đánh giá nguồn gen phục vụ chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá

Mục ựắch - Cung cấp thông tin về các ựặc ựiểm chất lượng, khả năng kháng bệnh bạc lá và tiềm năng năng suất của các mẫu giống nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về nguồn gen phục vụ công tác c

-

TRẦN MINH THU

ðÁNH GIÁ NGUỒN GEN PHỤC VỤ CHỌN TẠO

GIỐNG LÚA NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƯỢNG TỐT,

KHÁNG BỆNH BẠC LÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và Chọn giống cây trồng

Mã số: 60.62.05

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2009

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và thông tin trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Trần Minh Thu

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng và các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền chọn giống cây trồng, khoa Nông học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin ñược gửi lời cảm ơn ñến gia ñình và bạn bè ñã luôn ủng hộ, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập

Hà nội, ngày tháng năm 2009

Tác giả luận văn

Trần Minh Thu

2.1.2 Hướng chọn tạo và tình hình chọn tạo giống lúa chất lượng

2.2.3 Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá 21 2.2.4 ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài ñồng ruộng 27

3.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài ñồng ruộng 27

3.4.3 đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng thương trường 30

3.5 đánh giá khả năng kháng và kiểm tra khả năng mang gen kháng

3.5.2 Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR

4.1.1 Kết quả ựánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 37 4.1.2 Kết quả ựánh giá hàm lượng amylose và kiểm tra gen quy

4.1.3 Kết quả ựánh giá một số tắnh trạng chất lượng gạo 45 4.1.4 đánh giá tương quan của các tắnh trạng chất lượng gạo 54

4.2.3 So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 61

4.3.3 Khả năng ựẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu và góc ựộ ựẻ nhánh 68

4.4.1 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu chất lượng tốt 80 4.2.2 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá 82

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome - nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn

- BAD2: Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2

- EAP: External antisense primer - mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- ESP: External sense primer- mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- GBSS: Grainule bound starch synthase - enzyme tổng hợp amylose

- IFAP: Internal fragrant antisense primer - mồi nội biên của cặp mồi phát

hiện gen fgr

- INSP: Internal non-fragrant sense primer- mồi nội biên của cặp mồi phát

hiện gen fgr

- IRRI: International Rice Research Institute - Viện nghiên cứu lúa quốc tế

- KDML: Giống lúa Khao Dawk Mali

- SS: Starch synthase - enzyme tổng hợp tinh bột

- SSRs: simple sequence repeats - kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân hoặc lai các ñoạn lặp DNA lặp ñi lặp lại trong genome

Số bảng Tên bảng Trang 4.1 So sánh kết quả ñánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng

KOH 1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR 39

4.2 So sánh hàm lượng amylose với kiểu gen của các mẫu giống 44

4.5 Phản ứng của các dòng ñẳng gen với các chủng vi khuẩn 56

4.6 So sánh kết quả xác ñịnh gen kháng bằng PCR và kết quả lây

4.8 Chiều cao cây tối ña, chiều dài bông và các tính trạng liên

4.11a Tiêu chuẩn chọn lọc của mẫu giống chất lượng tốt 81

4.11b ðặc ñiểm của 5 mẫu giống chất lượng tốt ñược chọn 82

4.12a Tiêu chuẩn chọn lọc của các mẫu giống kháng bạc lá 83

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Hoạt ñộng của bộ 4 mồi ñược mô tả trong nghiên cứu của

4.1 ðiện di sản phẩm PCR xác ñịnh mẫu giống mang gen fgr 38

4.2 ðiện di sản phẩm PCR –Wx, trước khi cắt bằng enzyme AccI 42

4.4 Thí nghiệm xác ñịnh hàm lượng amylose (các mẫu giống) 52

4.5 Thí nghiệm xác ñịnh hàm lượng amylose (các ñối chứng nồng ñộ) 52

4.6 Thí nghiệm xác ñịnh nhiệt ñộ hóa hồ (ñộ phá hủy kiềm) 53

4.12 ðiện di sản phẩm PCR gen xa5 sử dụng cặp mồi RG556 60

Hàng năm, năng suất lúa liên tục tăng nhưng vẫn không ñáp ứng ñủ nhu cầu do dân số gia tăng nhanh ðể ñảm bảo an ninh lương thực có hai con ñường ñể tăng sản lượng lương thực: thứ nhất là tăng diện tích ñất canh tác nông nghiệp và thứ hai là tăng năng suất cây trồng Mặt khác, diện tích ñất nông nghiệp ngày một thu hẹp, vì vậy hướng tăng sản lượng trong những năm sắp tới chủ yếu sẽ là tăng năng suất bằng cách sử dụng giống có năng suất cao

Tuy nhiên, chỉ nâng cao năng suất là chưa ñủ, nhu cầu về giống lúa hiện

nay phải là những giống hội ñủ 3 yếu tố năng suất cao, chất lượng tốt và

kháng sâu bệnh hiệu quả Trong ñó, nhu cầu về giống lúa có chất lượng tốt ngày càng cao Chính vì vậy, vấn ñề nâng cao chất lượng gạo rất ñược chú trọng trong công tác chọn tạo giống Nâng cao chất lượng gạo không chỉ nhằm phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn nhằm xây dựng thương hiệu gạo xuất khẩu Việt Nam cạnh tranh ñược trên thị trường quốc tế

Mặt khác, nước ta có khí hậu nhiệt ñới là ñiều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh hại phát triển Trong ñó, bệnh bạc lá là một bệnh ñặc biệt nguy hiểm ñối với lúa trồng do có khả năng gây giảm năng suất nghiêm trọng Cho

ựến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh ựược coi là hướng có hiệu quả

về cả mặt kinh tế và môi trường Xu hướng chọn giống kháng bệnh hiện nay

là khai thác tắnh kháng bệnh bền vững, hay còn gọi là tắnh kháng ngang, kháng không hoàn toàn Một giống lúa có tắnh kháng bền vững với bệnh có thể tồn tại lâu hơn, phạm vi tắnh kháng rộng hơn, có tắnh kháng không bị suy giảm ựột ngột; khi sử dụng các giống kháng này có thể hạn chế ựược rủi ro khi có dịch xảy ra

Nhìn chung, quá trình chọn tạo giống thực chất là quá trình tập hợp các tắnh trạng có ắch vào một cây trồng theo mục ựắch của người chọn tạo Vì vậy, thành công của công tác chọn tạo giống phụ thuộc nhiều vào số lượng và chất lượng vật liệu khởi ựầu Với mục tiêu tập hợp nguồn gen phong phú phục vụ cho công tác chọn tạo giống, thời gian vừa qua, Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng ựã tiến hành thu thập bảo tồn ựược hơn 1200 mẫu giống lúa

Trong quá trình khai thác sử dụng nguồn gen cho chương trình chọn tạo giống lúa, ựánh giá nguồn gen là rất quan trọng Việc ựánh giá không những giúp người chọn giống hiểu rõ nguồn gen mà còn có thể phát hiện ựược những biến dị nhiều khi rất nhỏ, khó phát hiện Chắnh những biến dị này thông qua bồi dưỡng và chọn lọc liên tục có thể trở thành những giống mới

Vì vậy, ựánh giá khách quan, chắnh xác và chi tiết các ựặc ựiểm của nguồn gen là việc làm rất cần thiết, từ ựó nhà chọn giống có hướng ựể chọn tạo giống mới thành công sau này

Chắnh vì vậy chúng tôi tiến hành ựề tài:

Ộđánh giá nguồn gen phục vụ chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc láỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục ựắch

- Cung cấp thông tin về các ựặc ựiểm chất lượng, khả năng kháng bệnh bạc lá và tiềm năng năng suất của các mẫu giống nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về nguồn gen phục vụ công tác chọn tạo giống mới

- Tuyển chọn một số mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá

và năng suất cao

1.2.2 Yêu cầu

- đánh giá các chỉ tiêu chất lượng

- đánh giá khả năng kháng và khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá

- đánh giá các ựặc ựiểm nông sinh học quan trọng và năng suất

- Tuyển chọn một số mẫu giống phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và

có tiềm năng năng suất cao

Phần thứ hai

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Chọn giống lúa chất lượng cao

2.1.1 Nghiên cứu về chất lượng gạo

Hiện nay, yêu cầu về chất lượng gạo của thị trường ngày càng tăng cùng với sự phát triển của kinh tế Chọn giống lúa chất lượng cao ñã trở thành mục tiêu quan trọng hàng ñầu của các nhà chọn giống Chất lượng gạo là tập hợp của nhiều tính trạng phức tạp như hàm lượng amylose (amylose content-AC), nhiệt ñộ hóa hồ (gelatinization temperature-GT), ñộ bền gel (gel consistency-GC), hàm lượng protein (protein content-PC), chiều dài hạt (L), chiều rộng hạt gạo (B), tỷ lệ dài /rộng ( L/B) Ngoài ra, chất lượng gạo ngon còn liên quan ñến ñộ dẻo, ñộ bóng và mùi vị của cơm…Hiểu biết ñầy ñủ về các tính trạng chất lượng là vô cùng quan trọng ñể xây dựng một chiến lược ñúng ñắn trong chọn giống nâng cao chất lượng gạo

2.1.1.1 Mùi thơm

a Bản chất hóa học của mùi thơm

Mùi thơm của lúa là kết quả tạo thành bởi một loạt các hợp chất hóa học khác nhau(Widjaja và cộng sự, 1996) Năm 1977 Bullard và Holguin ñã sử dụng phương pháp sắc ký khí ñể xác ñịnh thành phần hóa học tạo nên mùi thơm Họ thu ñược 70 chất và xác ñịnh chính xác ñược 30 chất trong số ñó, nhưng theo quan ñiểm của họ thì không có một thành phần rõ ràng nào quy ñịnh tính thơm của gạo [20]

Năm 1983, Buttery và cộng sự ñã chỉ ra rằng 2-acetyl-1- pyrroline AP), một chất dễ bay hơi, chính là thành phần chính tạo nên mùi thơm của lúa 2-AP xuất hiện trên tất cả các bộ phận của cây (thân, lá và hạt) ngoại trừ phần rễ (Buttery và cộng sự, 1983; Lorieux và cộng sự, 1996; Yoshihashi và

(2-cộng sự, 2002) 2-AP không hình thành trong quá trình thu hoạch và nấu chín

mà hình thành trong quá trình sinh trưởng của cây Chính vì vậy mà mùi thơm của lúa có thể ñược xác ñịnh trên cả hạt và mô lá (Yoshiyashi và cộng sự, 2002)[35] Kỹ thuật thu hoạch và bảo quản cũng ảnh hưởng ñến lượng 2-acetyl-pyroline, từ ñó ảnh hưởng ñến mùi thơm của gạo (Goodwin và cộng sự,1994)

b Di truyền của tính trạng mùi thơm

Cho ñến nay, rất nhiều quan ñiểm khác nhau về di truyền tính trạng mùi thơm ñã ñược ñưa ra, như là: Jodon (1944) cho rằng tính trạng mùi thơm do 1 gen trội quy ñịnh, nhưng trước ñó Kandam và Paatanka (1938) lại cho rằng tính trạng này do 2 gen quy ñịnh Năm 1975, Nagaraju ñưa ra quan ñiểm là có

3 gen tham gia quy ñịnh tính trạng mùi thơm Dhulappanavar (1976) kết luận rằng tính trạng mùi thơm do 4 gen quy ñịnh, trong ñó có 1 gen liên kết với gen quy ñịnh màu ñỏ của mỏ hạt Tripathi và Rao (1979) kết luận mùi thơm

do 2 gen trội quy ñịnh, SK1 và SK2, ngoài ra chúng còn liên kết với các gen

khác quy ñịnh màu tai lá, màu bẹ lá, Nagaraju và cộng sự (1975) phát hiện ra mùi thơm chịu sự ñiều khiển ñồng thời của 3 gen và họ ñưa ra gợi ý rằng nghiên cứu trên lá chính là phương pháp hữu hiệu và ñơn giản nhất ñể nghiên cứu mùi thơm

Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu ñều kết luận rằng tính trạng mùi thơm của lúa do 1 gen quy ñịnh (Sood và Siddiq,1980; Shekhar và Reddy, 1981; Berner và Hoff, 1986; Bollich và cộng sự, 1992; Ali và cộng sự, 1993;

và cộng sự, 1996; Li và Gu, 1997; Sadhukhan và cộng sự, 1997) Berner và Hoff (1986) kết luận rằng 1 gen trội quy ñịnh tính trạng mùi thơm của lúa và gợi ý phương pháp xác ñịnh mùi thơm của hạt bằng cách nếm thử một nửa hạt gạo ñồng thời giữ lại một nửa hạt có chứa phôi Li và Gu (1997) nghiên cứu

và phát hiện ra mùi thơm ñược ñiều khiển bởi 1 gen lặn Ngoài ra, từ kết quả lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm, họ cũng ñi ñến kết luận rằng gen quy ñịnh mùi thơm di truyền ña allen Tiến hành lai chéo WX (một giống lúa thơm) với các dòng tam bội có nguồn gốc từ IR36 và WJ (cũng là một giống lúa thơm), Li và Gu kết luận gen quy ñịnh mùi thơm nằm trên nhiễm sắc thể

số 8 Trước ñó, sử dụng kỹ thuật RFLP, Ahn và cộng sự (1992) cũng ñã ñịnh

vị ñược gen này trên nhiễm sắc thể số 8 [41]

Năm 1996, Kato và Itani tiến hành nghiên cứu về sự liên quan di truyền của mùi thơm và các tính trạng nông sinh học khác bằng cách nghiên cứu trên các tổ hợp của thế hệ F8 bằng phương pháp chọn lọc một hạt của tổ hợp lai giữa BGT x Koshihiraki Sau khi so sánh sự khác biệt của các cặp tính trạng giữa nhóm có mùi thơm và nhóm không có mùi thơm, họ ñưa ra kết luận gen quy ñịnh mùi thơm di truyền hoàn toàn ñộc lập

Năm 1998, Khush và Dela Cruz ñã nhấn mạnh trong các nghiên cứu của họ là tính trạng mùi thơm của lúa là một tính trạng số lượng với một dẫy biến dị rộng

Năm 2005, L Bradbury và cộng sự ñã công bố một nghiên cứu về vị trí,

cấu trúc và cơ chế của gen fgr quy ñịnh tính trạng mùi thơm của lúa Trong

nghiên cứu này, Bradburry và cộng sự ñã phát hiện 8 ñột biến mất ñoạn và 3 SNPs trên exon của gene mã hóa tổng hợp betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) chính là nguyên nhân hình thành tính thơm trên các giống luá thơm Basmati [31] Các giống lúa không thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 ñầy ñủ, trong khi các giống lúa thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 chứa ñột biến mất ñoạn và các SNPs Hậu quả của sự thay ñổi cấu trúc này sinh ra một mã dừng làm mất tác dụng của enzyme BAD2 Ngoài ra, các tác giả ñã sử dụng các Bacterial Artificial Chromosome (nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn) ñể

kiểm tra vị trí của gen fgr và đã phát hiện được vị trí chính xác của gen này

trên NST 8

Kết quả của nghiên cứu này đã được cơng nhận rộng rãi và được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chọn tạo các giống lúa thơm

c Ứng dụng cơng nghệ sinh học trong nghiên cứu mùi thơm của gạo ðến nay, nhiều chỉ thị phân tử như SNPs (single nucleotide polymorphisms) hay SSRs (simple sequence repeats) cĩ liên kết với tính thơm

đã được áp dụng trong chọn lọc giống lúa thơm [19]

Năm 1992, Ahn và cộng sự đưa ra một chỉ thị phân tử kí hiệu là RG28

nằm trên nhiễm sắc thể số 8 cĩ liên kết gần với gen thơm (fgr) Họ cũng gợi ý

rằng chỉ thị phân tử này cĩ thể áp dụng để dự đốn sớm sự cĩ mặt của mùi thơm trên một giống lúa, đồng thời cĩ thể phân biệt được tình trạng đồng hợp hay dị hợp thể của gen thơm và chỉ thị này rất hữu dụng trong việc phát hiện nhanh tính trạng thơm trong các dịng lai [14] Sau đĩ, đã cĩ rất nhiều nghiên cứu khác nhau với mục đích nghiên cứu sâu hơn về hoặc ứng dụng chỉ thị này trong cơng tác chọn tạo giống lúa thơm Nghiên cứu của Li và cộng sự (1996) với kết luận tính trạng mùi thơm do 1 gen lặn nằm trên NST số 8 đã củng cố thêm quan điểm RG28 là một chỉ thị đặc hiệu cho gen thơm Pandey và cộng

sự (1994, 1995) nghiên cứu về liên kết giữa RG28 và thơm bằng cách nghiên cứu tổ hợp lai chéo giữa Pusa 751 (cĩ mùi thơm) X IR72 (khơng thơm) đã đưa ra kết luận RG28 cĩ khoảng cách là 10cM với gen thơm thay vì 4,5cM như kết luận của Ahn [37][38]

Các cặp mồi thiết kế từ RG28 đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh lúa thơm (Lang và Buu, 2002; Cordeido và cộng sự, 2002; Jin và cộng sự, 2003) [30][24] Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của các mồi này là

chúng chỉ liên kết với gen thơm ở một mức ñộ nào ñó nên không thể chính xác ñến 100% (Garland và cộng sự, 2000; Hien và cộng sự, 2005).[31]

Năm 2005, nghiên cứu của L Bradbury và cộng sự về cấu trúc và cơ chế hình thành của gen thơm chính là cơ sở ñể thiết kế một loại mồi thật sự hoàn hảo cho việc xác ñịnh mùi thơm trên lúa Dựa trên cấu trúc phân tử của gen quy ñịnh tính trạng mùi thơm, một bộ mồi ñã ñược thiết kế, gồm 2 cặp mồi cùng nhân lên trên 1 vùng của DNA mục tiêu, trong ñó 1 cặp mồi này lại nhân 1 ñoạn nằm trong ñoạn nhân của cặp mồi kia

Bộ 4 mồi này gồm có: 1 cặp mồi nhân không ñặc hiệu nhân lên ñoạn nằm ngoài khu vực xuất hiện ñột biến trong cả trường hợp thơm và không thơm và 1 cặp mồi còn lại phân biệt 2 allen của gen thơm

Hai mồi ngoại biên ñóng vai trò như một nhân tố kiểm soát dương tính, nhân lên một ñoạn khoảng 580bp nằm trên cả kiểu gen thơm (577bp) và kiểu gen không thơm (585bp) Từng chiếc riêng lẻ của cặp mồi nội biên (kí hiệu ESP và EAP) bắt cặp với các mồi ngoại biên (kí hiệu IFAP và INSP) ñể tạo ra các sản phẩm ñặc trưng cho kiểu gen

Với mồi này, phản ứng PCR sẽ tạo ñược 4 ñoạn nhân như sau: 1 ñoạn 580bp sẽ xuất hiện ở cả hai trường hợp thơm và không thơm, 1 ñoạn 355bp

xuất hiện ở trường hợp ñồng hợp thể trội Fgr/Fgr (không thơm), một ñoạn 257bp xuất hiện ở trường hợp ñồng hợp thể lặn fgr/fgr (thơm) và ñối với trường hợp dị hợp thể Fgr/fgr (không thơm) sẽ xuất hiện ñồng thời cả 2 ñoạn

355bp và 257bp

Bộ 4 mồi này có tính chính xác tới 100% do chúng ñược thiết kế từ trình

tự của chính gen mã hóa tổng hợp BAD2 [42][52]

Hoạt ñộng của bộ 4 mồi ñược minh họa ở hình dưới:

Hình 2.1 Hoạt ñộng của bộ 4 mồi ñược mô tả trong nghiên cứu của

Bradburry và cộng sự (2005)

2.1.1.2 Hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose ñược ñánh giá là một trong những ñặc tính quan trọng nhất ảnh hưởng ñến phẩm chất nấu nướng của gạo Hàm lượng amylose quyết ñịnh ñến ñộ mềm, ñộ bóng của cơm và mức nước cần ñể nấu Gạo có hàm lượng amylose thấp sẽ mềm, dẻo, không nở nhiều và không bị cứng khi

ñể nguội vì vậy gạo có hàm lượng amylose thấp rất ñược ưa chuộng trên thị trường

Amylose và Amylopectin là hai thành phần chính của tinh bột trong nội nhũ (Sodhi và Singh, 2003)[46] Amylose và amylopectin ñều có cấu tạo là những chuỗi polymer glucose, nhưng amylose có kích thước phân tử nhỏ hơn, cấu trúc ít phức tạp hơn so với amylopectin Cấu trúc phân tử của amylose gồm một chuỗi dài và một số nhánh liên kết nhất ñịnh Các amylose trong tinh bột bao gồm cả loại có mạch thẳng và mạch nhánh (Takeda và cộng sự, 1987) Trong hạt gạo, hai phần ba thành phần amylose là dạng mạch thẳng (Takeda và cộng sự, 1993)

Cả amylose và amylopectin ñều ñược tổng hợp bởi 1 enzyme gọi là enzyme tổng hợp tinh bột (starch synthase), enzyme này gắn các phân tử

ñược chia thành 4 loại dựa trên cấu trúc của chuỗi amino acid (SSI, SSII, SSIII và SSI grainule-bound (GBSSI) Các nghiên cứu cho thấy cả 4 loại enzyme ñều có mặt ở bộ phận dự trữ và ñóng các vai trò riêng biệt trong quá trình tổng hợp amylose và amylopectin Tuy nhiên, chỉ duy nhất GBSSI có vai trò tổng hợp amylose (Kossmann và Lloyd, 2000; Smith và cộng sự, 1999) [26]

Mặt khác, enzyme GBSS ñược mã hóa bởi 1 gen kí hiệu là Wx nằm trên

NST số 6 (Okagaki và Wesssler, 1988) Các nghiên cứu của Cai và cộng sự

ñã chỉ ra rằng hàm lượng amylose cũng như hàm lượng của GBSS có liên

quan tới hiện tượng cắt rời của intron 1 của Wx và một SNP-ñột biến từ G thành T của nucleotide của bộ 3 ñầu tiên của intron 1 gen Wx (Wang và cộng

sự, 1990; Cai và cộng sự, 1998)

Theo ñó, các giống lúa có kiểu gen Wx-G/Wx-G có chứa base G tại

intron 1 của gen Wx sẽ tạo thành mARN-Wx hoàn chỉnh vì vậy sẽ sinh ra lượng GBSS lớn và có hàm lượng amylose cao Ngược lại, các giống lúa có

kiểu gen Wx-T/Wx-T với base T thay thế G thì chỉ có một lượng nhỏ

mARN-Wx ñược tạo thành, vì vậy chúng có hàm lượng amylose trung bình và thấp (Cai và cộng sự, 1998) [17]

Dựa trên kết quả nghiên cứu về cấu trúc của Wx, Cai và cộng sự ñã thiết

kế ra một cặp mồi kí hiệu là Wx-AccI phân biệt ñược base ñầu tiên của intron

1 là G hay T (Cai và cộng sự,2002) [16],[39]

2.1.1.3 Nhiệt ñộ hóa hồ và ñộ phá hủy kiềm

Nhiệt ñộ hóa hồ (rice starch geltinization temperature) là một thành phần quan trọng của chất lượng gạo do nó có liên quan chặt chẽ ñến thời gian nấu chín và chất lượng của cơm [32]

Những nghiên cứu về bản chất phân tử của gen ñã xác ñịnh rằng gen

chính quy ñịnh ñộ bền gel và ñộ phá hủy kiềm ñều nằm gần locus Wx trên

NST6 (Umemotoet và cộng sự, 2002; Gao và cộng sự, 2003) Gen quy ñịnh

ñộ phá hủy kiềm ñược chứng minh là mã hóa enzyme phân hủy tinh bột SSIIa (starch-soluble synthaseisoform), và một sự khác biệt về 1 cặp base chính là nguyên nhân của sự khác biệt về ñộ phá hủy kiềm của 2 nhóm Japonica và Indica (Gao và cộng sự, 2003; Nakamura và cộng sự, 2005) Cho ñến nay, người ta vẫn chưa xác ñịnh ñược có bao nhiêu alen của gen này tồn tại trên các giống lúa trồng Umemoto et al ñã phân biệt ñược 4 alen của gen mã hóa SSIIa, tuy nhiên các alen này lại không có nhiệt ñộ hóa hồ ñặc trưng

Trong nghiên cứu về bản chất phân tử của gen quy ñịnh nhiệt ñộ hóa hồ, Umemoto và cộng sự phát hiện ra sự khác biệt về cấu trúc phân tử của các giống lúa có nhiệt hóa hồ khác nhau, theo ñó trên exon 8 có 3 ñột biến gồm có base A thành G (dẫn ñến acid amin methionin-ATG thành valine-GTG), GC thành TT (dẫn ñến leucine-CTC thành phenylalanine-TTC) và một SNPs (A/G) Khảo sát trên các mẫu giống lúa trồng, Umenmoto và cộng sự phát hiện có 4 dạng alen tồn tại là G/G/GC, A/G/GC, A/A/GC và A/G/TT Tiếp tục so sánh về nhiệt hóa hồ giữa các dạng, họ ñưa ra kết luận dạng G/GC có nhiệt hóa hồ cao, 2 dạng A/GC và G/TT có nhiệt hóa hồ thấp [51] Từ kết quả nghiên cứu này một số chỉ thị phân tử ñã ñược thiết kế và ứng dụng trong các chương trình chọn tạo giống chất lượng cao [41]

2.1.1.4 ðộ bạc của hạt

ðộ bạc hay ñộ trong của hạt gạo là một yếu tố chất lượng rất quan trọng Gạo hạt trong thường ñược người tiêu dùng ưa chuộng hơn hẳn gạo có vết ñục Hiện tượng xuất hiện vết bạc là do cấu trúc của tinh bột, ở gạo tẻ là do hạt tinh bột không liên kết chặt với protein, còn ở gạo nếp là do cấu trúc tinh bột không ñồng nhất do không có thành phần amylose Ngoài ra, ñộ bạc bụng của gạo còn ảnh hưởng ñến chất lượng xay xát, tỉ lệ gẫy vỡ của gạo khi xay xát

ðộ bạc của hạt gạo là tính trạng chịu ảnh hưởng của cả gen và yếu tố môi trường (Lê Doãn Diên, 1995) [5] Theo kết quả nghiên cứu của Vũ Quốc Trung và Bùi Huy Thanh, lượng nước quá nhiều hoặc bị hạn ở thời ñiểm chín, quá trình phơi sấy gặp nhiệt ñộ cao sẽ làm gia tăng ñộ bạc bụng [11]

Theo Khush (1986), ñộ trong của hạt gạo có liên quan ñến hàm lượng amylose, các giống lúa có hàm lượng amylose nhỏ hơn 2% nội nhũ ñục hoàn toàn, còn các giống lúa có hàm lượng amylose từ 2-32% nội nhũ sẽ có nhiều dạng từ trong ñến ñục hoàn toàn

Năm 1981, Omura và Saito sử dụng phương pháp gây ñột biến bằng methyl N-ntrosourea (MNU) ñể nghiên cứu về di truyền của ñộ bạc bụng Sau khi xử lý ñột biến, kết quả họ thu ñược nhiều mức ñộ bạc khác nhau, từ ñó rút

N-ra kết luận rằng ñộ bạccủa gạo là do gen quy ñịnh chứ không ñơn thuần là do ñiều kiện môi trường

Năm 1981, Kamijima và cộng sự nghiên cứu sự truyền của bạc bụng bằng cách lai phân tích và ñưa ra kết luận ñộ bạc bụng do gen quy ñịnh và có liên kết chặt chẽ với kích thước hạt

Năm 1983, Takeda và Saito tiếp tục sử dụng phương pháp lai phân tích

ñể nghiên cứu di truyền của tính trạng này Cuối cùng, họ ñưa ra kết luận ñộ

bạc bụng do nhiều gen quy ñịnh, trong ñó có một gen chủ ñạo kí hiệu là Lk-f,

gen này ñồng thời cũng là gen ñiều khiển kích thước hạt

2.1.1.5 Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt

Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo là những ñặc tính quan trọng nhất là ñối với các giống lúa chất lượng Gạo ñược phân loại theo mục ñích thương mại thành dạng hạt ngắn, hạt vừa, hạt dài và hạt thon Tuy nhiên, trên thị trường dạng gạo thon dài là ñược ưa chuộng nhất

Phần lớn các nghiên cứu ñều kết luận rằng chiều dài chiều rộng của hạt chịu tác ñộng tổng hợp của nhiều gen Năm 1986, Hsieh và Wang kết luận

chiều dài của hạt di truyền ña gen, ñược ñiều khiển bởi gen ña allen kí hiệu là

Gl và mức ñộ trội của các alen theo thứ tự Gl1>Gl2>gl, dạng hạt tròn trội so

với dạng hạt dài và hình dạng hạt cũng do gen 3 allen Gs quy ñịnh Rao và Sang (1989) ñưa ra kết luận chiều dài và chiều rộng của hạt gạo di truyền hoàn toàn ñộc lập, chịu sự ñiều khiển của các gen khác nhau [41]

Năm 1984, Takeda nghiên cứu di truyền kích thước hạt trên giống lúa Fusayoshi của Nhật Bản và cho rằng tính trạng này do ña gen quy ñịnh và có

một gen trội không hoàn toàn kí hiệu là Lk-f là gen chính

Sau ñó, trong nghiên cứu bằng phương pháp phân tích quần thể phân li vào năm 1994, Takeda và Saito ñã phát hiện ra chiều dài hạt ñược ñiều khiển

bởi một gen lặn kí hiệu lk-I [8]

2.1.2 Hướng chọn tạo và tình hình chọn tạo giống lúa chất lượng cao ở nước ta

2.1.2.1 Hướng chọn tạo giống lúa có chất lượng cao

Từ ñầu thập kỉ 60 của thế kỷ trước, cùng với sự xuất hiện của gen lùn, năng suất của các giống lúa không ngừng ñược nâng cao Trong suốt cuộc cách mạng xanh, năng suất trở thành mục tiêu chính yếu vì vậy có rất nhiều giống lúa thơm, chất lượng cao nhưng năng suất thấp bị biến mất Một số giống còn tồn tại thì chỉ ñược người dân trồng với diện tích rất nhỏ

Ban ñầu, công tác chọn tạo lúa chất lượng cao chủ yếu là cải tiến giống Các giống lúa ñịa phương ñược sử dụng làm nguồn vật liệu cho cải tạo giống, tuy nhiên nỗ lực ñưa gen lùn vào các giống lúa thơm chỉ thu ñược những thành công rất hạn chế, nguyên nhân là do sự không tương hợp dẫn ñến bất dục và từ ñó hạn chế sự tái tổ hợp

Trong việc cải tiến các giống lúa thơm và chất lượng có ba cản trở lớn

gạo và 3/ Không có tiêu chuẩn chọn lọc rõ ràng (Khush và Juliano, 1991) Một vài giống mới có năng suất khá cao, chất lượng tốt ñã ñược chọn tạo thành công, tuy nhiên những giống lúa này vẫn không bằng những giống lúa thơm truyền thống như Basmati 370 về mặt chất lượng và hương vị của cơm [28]

ðến nay, có 3 phương pháp ñể chọn tạo lúa thuần chất lượng cao ñó là: 1/Phục tráng các giống lúa cũ, 2/Chọn giống bằng phương pháp lai và 3/Chọn giống ñột biến.[40]

Các nhà chọn giống ñã sử dụng ngay các giống lúa ñịa phương chất lượng cao ñược người nông dân trồng rải rác ở nhiều vùng với nhiều tên gọi khác nhau ñể phục tráng và ñưa vào sản xuất Hai trong những ví dụ nổi tiếng nhất của giống lúa thơm ñược chọn lọc theo phương pháp này là giống Basmati 370 ñược Late Sardar Mohammad Khan (Pakistan) chọn vào năm

1933 và giống Khao Dawk Mali của Thái Lan ñược chọn bởi những người nông dân bản ñịa vào năm 1950

Hướng chọn giống lúa bằng phương pháp lai ñược tiến hành ñầu từ những năm 1960 Các nhà chọn giống ở nhiều nước ñã sử dụng dạng bán lùn làm nền ñể chọn tạo ra các giống lúa vừa có chất lượng tốt ñồng thời vừa cho năng suất cao Phương pháp pedigree, lai backcross và lai nhiều bậc là những phương pháp ñược áp dụng phổ biến nhất Giống lúa Pusa Basmati-1 là giống lúa ñược chọn tạo theo hướng này Pusa Basmati-1 ñược thừa hưởng chất lượng gạo tốt và mùi hương từ giống Basmati 370 và giống lúa ñịa phương Karnal (Ấn ðộ); ñồng thời có ñược năng suất cao và khả năng kháng bệnh tốt

từ TKM6, IR8, Ratna và IR72 [44]

Hướng chọn giống bằng phương pháp gây ñột biến cũng ñược ứng dụng chủ yếu nhằm thay ñổi một vài tính trạng nhất ñịnh như là tạo dạng bán lùn

hay tạo khả năng kháng bệnh cho các giống lúa chất lượng tốt Giống lúa RD15 của Thái Lan là một trong những giống lúa ñược chọn tạo theo hướng này RD 15 là một dạng ñột biến của KDML 105, có chất lượng tương ñương KDML nhưng có thời gian chín sinh trưởng ngắn hơn từ 7-10 ngày

Ngoài ra, còn có 2 hướng mới trong chọn tạo giống lúa chất lượng cao là chọn giống lúa lai và chọn tạo ứng dụng công nghệ sinh học

Trung Quốc là nước trồng nhiều lúa lai nhất vì vậy cũng là nước ñầu tiên phát triển công nghệ chọn tạo lúa lai có mùi thơm và chất lượng cao Giống lúa Xiangyou63 ra ñời vào năm 1995 ñược tạo bởi dòng bất dục ñực Xiangxiang 2A có mùi thơm và dòng mẹ Minghui là giống lúa lai chất lượng cao ñầu tiên (Kunlu, Zhou and Fuming Liao, 1995)[29] Tuy nhiên trở ngại lớn nhất ñối với hướng chọn tạo lúa lai chất lượng cao là người trồng lúa buộc phải sử dụng hạt F1 do hạt F2 thu từ thế F1 làm giống xuất hiện sự phân li về những tính trạng chất lượng, vì thế giá thành giống thường khá cao [39]

Công nghệ sinh học cũng mở ra ñi mới cho chọn tạo giống chất lượng Hiện nay, bộ gen lúa ñã ñược giả mã và cùng với ñó là rất nhiều chỉ thị phân

tử ñược xác ñịnh và sử dụng trong chọn tạo giống lúa chất lượng

2.1.2.2 Tình hình chọn tạo giống lúa chất lượng cao ở nước ta

Nước ta nằm trong trung tâm phát sinh cây lúa, cho nên có nhiều giống lúa thơm truyền thống có chất lượng cao Các giống lúa thơm truyền thống của nước ta ñược bảo tồn ngay trên ñồng ruộng như là giống Tám Thơm ở miền Bắc hay giống Nàng Thơm ở miền Nam

Các giống lúa chất lượng cao truyền thống ñã và ñang ñược trồng rộng rãi ở nước ta có thể kể ñến là: Tám Xoan, Tám Ôn ở Tiền Hải (Thái Bình), Hải Hậu (Nam ðịnh), Phú Xuyên (Hà Nội); Tám Canh ở Hải Hậu; Di Hương

ở An Lão (Hải Phòng), Lâm Thao (Phú Thọ); Nếp Hoa Vàng ở Vĩnh Phúc;

Nếp Rồng ở Hải Dương; Nếp Bạc ở Hưng Yên; Nàng Thơm Chợ đào ở Cần được (Long An) Trong ựó, Nàng Thơm Chợ đào và Tám Xoan là hai giống ựược trồng rộng rãi nhất

Ngày nay, các giống lúa thơm truyền thống chỉ ựược trồng rất hạn chế ở một số vùng nhất ựịnh Mùi thơm của các giống lúa này thường rất ựặc trưng cho vùng canh tác vắ dụ như giống lúa Nàng Thơm Chợ đào chỉ có mùi thơm khi ựược trồng ở vùng Cần được, Long An; trong khi giống Tám Xoan chỉ có mùi thơm khi trồng ở một số vùng thuộc ựồng bằng Bắc bộ, tuy nhiên phần lớn các giống lúa nếp như Nếp Cái Hoa Vàng luôn thể hiện mùi thơm dù ựược trồng ở bất cứ vùng nào Theo các khảo sát ựã ựược tiến hành thì các giống lúa truyền thống thường không có mùi thơm khi trồng trong ựiều kiện ựất chua mặn [15]

Ngoài ra, ựã có nhiều giống lúa chất lượng cao ựược nhập nội vào nước

ta Vào những năm 1980, 2 giống lúa Khao Dawk Mali 105 và Basmati 307

ựã ựược nhập nội và trồng thử nghiệm tại ựồng bằng sông Cửu Long Song, trên thực tế giống Basmati không phù hợp với ựiều kiện trồng, không có mùi thơm và chỉ cho năng suất rất hạn chế Sau ựó, Basmati ựược sử dụng làm bố

mẹ trong chương trình lai tạo của Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long Kết quả lai thử cho thấy 2 tổ hợp lai IR64/Basmati 370 và OM576/Basmati hứa hẹn cho năng suất cao, chất lượng tốt nhưng không có mùi thơm Hai tổ hợp này hiện nay vẫn tiếp tục ựược phát triển tiếp tại Viện lúa ựồng bằng sông Cửu Long Ngược lại, kết quả kiểm nghiệm Khao Dawk Mali 105 lại rất tốt, giống này hiện ựang ựược trồng rộng rãi ở ựồng bằng sông Cửu Long với diện tắch khoảng 3000 ha [15]

Trong công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao, lúa thơm ựã có một

số thành tựu nhất ựịnh Năm 1995, Thịnh và cộng sự ựã phục tráng thành

công giống lúa Nàng Hương ở miền Bắc bằng phương pháp chọn dòng thuần,

từ ựó tạo ra một số dòng có cải tiến với những ựặc ựiểm như năng suất cao hơn từ 23-25%, thời gian sinh trưởng ngắn, chất lượng tôt và chịu ựược ựất chua mặn [47]

Công nghệ sinh học mà chủ yếu là các phương pháp chỉ thị phân tử ựã ựược ứng dụng trong chọn tạo và nghiên cứu lúa chất lượng cao ở nước ta Năm 2003, Viện lúa ựồng bằng sông Cửu Long ựã sử dụng chỉ thị SSR

kắ hiệu RM234 nằm trên NST số 7 ựể tìm ra sự ựa hình, phân biệt cá thể có hàm lượng protein thấp và cá thể có hàm lượng protein cao trong khi ựánh giá các cá thể F2 của cặp lai IR64/ Khao Dawk Mali

Viện lúa ựồng bằng sông Cửu Long cũng sử dụng chỉ thị phân tử

Wx-F-R trên NST số 6 có liên kết với hàm lượng amylose ựể ựánh giá chọn lọc các

tổ hợp lai IR64/Hoa lài, IR64/ Khao Dawk Mali 105, kết quả phát triển giống lúa OM4495 chất lượng tốt, thắch nghi với vùng ựất xám bạc màu

Năm 2007, Lang và cộng sự 2007 ựã sử dụng cặp mồi RG28 ựược thiết

kế từ RFLP sử dụng ựể ựánh giá mùi thơm, phân biệt sớm ựồng hợp tử, dị hợp tử ở thế hệ ban ựầu rút ngắn thời gian chọn tạo giống, ước ựoán mức ựộ chắnh xác trên quần thể Khao Dawk Mali 105/OM1490 lên tới 84% [2]

Năm 1995, Ho và cộng sự ựã công bố thành công trong việc chuyển gen vào giống lúa thơm Nàng Hương Chợ đào Callus và mô của giống lúa Nàng Hương Chợ đào ựược chuyển gen bởi pRQ6 chứa hph mã hóa hygromycin phosphotransferase và gusA Cây chuyển gen có khả năng kháng hygromicin

B và biểu hiện của gen gusA, kiểm tra bằng PCR cho thấy sự có mặt của gen

hph trong cây chuyển gen [47]

2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá

2.2.1 Nghiên cứu về bệnh bạc lá

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae (Xoo) gây ra

ðây là một trong những bệnh nguy hiểm nhất ñối với lúa trồng, ñặc biệt là những vùng thâm canh cao Bệnh không chỉ gây hại ñối với lúa trồng ở khu vực châu Á mà còn gây hại trên các vùng trồng lúa ở châu Úc, Mĩ, Mĩ Latinh

và châu Phi Năng suất ruộng lúa nhiễm bệnh nặng có thể giảm sút từ 20 ñến 30% Cá biệt ở một số vùng năng suất có thể giảm ñến 50% (Ou 1985; Adhikari và cộng sự, 1995) [13] [54]

Các nghiên cứu về vi khuẩn bạc lá cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại

có một số chủng vi khuẩn bạc lá ñặc trưng (Tika B Adhikari, T.W Mew và cộng sự, 1999) [49].Chính vì vậy, ở mỗi vùng trồng lúa ñều có nhiều nghiên cứu về chủng nòi vi khuẩn ñược tiến hành Kết quả cho thấy sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá rất khác nhau ở mỗi vùng và phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và ñiều kiện tự nhiên của mỗi vùng

Năm 2005, Nguyễn Văn Viết và cộng sự ñã tiến hành nghiên cứu bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc Kết quả nghiên cứu cho thấy các nhóm nòi bệnh thường xuất hiện ñan xen, ví dụ như ở một ñịa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm nòi, trái lại một nhóm nòi có thể xuất hiện ở nhiều ñịa phương [7]

Từ những năm 1990, nghiên cứu về chủng nòi vi khuẩn bạc lá ñã ñược tiến hành ở nước ta Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ

90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta [7] Song, theo kết quả nghiên cứu gần ñây của Phan Hữu Tôn, trên cơ sở thu thập phân lập các mẫu bệnh ở các tỉnh miền Bắc và lây nhiễm trên dòng ñẳng gen ñã xác ñịnh ñược

10 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau Trong ñó có 2 chủng 2 và 3 là phổ biến ở vùng ðồng bằng sông Hồng, những chủng còn lại dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn song chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho các giống lúa (Phan

Hữu Tôn, 2005) [10] ðiều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta ñang tăng lên nhanh chóng và ña dạng hơn, ñòi hỏi cần tạo ra những giống lúa mới mang nhiều gen kháng, có tính kháng bền vững hơn

2.2.2 Nghiên cứu về khả năng kháng bệnh bạc lá

Năm 1961, lần ñầu tiên Nishimura ñã nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá Trong khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông ñã phát hiện khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống

lúa trồng Kogyoku và Kaganeman, ñược ñiều khiển bởi 1 gen trội nằm trên

NST số 11 (theo hệ thống thứ tự NST của ông)

Vào thập kỷ 60 của thế kỷ trước, cùng với việc phổ biến các giống lúa bán lùn và năng suất cao vào sản xuất, bệnh bạc lá phát triển ngày càng rộng Nhận thấy thực tế này, IRRI ñã tiến hành ñánh giá khả năng kháng bệnh của các giống lúa nhiệt ñới, ñồng thời tiến hành nghiên cứu về bản chất di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá (dẫn theo Tsugufumi Ogawa,1997) [50]

ðến nay, ñã có 30 gen kháng ñược phát hiện, ký hiệu từ Xa1 ñến Xa29, trong ñó có 21 gen trội và 9 gen lặn (Sidhu và Khush 1978; Ogawa,1988; Lin, 1996; Nagato và Yoshimura, 1998; Zhang, 1998; Khush và Angeles, 1999; Gao, 2001; Chen, 2002; Lee, 2003; Yang, 2003; Tan, 2004)

Hầu hết các gen này ñều ñã ñược ñánh giá khả năng kháng và ñược sử dụng trong chọn giống kháng bệnh (Kinoshita 1995; Lin, 1996; Zhang, 1998; Khush và Angeles, 1999; Gao, 2001; Chen, 2002; Yang, 2003; Gu, 2004) [25] [53] [54]

Cho ñến nay ñã có 5 gen trội: Xa 21 (Son và cộng sự, 1995), Xa1 (Yoshimura, 1998), Xa3 (Xiang, 2004), Xa 27 (Gu, 2005), Xa3 (Xiang, 2006)

và 2 gen lặn xa5 (Iyer và Mc Couch, 2004), xa13 (Chu, 2006) ñược lập bản

ñồ gen

Cấu trúc phân tử của các gen cũng ñược xác ñịnh, ví dụ như: Xa 3, Xa21

và Xa26 ñã ñược xác ñịnh là ñều có ñoạn mã hóa cho chuỗi leucine

(leucine-rich repeat LRR) tiếp nhận các Kinase protein (Song và cộng sự, 1995; Sun

và cộng sự, 2004; Xiang 2006) Xa3 là alen của Xa26 với 92% trình tự giống

nhau

Các gen kháng cũng ñược ñịnh vị như: Xa,Xa26, Xa4, Xa22 ñược ñịnh

vị nằm ở ñiểm xa của vai dài của NST11 Xa 21 và Xa23 nằm ở ñoạn giữa của

bệnh bạc lá là gen trội (Xa) hay gen lặn (xa) ñều có ý nghĩa ñối với việc chọn

giống Nhóm gen lặn chỉ biểu hiện ñược khả năng kháng khi ở dạng ñồng hợp

tử nên nhóm này chỉ có ý nghĩa trong chọn giống lúa thuần, còn nhóm gen trội có ý nghĩa ñối với cả trong giống lúa lai và giống lúa thuần

Tính kháng bệnh bạc lá tuân theo hiệu ứng gen ñối gen: alen kháng của

ký chủ chỉ hoạt ñộng khi ký sinh mang alen không gây bệnh (Flor, 1971) [6] Theo ñó, sản phẩm của gen kháng có thể phát hiện hoặc phản ứng với các tín

hiệu ñược mã hóa bởi gen gây bệnh (avr) ký sinh ðiều này giải thích vì sao

những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này lại bị nhiễm bệnh nặng ở vùng khác Các dòng ñẳng gen mang gen kháng ñã ñược thiết kế, tạo ñiều kiện ñể dễ dàng tiến hành nhận biết chủng vi khuẩn và thống kê gen kháng trên các giống lúa, trong mọi ñiều kiện Mặt khác, dựa trên các nòi vi khuẩn

ñã ñược xác ñịnh, người ta có thể thống kê các gen kháng của một giống hoặc

xác ñịnh một gen kháng mới chưa ñược biết tới (Ogawa và cộng sự 1991; Ogawa 1993) (dẫn theo Nelson và cộng sự, 1996)[35]

Theo các kết quả quan sát của K.S Lee thì kể từ khi các giống mang gen kháng Xa4 ñầu tiên ñược sử dụng tại Philippin cho ñến nay ñã phát hiện khá nhiều chủng vi khuẩn có biểu hiện kháng với gen Xa4 Như vậy sự ra ñời của các giống lúa kháng bệnh kéo theo sự tiến hoá của các chủng vi khuẩn, làm giảm tính bền vững của gen kháng Chiến lược nhằm kéo dài thời gian kháng bền vững của gen kháng là vô cùng quan trọng trong việc chọn giống kháng bệnh bạc lá

Tika và Mew nghiên cứu về khả năng kháng bệnh trên 11 dòng ñẳng gen mang 1,2,3 hoặc 4 gen kháng bằng cách lây nhiễm nhân tạo với 50 chủng

vi khuẩn thu thập tại Nepal Kết quả cho thấy các dòng nào mang nhiều gen kháng sẽ biểu hiện bị nhiễm nhẹ hơn hẳn so với dòng chỉ mang một gen

kháng (Tika B Adhikari, Ram Chandra Basnyat, T W Mew,1999) [48]

ðiều này chứng tỏ việc tổ hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giống chính là chiến lược ñể khả năng kháng của giống và tăng ñộ bền của gen kháng

2.2.3 Các phương pháp chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá

Phương pháp chọn giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất cho ñến nay là phương pháp lai hữu tính Phương pháp này tiến hành lai giữa các giống có chứa gen kháng, sau ñó chọn lọc các thế hệ phân li Bằng phương pháp này nhiều giống kháng bệnh ñã ñược tạo ra Khả năng kháng bạc lá thường do ñơn gen quy ñịnh, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại

ñể chuyển gen kháng là rất hiệu quả Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết ñể lai lại với một giống mang gen kháng hữu hiệu Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới ñược tạo thành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây

lai lại và mang thêm ñược gen kháng mong muốn Trong quá trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly ñể ñẩy nhanh quá trình tạo dòng thuần

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo ñược sử dụng ñể xác ñịnh con lai có mang gen kháng hay không Nhưng bằng phương pháp này ñôi khi khó phân biệt ñược các gen kháng khác nhau, nếu chúng cùng biểu hiện một phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương tự ðể khắc phục nhược ñiểm này, hiện nay phương pháp dùng chỉ thị phân tử, dựa trên các trình tự DNA liên kết chặt với gen kháng, ñược sử dụng nhằm xác ñịnh các gen kháng dễ dàng và hiệu quả hơn

Phương pháp lai và kết hợp chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng rộng rãi trong lai tạo các giống lúa kháng bệnh bạc lá và thu ñược nhiều thành công ñáng kể Năm 2001, S.Singh và cộng sự ñã áp dụng thành công phương pháp

lai ñể tập hợp 3 gen kháng xa5, Xa7 và Xa21 vào giống lúa PR106 (một giống

lúa phổ biến ở bang Punjab, Ấn ðộ) với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử Các dòng của PR106 ñã ñược tiến hành trồng thử nghiệm và thử khả năng kháng với bệnh bạc lá Kết quả các dòng chứa 3 gen kháng trên có khả năng kháng ñược toàn bộ 17 chủng Xoo tại Punjab và thêm 6 chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ Phillipin [43] Năm 2000, A.C Sachez và cộng sự cũng ñã chuyển

thành công 3 gen kháng xa5, xa13, Xa21 vào các dòng lúa có kiểu cây mới

IR65598-112, IR65600-42, IR65600-96 bằng phương pháp lai backcross Trong quá trình lai chuyển gen Sanchez cũng sử dụng các chỉ thị phân tử ñể

giúp phát hiện gen ñược chuyển (RG556, RG207 cho xa5, RG136 cho xa13),

ñộ chính xác của chỉ thị lên ñến 95% [12]

Ngoài phương pháp chuyển gen kháng bệnh bạc lá bằng lai hữu tính, hiện nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi và lai tế bào trần Bằng phương pháp cứu phôi, Amide-Border và

Cộng sự (1992) ñã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (dẫn theo

K.S.Lee và cộng sự) Bằng cách lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae sativa L với nguồn cho gen kháng là lúa dại Oryzae meyeriana, Cheng-qui Yan và

cộng sự tiến hành thành công việc tạo dòng tế bào mang gen kháng bạc lá Kết quả thu ñược 29 dòng cây lai xoma, hình thái biểu hiện giống cả hai bên

bố mẹ và trong ñó có 2 dòng biểu hiện tính kháng cao, 8 dòng biểu hiện tính kháng vừa (Cheng - qui Yan và cộng sự, 2004)[18]

2.2.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá

Sự phát triển của công nghệ sinh học, ñặc biệt là công nghệ gen ñã mang ñến những bước tiếng ñáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng

bệnh bạc lá Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv Oyzae có thể ñược xác ñịnh nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử Adachi và T Oku (2000)

ñề xuất sử dụng 2 ñoạn mồi XOR-F và XOR-R2 ñể nhân ñoạn ADN, ñoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005) [10]

Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng ñược áp dụng tành công trong việc xác ñánh giá sự ña dạng hay xác ñịnh chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009) [21]

Ngày nay, ñã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng ñược lập bản ñồ liên kết với các ñoạn ADN genome, ñặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây lương thực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cộng sự, 1995; Miklas và cộng sự, 1996 ) (dẫn theo A.C.Sanchez) [12] Dựa trên bản

ñồ này, chỉ thị phân tử xác ñịnh gen kháng bạc lá ñã ñược xây dựng Kỹ thuật

này ngày càng ñược sử dụng phổ biến bởi tính khả thi, tính hiệu quả và tính kinh tế Chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng thành công trong việc xác ñịnh gen kháng (Nelson và cộng sự, 1996) [34], trong việc tổ hợp nhiều gen kháng ñể tạo thành giống chứa ña gen kháng (Huang và cộng sự, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995)

Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống

Từ năm 1997-2004, Viện lúa ñồng bằng sông Cửu Long ñã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong ñánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa ñịa phương thu thập ñược ở duyên hải Trung bộ và ñồng bằng sông Cửu

Long Kết quả ñã thu ñược 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4,

4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14 Kiểm

tra ñộ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen

kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer ñối với gen xa5 cho thấy ñộ chính

xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004) [1] Bùi Chí Bửu

và Cộng sự cũng ñã sử dụng chỉ thị phân tử ñể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của

IR24 với giống lúa ñịa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với ñộ chính

xácccao[36]

Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử ñã ñược ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu

về bệnh bạc lá của trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và cộng sự ñã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng Nhóm nghiên cứu ñã sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn ñể tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở

miền Bắc ðồng thời, ñể phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng ñẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Cho ñến

nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 ñã ñược xác ñịnh là các gen kháng hầu hết các

chủng vi khuẩn Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng ñược tiến hành ñánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn ở Việt Nam [9]

Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa ñịa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu ñã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở ñiều tra 145 giống lúa ñịa phương ñã phát

hiện ñược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7 Năm 2004, trên

cơ sở tiếp tục ñiều tra 120 giống ñịa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát

hiện ñược thêm 8 giống lúa ñịa phương chứa gen xa5 Các kết quả nghiên cứu

trên ñều nhằm mục ñích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam[3],[4]

ðến nay, bước ñầu có thể khẳng ñịnh các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,

xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa ñịa phương ở

Việt Nam Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan

trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng ñược hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta Nhưng trong số các gen

kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn

xa5 Hiện chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện ñược gen Xa21 trên các giống lúa trồng Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác ñịnh gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan

Phần thứ ba

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Nội dung nghiên cứu

- đánh giá các chỉ tiêu chất lượng gạo quan trọng

- đánh giá khả năng kháng và mang gen kháng bệnh bạc lá

- đánh giá năng suất và một số tắnh trạng nông sinh học quan trọng khác

- Tuyển chọn các mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và

có tiềm năng năng suất cao

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- 124 mẫu giống lúa ựược thu thập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, đại học Nông nghiệp Hà Nội (Kắ hiệu, tên, nguồn gốc các

mẫu giống ựược trình bày chi tiết tại Phụ lục 1)

- Các dòng ựẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau, gồm dòng nhiễm chuẩn: IR24, các dòng mang gen kháng chuẩn IRBB

- 7 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ựang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam, ựược phân lập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng

- Các loại hóa chất và dụng cụ dùng trong thắ nghiệm PCR

3.3 Các ựiều kiện phục vụ nghiên cứu

3.3.1 Thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu

- Nghiên cứu ựược tiến hành vào vụ mùa 2008 và vụ xuân 2009

- Các thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng ựược bố trắ tại ruộng thắ nghiệm của

Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng

- Các thắ nghiệm trong phòng ựược thực hiện tại phòng thắ nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng

3.3.2 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm ngoài ựồng ruộng

- Thắ nghiệm khảo sát ựược bố trắ theo kiểu thắ nghiệm một yếu tố tuần

- Phòng trừ sâu bệnh: theo dõi tình hình sâu bệnh hại và áp dụng các biện pháp phòng trừ theo phương pháp phòng trừ sâu bệnh hại tổng hợp (IPM)

3.4 Thắ nghiệm ựánh giá chất lượng

3.4.1 đánh giá mùi thơm và kiểm tra gen mùi thơm

3.4.1.1 đánh giá mùi thơm

Mùi thơm của các mẫu giống ựược ựánh giá trên cả mẫu lá và bột gạo theo phương pháp của IRRI, 2000 như sau:

- Mùi thơm trên lá ựược ựánh giá bằng cách thu 1g lá trong giai ựoạn ựẻ nhánh, cắt nhỏ trộn với 5ml KOH 1,7%, giữ ở nhiệt ựộ phòng trong 1 tiếng, sau ựó cho 5 người ngửi và chấm ựiểm theo 3 mức: 3:thơm, 2:hơi thơm, 1:không thơm

Mùi thơm của gạo ựược ựánh giá bằng phương pháp sử dụng KOH 1,7% như sau: 1g bột gạo ựược trộn với 1ml KOH 1,7%, giữ ở nhiệt ựộ phòng trong

20 phút Sau ñó, mẫu ñược ñánh giá bằng cách ngửi bởi 5 người và cho ñiểm theo 3 mức: 3:thơm, 2:hơi thơm, 1:không thơm

3.4.1.2 Kiểm tra gen mùi thơm bằng PCR

* Tách chiết DNA

Quy trình tách chiết DNA theo quy trình của Zheng và cộng sự (1995)

ñã ñược cải tiến như sau:

- Thành phần dung dịch dùng tách chiết DNA gồm có: Tris-HCl 50mM (pH=8), EDTA 25mM (pH=8), NaCl 300m M, SDS 1%, nước cất vô trùng

- Cách tiến hành : 2cm mẫu lá khoẻ thu vào buổi sáng ñược nghiền với 400µl dung dịch chiết cho ñến khi dịch chiết chuyển sang màu xanh ñen Sau

ñó, 400µl dịch chiết ñược thêm vào và trộn ñều 400µl hỗn hợp ñược hút sang một ống nghiệm khác

700µl phenol: chloroform: isoamylacohol (25:24:1) ñược thêm vào ống nghiệm Hỗn hợp sau ñó ñược trộn ñều và li tâm 5 phút với tốc ñộ 13000 vòng ở 4˚C

Phần dung dịch phía trên ñược chuyển sang ống mới, thêm vào 600µl dung dịch Chloroform: Isoamylancohol (24:1) Hỗn hợp ñược li trong 5 phút với tốc ñộ 130000 vòng ở nhiệt ñộ 40C

Phần dung dịch phía trên tiếp tục ñược chuyển sang ống mới ñã ñánh dấu tên giống, rồi thêm 800µl ethanol, ly tâm 5 phút, với vận tốc 13000 vòng

ở nhiệt ñộ 4 0C, ñể kết tủa DNA

Phần DNA kết tủa dưới ñấy ống ñược giữ lại và ñể khô tự nhiên bằng cách úp ngược ống nghiệm trên giấy thấm

DNA ñược hòa tan trong 50 ml TE, bảo quản ở -20˚C

* Tiến hành phản ứng PCR

- PCR sử dụng cặp mồi theo nghiên cứu của Bradbury và cộng sự [42]

có trình tự như sau:

ESP 5Ơ-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG -3Ỗ

IFAP 5Ơ-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3

- 25 ộl dung dịch phản ứng gồm có: 14.1 ộl nước cất, 0.2 ộl Taq DNA

Polymerase, 2.5 ộl 10X buffer, 2 ộl 50 mM MgCl2 , 0.2 ộl dNTPs 25 mM, 2.5 ộl mỗi primer, 1 ộl DNA nguyên bản

- PCR ựược thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: 94ỨC trong 2 phút, 34 chu kỳ: 94ỨC trong 30 giây, 58ỨC trong 30 giây, 72Ứ trong 30 giây, và 72 Ứ C trong 5 phút

- Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên gel agarose 1% Bản gel ựược nhuộm

bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV

3.4.2 đánh giá hàm lượng amylose và kiểm tra gen quy ựịnh hàm lượng amylose thấp

3.4.2.1 Xác ựịnh hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose ựược phân tắch theo phương pháp của Juliano (dẫn theo N Dela Cruz và G.S Khush,2000) [33] như sau: 100mg bột gạo ựược trộn với 1ml ethanol 95% và 9ml NaOH 1N, ựun cách thủy hỗn hợp trong nước sôi ựến hóa gel Hỗn hợp ựược ựể nguội trong 1 giờ rồi lên thể tắch bằng nước cất ựến 100ml Sau ựó, 5ml dung dịch ựược chuyển sang bình khác, thêm vào 1ml acetic acid và 2ml iodine solution, lên thể tắch ựến 100ml, trộn ựều và ủ ở nhiệt ựộ 36ỨC trong 20 phút Sau khi ủ, dung dịch ựược ựo mật ựộ quang ở bước sóng 620mu

Hàm lượng amylose của các mẫu giống ựược ựược ựánh giá theo thang ựiểm của IRRI, 2002 như sau:

Hàm lượng amylose (%) Xếp loại

3.4.2.2 Quy trình PCR kiểm tra gen quy ựịnh hàm lượng amylose thấp

- DNA ựược tách chiết theo quy trình do Zheng và cộng sự (1995) ựề

xuất tương tự như Phần 3.4.1.2

- Cặp mồi PCR Wx-AccI ựược thiết kế dựa trên nghiên cứu của Cai và cộng sự, 2002 [16] có trình tự như sau:

Wx-R 5Ỗ ATG ATT TAA CGA GAG TTG AA 3Ỗ

Wx-F 5Ỗ ACC AT CC TCA GTT CTT TG 3Ỗ

- 25 ộl phản ứng PCR gồm có: 14.1 ộl nước cất, 0.2 ộl Taq DNA

Polymerase, 2.5 ộl 10X buffer, 2 ộl 50 mM MgCl2 , 0.2 ộl dNTPs 25 mM, 2.5 ộl mỗi primer, 1 ộl DNA nguyên bản

- Chu kỳ nhiệt PCR: 95ỨC trong 3 phút, 34 chu kỳ: 94ỨC trong 45 giây, 58ỨC trong 45 giây, 72Ứ trong 30 giây, và 72Ứ C trong 10 phút

- Sản phẩm PCR ựược cắt bằng enzyme AccI 15ộl phản ứng gồm có 5ộl sản phẩm PCR, 0,25ộl enzyme AccI 10unit/ ộl, 1,5ộ buffer B, 8ộl nước hỗn

hợp ựược ủ ở 37ỨC trong 2,5h

- Sản phẩm PCR ựiện di trên gel agarose 2% Bản gel ựược nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh dưới tia UV

3.4.3 đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng thương trường

Các chỉ tiêu ựều ựược ựánh giá và cho ựiểm theo thang ựiểm của IRRI,

2002

- Kắch thước hạt ựược phân loại theo bảng sau:

Kắch thước Chiều dài (mm) Thang ựiểm Hình dạng dài/rộng Tỷ lệ Thang ựiểm

- Màu của vỏ cám ựược quan sát và chia thành các mức: trắng, nâu sáng, nâu tối, nâu, ựỏ, tắm sáng và tắm

- độ bạc ựược ựánh giá bằng cách cắt ngang hạt gạo, quan sát và tắnh ựiểm theo thang ựiểm chia theo diện tắch vết bạc như sau:

3.4.4 đánh giá chất lượng xay xát

Tỷ lệ gạo lật và tỷ lệ gạo xát trắng ựược ựánh giá bằng cách lấy 125g thóc ựem xay và xát trắng, cân trọng lượng của gạo lật và gạo xát trắng thu ựược Tỷ lệ gạo lật, gạo xát trắng ựược tắnh theo công thức sau:

Khối lượng gạo lật

3.4.5 đánh giá chất lượng nấu nướng

- độ bền gel: độ bền gel ựược ựánh giá bằng phương pháp của Cagampang và cộng sự [33] có quy trình như sau:

100 g bột gạo ựược cho vào một ống nghiệm có kắch thước 13x100mm Thêm vào ống 0,2ml ethyl alcohol 95% có chứa 0.025% thymol blue và 2ml KOH 0,2N Hỗn hợp ựược trộn bằng máy Vortex ở tốc ựộ 6 Hỗn hợp ựược ựun cách thủy trong 8 phút ựể hóa keo, ựược ựể nguội ở nhiệt ựộ phòng trong

5 phút và ngâm nước ựá lạnh trong 20 phút Sau ựó, ống nghiệm ựược ựể nằm

ngang trong một giờ ðộ bền gel của các mẫu giống ñược ñánh giá bằng cách

ño ñộ dài của gel chảy trong ống và cho ñiểm theo thang ñiểm như sau:

Chiều dài gel Thang ñiểm ðộ bền gel

ðộ phá hủy kiềm và nhiệt ñộ hóa hồ của các mẫu giống ñược quan sát

và ñánh giá theo thang ñiểm như sau:

Thang

ñiểm

huỷ kiềm Nhiệt ñộ hoá hồ

2 Hạt gạo phồng lên Gạo trắng bột, có viền

3 Hạt gạo phồng lên, viền còn

nguyên hay rõ nét

Hạt trắng bột, viền nhoè như bông gòn, vẩn ñục Thấp - TB Cao - TB

4 Hạt gạo phồng lên, viền còn

7 Hoà tan ra hoàn toàn và