trình phát triển của hạt lúa Khi hạt nảy mầm, chúng sẽ thủy phân cung cấp đạm cho cây Chúng được tổng hợp chủ yếu trong giai đoạn phát triển sớm (Zhu, 1995) và chúng không biểu hiện hoạt tính của một enzyme (Shewry et al., 1999)

Theo Jennings et al (1979) hàm lượng protein trong hạt tùy thuộc vào sự chuyển vị đạm trong hạt đang phát triển Chúng chịu ảnh hưởng trầm trọng bởi điều kiện môi trường, mức độ bón

phân và thời gian sinh trưởng Hàm lượng protein ở nhóm Japonica và Indica cũng có sự khác biệt Ở nhóm Indica, hàm lượng protein biến động từ 4.9-19.3% Ở nhóm Japonica, hàm lượng

protein biến động từ 5.9-16.5% (Traore, 2005)

12

Lúa cung cấp hàm lượng protein trung bình khoảng 7% ở gạo trắng và 8% ở gạo lức (Jennings

et al., 1979) Hàm lượng protein phần lớn nằm trong hạt nên khi protein tăng thì phần lớn tập trung trong hạt, nên lượng protein mất đi trong lúc xay trà không đáng kể và thành phần acid amin hạt lúa cũng tương đối ổn định, điều này chứng tỏ phần lớn protein tăng thêm không nằm trong vỏ cám (Jennings et al., 1979)

Hàm lượng protein di truyền rất phức tạp Chỉ 25-50% sự biến thiên protein là do gene điều khiển IRRI (1977) cho rằng hàm lượng protein thấp có tính trội cao hơn hàm lượng protein cao Có ý kiến cho rằng, di truyền tính trạng protein do đa gene điều khiển, có hệ số di truyền rất thấp, có thể do tương tác mạnh mẽ giữa kiểu gene và môi trường (Chang and Somrith, 1979) Yếu tố môi trường cũng ảnh hưởng đến sự biến thiên hàm lượng protein như côn trùng, thời tiết, phân bón, nước tưới,…

Thực hiện điện di SDS-PAGE protein đã phát hiện trong hạt gạo có trên 10 thành phần protein, chia thành 5 nhóm polypeptide khác nhau về trọng lượng phân tử là: 57; 37; 38; 39; 26; 22-23; 16; 16; 13 và 10 kDa (Hình 1.1)

Các thành phần protein trong hạt lúa được phân ra làm 4 loại: albumin, globulin, prolamin, glutelin

 Albumin

Albumin tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khá cao (70-80%) Theo Yamagata et al (1982) trong lúa thành phần albumin có hàm lượng lysine cao nhất, kế đến là glutelin và prolamin Hai thành phần albumin và globulin tập trung ở lớp aleuron, không giữ được ở gạo xay chà trắng (Tecson et al., 1971)

 Globulin

Globulin không tan hoặc tan rất ít trong nước, tan trong dung dịch muối trung hòa NaCl, KCl,

Na2SO4, K2SO4 Thành phần globulin tập trung ở lớp aleuron của hạt (Juliano, 1972)